Polymorfizmus v promotorové oblasti genu pro MMP-2 u revmatoidní artritidy

Overview

Úvod:
Matrix metaloproteinázy (MMP), které náleží do rodiny zinkdependentních endopetidáz, se účastní remodelace extracelulární matrix v řadě fyziologických a patologických dějů, včetně revmatoidní artritidy (RA). Revmatoidní artritida je chronické autoimunitní, zánětlivé, multisystémové onemocnění charakterizované mimo jiné degradací hyalinní kloubní chrupavky a vystupňovanou angiogenezou. Tyto procesy mohou být ovlivňovány MMP. Na druhou stranu mohou MMP potlačovat zánět degradací biologicky aktivních molekul, jako jsou cytokiny, chemokiny či receptory růstových faktorů. V séru a synoviální tekutině pacientů s RA jsou prokazovány zvýšené hladiny MMP-2 (gelatináza A). Polymorfizmus genu pro MMP-2 může ovlivňovat vnímavost ke vzniku a/nebo závažnost průběhu RA.

Metoda:
Cílem studie bylo prokázat možný vztah mezi polymorfizmy v promotorové oblasti genu pro MMP-2 (-1575 G/A, -1306 C/T, -790 T/G, -735 C/T) a RA. Do studie bylo zařazeno celkem 101 pacientů s RA, kteří splnili revidovaná diagnostická kritéria ACR, 1987 pro RA, s délkou trvání choroby minimálně 2 roky, a 101 zdravých dobrovolníků obdobné distribuce věku a pohlaví.

Výsledky:
Nebyl zjištěn rozdíl v genotypových distribucích ani frekvencích alel polymorfizmů -1575A/G, -1306C/T a -735 C/T mezi pacienty s RA a kontrolní skupinou. Statisticky významný rozdíl byl pozorován mezi pacienty s RA a kontrolní skupinou v alelických frekvencích polymorfizmu -790 T/G MMP-2 (T alela -0,70 vs 0,66, Pa = 0,013). Rovněž byla pozorována tendence k nárůstu genotypu GG u pacientů s RA (Pg = 0,053). Statisticky významný rozdíl v alelických frekvencích byl rovněž pozorován mezi muži s RA a muži v kontrolní skupině (T alela -0,80 vs 0,61, Pa = 0,025). Navíc haplotyp GCGC polymorfizmů -1575 G/A, -1306 C/T, -790 T/G, -735 C/T byl častější u pacientů s RA (Pcorr = 0,016; OR = 0,09; konfidenční interval 0,00-0,65), zatímco haplotyp GCTC byl více zastoupen u kontrolní skupiny (Pcorr = 0,017; OR = 1,8; konfidenční interval 1,17-2,70).

Závěr:
Výsledky poukazují na možnou asociaci polymorfizmu v promotorové oblasti genu pro MMP-2 s vnímavostí ke vzniku RA.

Klíčová slova:
revmatoidní artritida - gen - polymorfizmus - MMP-2

Úvod

Revmatoidní artritida (RA) je chronické systémové zánětlivé autoimunitní onemocnění. Vyskytuje se celosvětově s prevalencí 0,5-2 % s jistými regionálními rozdíly. Nižší prevalence RA je v oblasti subsaharské Afriky a jihovýchodní Asie. Naopak vysoký výskyt RA byl zaznamenán u příslušníků indiánských kmenů Pima (5 %) a Chipewa (7 %) [1]. V České republice se prevalence pohybuje kolem 1 %. Incidence RA je udávána mezi 1-2/10 000 u mužů a 2-4/10 000 u žen [2]. RA postihuje všechny věkové skupiny s maximálním výskytem u premenopauzálních žen. U svých nositelů vede revmatoidní artritida dříve nebo později k disabilitě [2].

