Vplyv rekombinantného ľudského prokalcitonínu na fagocytovú a kandidacídnu schopnosť polymorfonukleárnych leukocytov a na cídne mechanizmy séra a krvi voči baktériám Staphylococcus aureus a Escherichia coli

Overview

Prokalcitonín (PCT) je včasný a vysoko selektívny a špecifický ukazovateľ rozvoja a priebehu sepsy. Množstvo údajov potvrdzuje úlohu PCT ako dôležitého mediátora v patofyziológii systémovej baktériovej infekcie. Cieľom práce bolo zistiť vplyv rekombinantného ľudského PCT (rhPCT) na fagocytovú a kandidacídnu schopnosť polymorfonukleárnych leukocytov (PMNL) z plnej krvi, ako aj na cídne mechanizmy čerstvého séra a plnej krvi voči Escherichia coli (E. coli) a Staphylococcus aureus (S. aureus). Výsledky vyšetrení ukázali, že RhPCT dávkovo závisle inhiboval fagocytovú aktivitu, fagocytový index ako aj kandidacídnu schopnosť polymorfonukleárnych leukocytov (p < 0,001). Inhibičný vplyv rhPCT na cídiu plnej krvi a séra sa prejavil aj pri testovaní vplyvu rhPCT na cídne mechanizmy séra a plnej krvi voči E. coli vyočkovaním na kultivačné platne. Zistili sme nárast počtu kolónií E. coli počas inkubácie v prostredí séra aj krvi v prítomnosti rhPCT. Vplyv rhPCT na cídne mechanizmy séra a plnej krvi voči S. aureus nebol štatisticky signifikantný. Výsledky poukazujú na supresívny vplyv rhPCT na fagocytovú a mikrobicídnu schopnosť polymorfonukleárnych leukocytov.

Kľúčové slová:
fagocytóza - imunita - mikroorganizmy - polymorfonukleárne leukocyty - prokalcitonín - sepsa

Úvod

Prokalcitonín (PCT), prekurzor hormónu kalcitonínu, bol pôvodne charakterizovaný ako 116-aminokyselinový proteín s relatívnou molekulovou hmotnosťou 14,5 kDa [1]. Je členom rodiny peptidov kalcitonínových génov [2] a jeho syntéza je regulovaná génom CALC-I na 11. chromozóme (11p15.4) [3]. Bez prítomnosti systémovej infekcie je transkripcia CALC-I génu v bunkách ľudského tela potlačená a je selektívne zadaná len pre neuroendokrinné bunky štítnej žľazy a pľúc [4,5]. Plazmová/sérová koncentrácia PCT u zdravého dospelého človeka nepresahuje 0,5 ng x ml^-1 [6,7].

Systémová mikróbna infekcia, hlavne baktériová, ale aj mykotická a parazitová indukuje ubikvitárne zvýšenú expresiu CALC-I génu a uvoľňovanie kalcitonínových prekurzorov z rôznych tkanív a buniek celého tela [5,8]. K výraznej syntéze PCT dochádza v monocytoch a granulocytoch periférnej krvi ľudí pod stimulačným vplyvom prozápalových cytokínov IL-1β, IL-6, TNF-α, ale tiež IL-2, lipopolysacharidu (LPS) a S. aureus [9,10]. Po stimulácii LPS sa PCT vo zvýšenej miere produkuje v mnohých tkanivách a orgánoch, dôležitá úloha sa pripisuje hepatosplanchnickej oblasti. Najvyššie koncentrácie PCT sú v pečeni, obličke, aorte, tukovom tkanive, ováriách, nadobličke [11], v mozgu, pľúcach, semenníkoch a koži [5]. A tak, z hľadiska globálnej syntézy PCT, možno za septických okolností na celé telo pacienta nazerať ako na endokrinnú žľazu [5,8]. Pre túto skutočnosť ako aj pre fakt, že PCT je peptid determinovaný génom z rodiny génov kódujúcich endokrinné peptidy, označuje sa niekedy aj ako „hormokín“ [8,12]. Iní autori ho z hľadiska úlohy pri zápale zaraďujú do siete zápalových mediátorov a proteínov akútnej fázy [13,14].

