Metalothionein a jeho vztah k protinádorové léčbě na bázi platinových komplexů

Overview

 

Metalothionein:
Jedná se o malý protein s vysokým obsahem cysteinu, jehož sulfhydrylové skupiny mu propůjčují unikátní vlastnosti. V organismu se stará o transport iontů kovů (Zn, Cu), má ale i detoxikační funkci, protože dokáže vázat i toxické těžké kovy (Cd, Pb, Hg aj.). Buňkám pomáhá také zvládat oxidativní stres a reguluje hladinu exprese či enzymatickou aktivitu.

Cytostatika na bázi platiny:
Tento typ cytostatik patří k nejdéle používaným a nejúčinnějším. Zakládají se na komplexech platiny s obměňováním ligandů. Nejstarší zástupce, cisplatina, má dnes již účinnější analogy (léčiva druhé a třetí generace, karboplatinu a oxaliplatinu, a ve vývoji jsou další), nicméně stále je hojně využívána. U některých nemocných se ale vyskytuje fenomén rezistence nádorových buněk, což samozřejmě snižuje efektivitu léčby.

Vznik rezistence a její mechanismy:
Rezistence nádorových buněk vůči cytostatikům je komplexní děj, který v sobě zahrnuje několik mechanismů. Z nám známých to jsou především regulace intracelulární koncentrace léku a jeho eflux, komplexace intracelulárními thioly (glutathion, metalothionein) a mechanismy pro reparaci poškozené DNA.

Závěr:
Výzkumy v této problematice postupují velice rychle a jistě se dočkáme mnoha zlomových poznatků, nejen o zapojení metalothioneinu do vzniku rezistence. Je to jedna z podmínek pro efektivnější zvládnutí léčby a pochopení metabolismu nádorového onemocnění.

Klíčová slova:
Metalothionein, cisplatina, rezistence, nádorové onemocnění.

Metalothionein

Metalothionein náleží do rodiny metaloproteinů, které jsou široce rozšířeny v živočišné říši, nicméně podobné typy proteinů byly popsány i u bakterií rostlin a hub. Metalothioneiny popsali poprvé Margoshes a Valee v roce 1957, kteří je izolovali z koňských ledvin (1). Existuje spousta izoforem, ale strukturní rysy jsou v drtivé většině stejné. Jedná se o nízkomolekulární (6-10 kDa) na cysteiny bohaté proteiny, které neobsahují žádné aromatické aminokyseliny. Primární struktura je založena na určité repetici motivů, v nichž hlavní roli hraje aminokyselina cystein. Takto jsou vytvořena dvě rezidua, která vytváří cysteinové klastry. První z nich, β doména, má vazebné místo pro tři ionty dvojmocných kovů, druhá α doména potom až pro čtyři ionty. Celkově je tedy metalothionein schopen vázat až 7 dvojmocných iontů nebo 12 jednomocných (2).

Metalothionein se v organismech vyskytuje v několika izoformách;

• MT-1,
• MT-2,
• MT-3, a 
• MT-4 ( ).

Široce rozšířené jsou především izoformy MT-1 a MT-2, přičemž zastoupení formy MT-2 ve tkáních je častější; forma MT-3 je nejhojněji exprimována v moz-ko-vé tkáni (4). Nejméně prozkoumanou formou je MT-4, výskyt genů ukazuje na její výskyt v šupinkovém epitelu (5). In vitro bylo prokázáno, že buňky mají schopnost sekrece forem MT-1 a MT-2 (6).

Funkce metalothioneinu

Funkcí má metalothionein mnoho. Předně je to významný přenašeč iontů kovů, jak již bylo naznačeno v úvodu. Nejčastěji váže Zn, ale velkou afinitu má i k Cu, čímž udržuje homeostatickou hladinu těchto kovů v organismu (7). V případě Cu tímto také reguluje hladinu radikálů kyslíku vzniklých Fentonovou reakcí (8). Při výskytu toxických kovů v organismu je metalothionein schopen je navázat a přenést na místo detoxikace, s největší pravděpodobností do ledvin (9). Tímto mechanismem je tělo schopno se bránit proti iontům Cd, Hg, Pb a dalších těžkých kovů.