Iniciálními symptomy onemocnění jsou kloubní bolest a otok, provázený kloubní ztuhlostí a ve většině případů i celkovou reakcí organizmu. Místem patologického zánětlivého děje je synoviální výstelka v kloubech, burzách a šlachách [3]. Chronický zánět vede k tvorbě granulační zánětlivé tkáně (pannus) tvořené řadou imunokompetentních buněk (monocyty, dendritickými buňkami, synoviálními fibroblasty - FLS, T-lymfocyty, mastocyty a B-lymfocyty). Chronická synovitida způsobuje destrukci hyalinní chrupavky, eroze subchondrální kosti a v konečné fázi deformity postižených kloubů. Destrukce hyalinní chrupavky je mediována proteinázami, schopnými degradovat komponenty extracelulární matrix (ECM) chrupavky tvořenou zejména kolagenem typu II a makromolekulárními proteoglykanovými komplexy agrekanu. V patogenezi RA se uplatňují jednak matrixové metaloproteinázy (MMP) a dále, jak se ukazuje v poslední době, skupina tzv. disintegrin metaloproteináz (ADAM) [4]. Tyto skupiny proteináz jsou produkovány především synoviálními výstelkovými buňkami, stromálními buňkami v subintimální zóně synoviální membrány, neutrofily, synoviálními fibroblasty, chondrocyty a makrofágy [5-13]. V synoviální tekutině pacientů s RA jsou prokazovány signifikantně vyšší hladiny některých MMP (MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP-9, MMP-13) ve srovnání s pacienty s osteoartrózou (OA) [9,14-20]. Jiných mechanizmem degradace hyalinní chrupavky je apoptóza chondrocytů mediovaná oxidem dusnatým (NO) [4].

MMP patřící do rodiny zinkdependentních endopeptidáz se účastní remodelace ECM během řady fyziologických i patologických dějů včetně RA [21]. Jak bylo popsáno výše, MMP se mohou v patogenezi RA účastnit procesu degradace hyalinní chrupavky a zasahují i do procesu vystupňované angiogeneze. Na druhou stranu mohou MMP potlačovat zánět degradací biologicky aktivních molekul, jako jsou cytokiny, chemokiny či receptory růstových faktorů [22-26]. V séru a synoviální tekutině pacientů s RA jsou prokazovány mimo jiné zvýšené hladiny MMP-2 (gelatináza A) [20]. Předpokládá se, že hlavní rolí MMP-2 u RA může být zejména degradace zánětlivých faktorů a/nebo aktivace faktorů protizánětlivých [22].

RA je, co se týče věku vzniku prvních obtíží, spektra klinických projevů a stupně progrese onemocnění, značně heterogenní. Za klinickou heterogenitu může na jedné straně odpovídat genetická predispozice a na druhé straně i faktory zevního prostředí (viry, bakterie, stres, toxiny). Genetickou predispozici potvrzují poznatky získané ze studií dvojčat, kde se konkordance u monozygotních dvojčat pohybuje mezi 10-15 % a u dizygotních dvojčat 3,6 % [27]. Z výsledků celonárodní finské studie dvojčat vyplývá, že se dá očekávat až 65% podíl genetické determinace na vznik a vývoj RA bez vlivu faktorů, jako je pohlaví, věk, věk při vzniku choroby nebo aktivita RA [28].

Významný podíl genetické determinace RA připadá na geny hlavního histokompatibilního komplexu (u člověka HLA) [29]. Velikost příspěvku HLA genů k celkové genetické predispozici je odhadována na 30-50 % [30,31]. Bylo zjištěno, že genetická predispozice k RA je vázána na ty alely, které nesou stejný sekvenční motiv 5 aminokyselin (QKRAA/QRRAA) na pozicích 70-74 ve třetí hypervariabilní oblasti DRB1 (řetezec β) molekuly [32]. Tento úsek je označován jako tzv. sdílený epitop (shared epitope, SE). SE kódují následující alely (HLA-DRB1^*0401, 0404, 0405, 0408, 0409, 0410 (HLA-DR4), HLA-DRB1^*0101, 0102 (HLA-DR1), HLA-DRB1^*1001 (HLA-DR 10) a HLA-DRB1^*1402 (HLA-DR6) [33]. Alely kódující zmíněný motiv se vyskytují u více než 70 % pacientů s RA [34]. Pacienti s RA nesoucí SE mohou mít vyšší aktivitu a závažnější průběh choroby [35].

Předpokládá se však, že mimo HLA lokus existuje řada kandidátních genů majících vztah k RA [36]. Yamada et al analyzovali genom 48 pacientů s RA v rozsahu přibližně 104 Kb. Detekovali celkem 163 polymorfizmů 41 kandidátních genů asociovaných s RA. U 142 těchto polymorfizmů se jednalo o jednonukleotidové záměny (SNP), které se řadí k nejčastější formě variability genetické informace. Předpokládá se existence jedné SNP na zhruba 200-300 bází [37].