Za patologických okolností stúpa koncentrácia PCT v plazme/sére na hodnoty mierne zvýšené pri syndróme systémovej zápalovej odpovede (SIRS) neinfekčnej etiológie (0,5 - 2,0 ng x ml^-1), stredne zvýšené pri systémovej baktériovej infekcii (2,0 - 10,0 ng x ml^-1) a veľmi vysoké pri ťažkej sepse (> 10,0 ng x ml^-1) [15]. Hodnoty koncentrácie PCT, na rozdiel od nešpecifických a častokrát zavádzajúcich hodnôt CRP a množstva leukocytov [5], prispievajú k diferenciácii SIRS neinfekčnej etiológie (postoperačný, sprevádzajúci popáleniny, pri chemickej pneumonitíde) od sepsy, pri ktorej sú hodnoty PCT signifikantne vyššie [16,17,18,19,20].

Diagnostická a prediktívna hodnota PCT v medicíne predbehla poznatky o jeho fyziologickej a imunologickej funkcii, ktorých je veľmi málo [21]. Cieľom našej práce bolo vyšetriť vplyv PCT na jeden z nešpecifických mechanizmov imunity - fagocytózu, zistiť, či rhPCT ovplyvňuje fagocytovú a mikrobicídnu schopnosť polymorfonukleárnych leukocytov (PMNL).

Materiál a metódy

20 zdravým dobrovoľníkom sme odobrali venóznu krv do heparínu (10 IU heparínu na 1 ml krvi) a na sérum, ktoré sme používali v testoch.

1. Vplyv rhPCT na fagocytovú schopnosť polymorfonukleárnych leukocytov (PMNL): Saccharomyces cerevisiae sme 30 min povarili a nariedili na konečnú koncentráciu 2,5 x 10⁷ ml^-1 fyziologického roztoku. Rekombinantný ľudský prokalcitonín (rhPCT; Brahms GmbH, Germany) sme nariedili vo fyziologickom roztoku na tri pracovné koncentrácie tak, aby výsledná koncentrácia vo vzorke bola: PCT1 - 1 ng x ml^-1 rhPCT, PCT5 - 5 ng x ml^-1 rhPCT a PCT10 - 10 ng x ml^-1 rhPCT. 450 µl krvi zmiešanej s 50 µl suspenzie Saccharomyces cerevisiae sme inkubovali 60 minút pri 37 °C za stáleho miešania (Coulter Mixer, Veľká Británia) s pridaným rhPCT alebo bez rhPCT. Zo vzoriek sme vyhotovili krvné nátery, zafarbili ich podľa Wrighta a pod imerzným objektívom svetelného mikroskopu hodnotili fagocytovú aktivitu (FA), čo je percento fagocytujúcich PMNL z vyšetrovanej populácie buniek (200) a fagocytový index (FI) - priemerný počet kvasiniek pohltených jedným PMNL.
2. Vplyv rhPCT na kandidacídnu schopnosť polymorfonukleárnych leukocytov (PMNL): Pripravili sme suspenziu Candida albicans (1 x 10⁷ ml^-1) a pracovné koncentrácie rhPCT (viď vyššie). 100 µl plnej krvi a 100 µl séra sme zmiešali s 50 µl suspenzie Candida albicans a inkubovali 60 min pri 37 °C za stáleho miešania (Coulter Mixer, Veľká Británia) v prítomnosti rhPCT a bez rhPCT. Pridali sme 2,5% deoxycholát sodný za účelom rozbitia všetkých buniek, 0,01% metylénovú modrú na zafarbenie mŕtvych kandíd, vzorky centrifugovali 10 minút pri 400 g a v sedimente sme imerzným objektívom svetelného mikroskopu vyhodnotili kandidacídnu aktivitu (CA) PMNL, čo je percento usmrtených kandíd [22].
3. Vplyv rhPCT na cídne mechanizmy séra a krvi voči baktériám Staphylococcus aureus (S. aureus) a Escherichia coli (E. coli): Pripravili sme suspenzie S. aureus a E. coli tak, aby výsledná koncentrácia baktérií vo vzorke bola 1 - 3 x 10³ ml^-1 a nariedili rhPCT na dve pracovné koncentrácie tak, aby výsledná koncentrácia vo vzorke bola: PCT1 - 1 ng x ml^-1 rhPCT a PCT10 - 10 ng x ml^-1 rhPCT. 1 ml krvi a 1 ml séra, ktoré sme zmiešali s 10 µl suspenzie S. aureus (n = 11) alebo E. coli (n = 12), sme inkubovali (60 min, 37 °C) za stáleho miešania (Culture tube rotator SC1, Bibby Sterilin Ltd., Veľká Británia) s pridaným rhPCT alebo bez rhPCT. Z každej vzorky sme vyočkovali po 100 µl na krvný agar pred a po inkubácii [23]. Po 24-hodinovej kultivácii agarov pri 37 °C sme určili pomer počtu kolónií (PPK) vyrastených po vyočkovaní vzorky po 60-minútovej inkubácii a počtu kolónií vyrastených po vyočkovaní tej istej vzorky v čase 0, vyjadrený v percentách [PPK = (vzorka 60/vzorka 0) x 100 %].