MT má také významnou antioxidativní roli. Spolu s GSH vytváří oxidačně redukční dvojici, která reguluje výskyt volných kyslíkových radikálů. Napomáhá tak chránit nukleové kyseliny před účinky ionizujícího záření, fosfolipidy membrán před oxidací a zajišťuje pro buňku redukční prostředí (10, 11, 12). V nedávné době bylo poukázáno též na regulační vlastnosti MT. Jakožto nosič Zn a Cu může sloužit jako zásobník těchto kovů pro důležité transkripční faktory a apoenzymy účastnící se v expresi proteinů (například p53) (13–16).

Exprese metalothioneinu

Regulace exprese metalothioneinu je také spjata s výskytem iontů kovů. Transkripce do mRNA je zahájena po navázání MTF-1 (metal-regulatory transcription factor-1), což je zinkový prst o hmotnosti okolo 70-80 kDa, na MRE (metal responsive element), který leží na promotoru genu pro metalothionein (17, 18, 19). Za normálních okolností je na MTF-1 navázán MTI, což je inhibitor, který zabraňuje navázání MTF-1 na MRE. Po vstupu iontu kovu do intracelulárního prostoru buňky se vytvoří vazba mezi tímto iontem a MTI. Tím se MTF-1 uvolní a indukuje expresi metalothioneinu (19). Tohoto faktu se využívá například při treatmentu intoxikace těžkým kovem, kdy je pacientovi podáván zinek, který takto aktivuje expresi genu pro metalothionein, a ten je poté schopen vyvazovat zdroj intoxikace (20).

Metalothionein a nádorová onemocnění

Vztah metalothioneinu k nádorovému onemocnění nebyl doposud uspokojivě osvětlen, nicméně protein hraje roli v kancerogenezi. Při experimentech s MT-1/MT-2 knockout myšmi bylo ukázáno, že jsou citlivější k indukci nádorového onemocnění způsobeným olovem než běžní jedinci (21). V mnoha studiích byla zkoumána hladina metalothioneinu v závislosti na lokalizaci nádorového onemocnění, stádia a klasifikace nemoci, stáří pacientů a mnoha jiných faktorech. Takto bylo zjištěno, že buňky nádorů vzešlých z paraxiálního mesodermu (osteosarkom, aj.) a z entodermu (karcinomy jater, močového měchýře, tračníku, aj.) mají gen pro MT-1E v indukované formě a gen pro MT-1F je inhibován.

Opačná situace panuje u nádorů ektodermálního (karcinom mléčné žlázy, aj.), středně mezodermálního (karcinom ledvin, aj.) a laterálně mezodermálního (zhoubný nádor lymfatické tkáně) původu. Všechno nasvědčuje tomu, že zvýšená exprese metalothioneinů u pacientů s indukovaným genem pro MT-1F ukazuje na zhoršenou prognózu a overexprese u pacientů s indukovaným genem pro MT-1E naopak na lepší prognostické vyhlídky (22).

Cytostatika na bázi platiny

Účinky nejznámějšího zástupce této skupiny látek, cisplatiny (cis-diammindichlorplatnatý komplex), byly objeveny náhodou, když Rosenberg a van Camp zkoumali vliv elektrického proudu na kolonii mikroorganismů (E. coli) (23). Pro materiál elektrod zvolili platinu a po několika pokusech pozorovali, že mikroorganismy se již nedělí. Výzkumníci zjistili, že je to způsobeno cisplatinou, která vznikala elektrolýzou platinových elektrod. Následně se Rosenberg rozhodl vyzkoušet cytostatické vlastnosti této látky na krysách se sarkomem a výsledky potvrdily, že ji účinky řadí mezi nejlepší cytostatika té doby

Mechanismus účinku cisplatiny

Uběhlo téměř 50 let od pozorování efektu cisplatiny na buňky, ale ani to nemění nic na faktu, že je dodnes hojně využívána. Nicméně kvůli mnoha vedlejším efektům léčby je dnes pomalu vytlačována deriváty platnatých komplexů druhé generace, jako je karboplatina či ještě nověji komplex třetí generace, kam se řadí oxaliplatina (obr. 1).