Jedním ze studovaných kandidátních genů byl i gen pro MMP-2. Gen pro MMP-2 je lokalizován na 16. chromozomu, v místě 16q13 - q21. Jeho délka je 17 kb, obsahuje 13 exonů (110 až 901 bp) a 12 intronů (175 až 4350 bp). Doposud bylo identifikováno 6 polymorfizmů v promotorové oblasti genu pro MMP-2, 1 v 5´ nepřekládané oblasti, 6 v kódující oblasti, 1 v sekvenci intronu a 10 v 3´ nepřekládané oblasti. V naší laboratoři byl identifikován polymorfizmus -735 C/T. Polymorfizmy genu pro MMP-2 by mohly ovlivňovat vnímavost ke vzniku a/nebo závažnost průběhu RA. Cílem naší studie bylo prokázat možný vztah mezi sledovanými polymorfizmy v promotorové oblasti genu pro MMP-2 (-1575 G/A, -1306 C/T, -790 T/G, -735 C/T) a RA.

Metoda

Pacienti

Do studie bylo zařazeno celkem 101 pacientů s revmatoidní artritidou (RA), kteří byli vyšetření v průběhu roku 2004 v revmatologické ambulanci II. interní kliniky LF MU a FN u sv. Anny v Brně. Všichni pacienti splnili revidovaná kritéria American College of Rheumatology pro revmatoidní artritidu. Soubor zahrnoval 80 žen a 21 mužů věkového rozpětí 25-80 roků. Medián věku byl 54 roků. Minimální délka trvání choroby byla 2 roky. Kontrolní soubor zahrnoval 101 zdravých dobrovolníků obdobné distribuce věku (věkové rozpětí 23-86 roků, medián věku byl 51 roků) bez klinických a laboratorních známek revmatoidní artritidy. Studie byla schválena Etickou komisí FN u sv. Anny v Brně a LF MU v Brně. Zařazení jedince do projektu bylo podmíněno podpisem informovaného souhlasu a studie probíhala v souladu s Helsinskou deklarací schválenou na zasedání WMA v Edinburgu.

Detekce polymorfizmů MMP-2 (-1575 G/A, -1306 C/T, -790 T/G, -735 C/T)

Pacientům i kontrolám byla odebrána periferní krev a z ní izolována DNA z leukocytů pomocí metody s využitím proteinázy K. Izolace DNA spočívala v lýze buněk v roztoku, který obsahuje 10 mM Tris - HCl (pH = 8,5), 0,1% SDS, 0,1 mg/ml proteinázy K. Proteináza K byla odtraněna extrakcí fenolem a po etanolové precipitaci a vysušení byl vzorek DNA rozpuštěn v TE pufru. Polymorfizmy v promotorové oblasti genu pro MMP-2 (-1575 G/A, -1306 C/T, -790 T/G a -735 C/T) byly detekovány pomocí PCR (polymerase chain reaction) a restrikční analýzy (RFLP - restriction fragment length polymorphism). Polymorfizmus -1575 G/A byl detekován pomocí PCR s produktem o velikosti 269 bp. Po restrikční analýze enzymem NmuCI (MBI Fermentas, USA) při 37 °C přes noc, nanesení na 2% agarózu (Serva) s ethydium bromidem a prosvícení v UV světle pak byly rozlišeny tři genotypy: GG (113 a 156 bp), GA (113,156 a 269 bp) a AA (269 bp). Polymorfizmus -1306 C/T byl detekován pomocí PCR s produktem o velikosti 193 bp. Po restrikční analýze enzymem FspBI (MBI Fermentas, USA) při 37 °C přes noc byly rozlišeny tři genotypy: CC (188 bp), CT (188, 162 a 26 bp) a TT (162, 26 bp). Polymorfizmus -790 T/G byl detekován pomocí PCR s produktem o velikosti 118 bp. Po restrikční analýze enzymem PvuI (MBI Fermentas, USA) přes noc, nanesením na 3% agarózu Metaphor byly rozlišeny tři genoty: TT (118 bp), GT (118,19 a 99 bp) a GG (19 a 99bp). Čtvrtý polymorfizmus -735 C/T byl detekován pomocí PCR s produktem o velikosti 300 bp. Po restrikční analýze enzymem HinfI (MBI Fermentas, USA) přes noc a gelové elektroforéze mohly být odečteny 3 genotypy: CC (300 bp), CT (300,254 a 46 bp) a TT (254 a 46 bp).