Štatistické vyhodnotenie

Výsledky udávame ako priemer (AVE) ± štandardná chyba priemeru (SEM). Na štatistické hodnotenie našich výsledkov sme použili analýzu variancie (repeated measures ANOVA) s Bonferroniho post-testom. Za signifikantné sme považovali zmeny s p < 0,05 (*), p < 0,01 (**) a p < 0,001 (***). Na zhodnotenie súvislosti medzi koncentráciou PCT pridávaného do vzorky a sledovanou veličinou (FA, FI, CA, PPK) vo vzorke sme použili neparametrický Spearmanov test.

Výsledky

1. Vplyv rhPCT na fagocytovú schopnosť polymorfonukleárnych leukocytov (obr. 1, obr. 2). RhPCT vo všetkých testovaných koncentráciách štatisticky signifikantne znížil fagocytovú aktivitu (FA) (p < 0,001) aj fagocytový index (FI) (p < 0,001) PMNL oproti vzorkám bez prítomnosti rhPCT. Medzi koncentráciou rhPCT a hodnotou FA aj FI bola vysoko signifikantná negatívna korelácia (p < 0,0001).
2. Vplyv rhPCT na kandidacídnu schopnosť polymorfonukleárnych leukocytov (obr. 3). RhPCT vo všetkých testovaných koncentráciách štatisticky signifikantne znížil kandidacídnu aktivitu (CA) PMNL (p < 0,001) oproti vzorkám bez prítomnosti rhPCT. Medzi koncentráciou rhPCT a hodnotou CA bola vysoko signifikantná negatívna korelácia (p < 0,0001).
3. Vplyv rhPCT na cídne mechanizmy séra a krvi voči baktériám S. aureus a E. coli. RhPCT zvýšil nárast počtu kolónií E. coli po 60-minútovej inkubácii aj vo vzorke séra, aj vo vzorke krvi (obr. 4). RhPCT vo vzorke séra spôsobil pokles počtu kolónií S. aureus počas 60 minútovej inkubácie, vo vzorke krvi bol však jeho vplyv nejednotný - kým nižšia koncentrácia PCT (PCT1) spôsobila nárast počtu kolónií, vyššia koncentrácia PCT (PCT10) viedla k poklesu počtu kolónií po 60 min inkubácie (obr. 5). Uvedené zmeny neboli štatisticky signifikantné.

Diskusia

Stanovenie koncentrácie PCT v sére/plazme sa síce využíva ako senzitívny a vysoko špecifický ukazovateľ systémovej baktériovej, parazitovej a mykotickej infekcie, reflektujúc jej závažnosť [24] a prognózu pacienta [25,26], informácií o jeho biologickej funkcii je však dodnes veľmi málo [13]. Napriek tomu existuje dostatočné množstvo údajov, ktoré potvrdzujú navrhnutú predstavu PCT ako humorálnej zložky, ktorá má dôležitú úlohu v patofyziológii sepsy [27]. Úlohu PCT ako sekundárneho mediátora sepsy potvrdzujú aj Becker et al [12], ktorí zistili, že kým podanie PCT zdravým zvieratám nie je škodlivé, podanie PCT septickým zvieratám signifikantne zvyšuje ich mortalitu. S týmto zistením koreluje aj nález Hoffmana et al [28], ktorí sledovali vplyv PCT na expresiu iNOS. Zistili, že samotný PCT nenavodzuje expresiu iNOS, avšak efektívne amplifikuje indukciu expresie iNOS cytokínmi TNF-α a INFγ. PCT tak moduluje zápalovú odpoveď. Na pohyblivosť monocytov pôsobí PCT tiež dvojako - kým migráciu monocytov zvyšuje, chemotaxiu navodenú chemoatraktantom FMLP (formyl-metionyl-leucyl-fenylalanín) inhibuje [29]. Zistilo sa tiež, že PCT dávkovo závisle znižuje LPS a FMLP vyvolaný vzostup expresie CD11b, integrínu, ktorý sa zúčastňuje na procese diapedézy monocytov a neutrofilov. Môže tak prispievať k potlačeniu zápalu [30].

Pokiaľ ide o moduláciu špecifickej imunitnej odpovede, ukázalo sa, že PCT pôsobí minimálne dvojakým mechanizmom [31]. PCT zvyšuje aktivitu autológnych kľudových lymfocytov, potláča však mitogénnu aktivitu T-lymfocytov aktivovaných fytohemaglutinínom ako aj schopnosť T-lymfocytov ovplyvnených PCT následne sa aktivovať v prítomnosti fytohemaglutinínu a konkanavalínu A, akoby jeho úlohou bolo udržať aktivitu T-lymfocytov v určitom rozmedzí. S týmito výsledkami súvisia poznatky o dynamike sepsy, o polarizácii imunitnej odpovede počas sepsy [32,33]. Rozvoj SIRS sprevádza totiž mohutná tvorba prozápalových cytokínov a to za účelom mobilizácie organizmu s cieľom zvládnuť infekciu. V prípade prestrelenia tejto reakcie môže, hlavne vo včasnej fáze sepsy, pacient zomrieť za príznakov hyperinflamácie, ktorá vznikla na podklade nadmernej snahy organizmu vysporiadať sa s infekciou za každú cenu, pričom tento proces nebol regulačne zvládnutý. Takmer súčasne po vyplavení prozápalových cytokínov dochádza aj k uvoľneniu protizápalových cytokínov, ktoré pôsobia kontraregulačne a snažia sa zmierniť negatívny dopad, ktorý vyplýva z prehnanej aktivity prozápalových cytokínov. Rozvíja sa kompenzačný antagonistický mechanizmus CARS (syndróm kompenzačnej protizápalovej odpovede), ktorý v ideálnom prípade vedie k nastoleniu rovnovážneho stavu cytokínov - MARS (mixed antagonistic response syndrome - syndróm zmiešanej antagonistickej odpovede), kedy má pacient najväčšiu šancu na úzdravu. V prípade, ak mechanizmy CARS prestrelia, dostáva sa pacient do stavu imunoparalýzy a zomiera za príznakov imunodepresie, ktorá je charakteristická, hlavne pre neskoršiu fázu sepsy [32].

Výsledky našej práce podporujú teóriu možnej imunosupresívnej úlohy prokalcitonínu. Signifikantné zníženie FA, FI a CA PMNL navodené pridaním už najnižšej testovanej koncentrácie rhPCT (1 ng x ml^-1) a následné prehlbovanie sa tohto inhibičného efektu so stúpajúcou koncentráciou pridávaného rhPCT jednoznačne poukazuje na to, že prokalcitonín by mohol významne potláčať schopnosť fagocytózy a cídie PMNL a tlmiť tak mechanizmy bunkovej zložky nešpecifickej imunity.