Statistická analýza

Genotypové distribuce byly kalkulovány χ² testem. Statistická významnost rozdílů v alelických frekvencích mezi skupinami byla testována Fisherovým přesným testem. Shoda zastoupení jednotlivých variant polymorfizmu s Hardy-Weinbergerovou rovnováhou byla vypočtena χ² testem. Haplotypové frekvence byly kalkulovány po rekonstrukci haplotypů z populačních dat dle Stephense et al (2001) a Stephense a Donella (2003). Statistická významnost byla testována Fisherovým přesným testem a síla testu (chyba druhého řádu) byla počítána pomocí programu EpiInfo6. Za signifikantní byla považována hladina 5 %.

Výsledky

Nebyl zjištěn rozdíl v genotypových distribucích ani frekvencích alel polymorfizmů -1575A/G, -1306C/T a -735 C/T mezi pacienty s RA a kontrolní skupinou (tab. 1).

Statisticky významný rozdíl byl pozorován mezi pacienty s RA a kontrolní skupinou v alelických frekvencích polymorfizmu -790 T/G MMP-2 (T alela -0,70 vs 0,66, Pa = 0,013) (graf 1). Rovněž byl pozorován trend k nárůstu výskytu genotypu GG u pacientů s RA (Pg = 0,053) (graf 2). Statisticky významný rozdíl v alelických frekvencích byl rovněž pozorován mezi muži s RA a muži v kontrolní skupině (T alela -0,80 vs 0,61, Pa = 0,025).

Navíc haplotyp GCGC polymorfizmů -1575 G/A, -1306 C/T, -790 T/G, -735 C/T byl častěji zastoupen u pacientů s RA (P corr = 0,016;OR = 0,09; konfidenční interval 0,00-0,65), zatímco haplotyp GCTC byl více zastoupen u kontrolní skupiny (Pcorr = 0,017; OR = 1,8; konfidenční interval 1,17-2,70) (graf 3).

Diskuse

Rodina MMP zahrnuje minimálně 18 členů, kteří jsou rozděleni do 5 podskupin: (a) kolagenázy, zahrnující kolagenázu 1 (MMP-1), kolagenázu 2 (MMP-8) a kolagenázu 3 (MMP-13); (b) gelatinázy, gelatinázu A (MMP-2) a gelatinázu B (MMP-9); (c) stromelysiny, zahrnující stromelysin 1 (MMP-3), stromelysin 2 (MMP-10), stromelysin 3 (MMP-11); (d) membranový typ MMP (MT-MMP), zahrnující MT1-MMP (MMP-14), MT2-MMP (MMP-15), MT3-MMP (MMP-16), MT4-MMP (MMP-17) a MT5-MMP (MMP-24); (e) ostatní MMP, jako jsou matrilysin (MMP-7), stromelysin 3 (MMP-11), metaloelastáza (MMP-12), MMP-19, enamelysin (MMP-20) a MMP-23 [20,38-45]. Enzymatická aktivita těchto MMP je kontrolována specifickými tkáňovými inhibitory metaloproteináz (TIMP) (TIMP-1, TIMP-2, TIMP-3 a TIMP-4) [46,47,48]. Rovnováha mezi MMP a TIMP přítomnými v synoviální tkáni a synoviální tekutině může ovlivňovat míru degradace ECM. MMP-1 a MMP-3 jsou produkovány zejména synoviálními výstelkovými buňkami u pacientů s RA, zatím co MMP-2 je produkována stromálními buňkami subintimální zóny synoviální výstelky [5-7]. MMP-8 a MMP-9 jsou produkovány neutrofily a MMP-9 je navíc produkována makrofágy a rovněž synoviálními buňkami [8,9]. U pacientů s RA byla rovněž prokázána exprese těchto MMP chondrocyty a fibroblasty [10-13]. Různými skupinami jsou prokazovány signifikantně vyšší hladiny některých MMP (MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP-9, MMP-13) a TIMP-1 v synoviální tekutině pacientů s RA ve srovnání s nálezy u pacientů s OA nebo s traumatickým postižením kolenního kloubu [9,14-19].