Počet baktérií E. coli v sére počas inkubácie značne stúpol, čo znamená, že došlo k inhibícii mikrobicídie a mikroorganizmy sa v prítomnosti PCT lepšie množili. Baktérie boli v sére vystavené iba humorálnym mechanizmom nešpecifickej imunity, ktoré zahŕňajú β-lyzín, properdín, interferóny a ostatné cytokíny, proteíny akútnej fázy, lyzozým a komplement ako najúčinnejší z nich [34]. Jeden z dôvodov relatívnej rezistencie baktérií na účinok komplementu je, že boli použité zbierkové kmene, a nie kmene, ktoré bežne kolujú v populácii. S použitými kmeňmi baktérií sa teda dobrovoľní darcovia séra pravdepodobne ešte nestretli. Pravdepodobná neprítomnosť špecifických protilátok IgG proti testovaným kmeňom baktérií v sére darcov eliminovala možnosť aktivácie komplementu klasickou cestou, a preto sa mohla uplatniť len alternatívna resp. lektínová cesta. Koncentrácia rhPCT 10 ng x ml^-1 vo vzorke séra spôsobila zvýšenie nárastu počtu kolónií E. coli, čo by mohlo znamenať potlačenie účinku humorálnych mechanizmov nešpecifickej imunity. Čo sa týka baktérií S. aureus, PCT spôsobil zníženie nárastu počtu kolónií, ktoré, hoci bolo nesignifikantné, predstavuje opačný účinok PCT než bol tento pri E. coli. Potenciálnym vysvetlením by mohol byť fakt, že keďže je S. aureus G+ a E. coli G- baktéria, majú výrazne odlišné zloženie bakteriálnej steny, ktorú mechanizmy nešpecifickej imunity odlišným spôsobom atakujú [34].

Pri porovnávaní pomeru počtu kolónií (PPK) baktérií získaných vyočkovaním vzoriek obsahujúcich ako nosné médium krv, sme pridávaním rhPCT do vzoriek sledovali jeho vplyv na usmrcovanie baktérií v procese fagocytózy. PCT s koncentráciou 1 ng x ml^-1 vo vzorke navodil zvýšenie nárastu počtu kolónií S. aureus aj E. coli počas 60-minútovej inkubácie. Dalo by sa to interpretovať tak, že rhPCT znížil efektivitu cídnych mechanizmov pôsobiacich na baktérie vo vzorke, t.j. znížil cídnu schopnosť fagocytov. Potenciálny supresívny vplyv rhPCT na cídnu schopnosť fagocytov sa v prípade cídie E. coli zvýšením koncentrácie rhPCT vo vzorke na 10 ng x ml^-1 zosilnil, keďže nárast počtu kolónií sa ešte výraznejšie zvýšil. Iná situácia bola v pokuse s baktériou S. aureus, kedy rhPCT s koncentráciou 10 ng x ml^-1 vo vzorke mal opačný účinok než rhPCT s koncentráciou 1 ng x ml^-1, t.j. nárast počtu kolónií počas inkubácie znížil. Je možné, že PCT sa vylučuje na podnet imunitných mechanizmov resp. mediátorov aktivovaných výraznejšie G- baktériami než G+, a následne tieto mechanizmy resp. mediátory ovplyvňuje. Zodpovedá tomu aj skutočnosť, že najvyššie koncentrácie PCT sa našli pri G- sepse [35,36], zatiaľ čo pri niektorých stafylokokových systémových infekciách hodnoty PCT neboli vôbec zvýšené [37].

Výsledky našej práce poukazujú na supresívny vplyv PCT na fagocytózu. Je možné domnievať sa, že PCT ako jeden z protizápalových cytokínov potláča mechanizmy bunkovej nešpecifickej imunity v snahe zabrániť rozvoju hyperinflamácie. Prestrelená tvorba PCT pravdepodobne prispieva ku vzniku imunodepresie v neskoršej fáze septického syndrómu, čo by mohli dokumentovať aj naše výsledky, ktoré poukázali na dávkovo závislú inhibíciu fagocytárnej a kandidacídnej schopnosti PMNL. Túto skutočnosť potvrdzuje aj známa korelácia vysokých hladín PCT so zlou prognózou [38,39].

Štúdia bola umožnená aj vďaka podpore grantu VEGA 1/0528/03 MŠ SR. Ďakujeme firme Brahms (Germany), ktorá nám darovala rhPCT za výskumným účelom.

MUDr. Mária Bucová, CSc.

www.fmed.uniba.sk

e-mail: maria.bucova@fmed.uniba.sk

Doručeno do redakce: 11. 7. 2005

Přijato po recenzi: 5. 9. 2005