MMP-2 patří spolu s MMP-9 do podskupiny gelatináz schopných štěpení základních komponent ECM hyalinní chrupavky (kolagenu typu I a agrekanu). V synoviální tekutině pacientů s RA jsou prokazovány zvýšené hladiny MMP-2 a MMP-9 [9,20,49]. Práce Itoha et al poukazuje na poněkud kontroverzní roli gelatináz v patogenezi RA [22]. Autoři sledovali vývoj protilátkami indukované artritidy (AbIA) jednoho ze zvířecích modelů RA, u MMP-2 knockout (KO) myší a MMP-9 KO myší. Překvapivým zjištěním bylo, že MMP-2 KO myši vyvinuly těžší histologický i klinický obraz artritidy než myši normální a naopak MMP-9 KO myši vyvinuly mírnější formu artritidy než myši normální. Zmírnění příznaků artritidy u MMP-2 KO myší bylo dosaženo injekcí normálních fibroblastů, schopných produkovat MMP-2 in vitro. Autoři tedy prokázali fakt, že zhoršení průběhu AbIA u MMP-2 KO myší souvisí s deficitem MMP-2. V poslední době je prokazována řada nových cílových substrátů pro MMP-2, jako jsou cytokiny (interleukin 1 β), chemokiny (monocyte chemoattractant-3) nebo receptor 1 růstového faktoru fibroblastů [23-25]. Protichůdné role MMP-2 a MMP-9 mohou být dány rozdílným spektrem substrátů [24,25].

Výsledky naší studie poukazují na možnou asociaci polymorfizmu v promotorové oblasti genu pro MMP-2 s vnímavostí ke vzniku RA. Pokud je nám známo, jedná se o první práci prokazující asociaci polymorfizmu -790 T/G MMP-2 s rizikem vývoje RA. Náš nález je navíc podpořen častějším zastoupením „rizikového“ haplotypu GCGC polymorfizmů -1575 G/A, -1306 C/T, -790 T/G, -735 C/T genu pro MMP-2 u pacientů s RA a naopak častějším zastoupením haplotypu GCTC u zdravých kontrol.

Některé práce se již zabývaly asociací polymorfizmů genů jiných MMP a RA. V práci Dörra et al nebyla prokázána asociace mezi vnímavostí ke vzniku RA a polymorfizmem 1G/2G (delece/inzerce guaninu na pozici -1607) v promotorové oblasti genu pro MMP-1 a polymorfizmem 5A/6A (delece/inzerce adeninu na pozici -1171) v promotorové oblasti genu pro MMP-3 [50]. Stupeň radiografické progrese RA koreloval signifikantně s haplotypem 1G-5A. Haplotyp 1G-5A měl „protektivní“ efekt na radiografickou progresi RA. Homozygoti 2G/2G genu pro MMP-1 vykazovali během sledovaného období výraznější radiografickou progresi RA ve srovnání s homozygoty 1G/1G. Jiná práce tuto asociaci neprokázala [51]. Studie zabývající se asociací polymorfizmu MMP-3 přinesly rovněž kontroverzní výsledky [52]. Autoři neprokázali asociaci polymorfizmu 5A/6A s vnímavostí ke vzniku RA, ale naopak prokázali, že genotyp 6A/6A MMP-3 je asociovaný s výraznější RTG-progresí choroby v úvodu i na konci 4letého sledovacího období. Pacienti homozygoti 6A/6A pro MMP-3 a pro DRB1 SE měli výraznější RTG-progresi choroby.

Získané výsledky naší práce bude nutné ověřit na větším souboru pacientů s RA. Plánujeme studovat možnou asociaci mezi promotorovými polymorfizmy MMP-2 a závažností průběhu RA. Otázkou rovněž zůstává, zda polymorfizmus v promotorové oblasti genu pro MMP-2 ovlivňuje míru exprese DNA.

Studie byla podpořena grantovým projektem NR7812-3/2004, IGA Ministerstva zdravotnictví České republiky.

MUDr. Petr Němec

www.fnusa.cz

e-mail: petr.nemec@fnusa.cz

Doručeno do redakce: 23. 12. 2005

Přijato po recenzi: 31. 1. 2006