V čem spočívá léčebný efekt této látky? Mnoho studií se tímto jevem zaobíralo, takže dnes máme relativně ucelené znalosti problematiky. Komplex cisplatiny jako takový nemá cytostatické účinky, nicméně po vstupu do buňky, děje se tak přes membránový transport, se hydrolyzují vazby Pt-Cl a vytvoří se aqua platnaté komplexy, které následně za odštěpení H⁺ iontů vytvoří diammindihydroxyplatnatý komplex, který se již cytotoxickou aktivitou vyznačuje (obr. 2).

Aktivovaná cisplatina je elektrofil, který ochotně reaguje s DNA, zejména s purinovými bázemi a kovalentně se na ně váže za tvorby DNA aduktů (24). Bylo popsáno několik DNA-ciplatinových komplexů, nicméně nejhojnější se zdá být komplex ciplatiny a dvou sousedních guaninů – až 65 % (obr. 3) (25). Tím je znemožněna replikace DNA. Za zmínku stojí také fakt, že transizomer cisplatiny (trans-diammindichlorplatnatý komplex) není schopen vytvářet DNA-adukty jako cisizomer a v praxi se v chemoterapii nevyužívá. Důvodem je vznik odlišných DNA aduktů, které nejsou pro funkci buňky tolik závažné.

Dalším důvodem využívání cisplatiny v nádorové léčbě je její schopnost indukovat apoptózu. V této oblasti není příliš dostatečných informací. Nejuznávanější teorie se přiklání k možnosti, že DNA-adukty jsou rozpoznány opravnými proteiny (hMSH2 – homolog bakteriálního MutS a hMLH1, hPMS1 a hPMS2, což jsou homology MutL), nicméně pokud je poškození vážné, nedokážou již tyto poruchy opravit a je spuštěna apoptóza (26, 27).

Vznik rezistence a její mechanismus

Výzkumy ukazují, že některé nádorové linie se stávají odolné vůči cytostatikům. Tím se samozřejmě snižuje efektivita léčby a samozřejmě se zvyšuje riziko poškození zdravých buněk. I u platnatých komplexů byl tento jev rezistence pozorován. Obecně se zdá, že buňka má asi tři možnosti obrany.

Prvním z nich je aktivní transport léčiva pryč z intracelulárního prostoru a jeho akumulace mimo buňku. V několika studiích byl navržen systém efluxu za pomoci transportních proteinů mědi CTR1, ATP7A a ATP7B. Byla pozorována korelace mezi úrovní resistence buněk vůči cisplatině a expresí těchto přenašečů (28). U některých tumorových buněk byla pozorována zvýšená exprese proteinů, které by tento transport mohly zapříčiňovat.

Další překážkou v cestě platiny za apoptózou jsou obecně thioly. Jsou to většinou nízkomolekulární látky jevící afinitu k iontům kovů a mající též antioxidační aktivitu. Bylo prokázáno, že některé thioly se vyznačují velkou afinitou právě k cisplatině; nejvýznamnější jsou glutathion a metalothionein (25). Cisplatina komplexovaná thioly již není nebezpečná pro DNA a bývá z buňky odstraňována, detoxifikace pravděpodobně probíhá v ledvinách, nicméně mechanismus je neprobádán (9).

Poslední možností obrany buňky je oprava poškozené DNA. Obecně se předpokládá, že největší roli při opravě hrají HMG proteiny (high mobility group) a proteiny označované jako Mismatch repair proteins. Posledně jmenované nedokážou přímo defektní DNA opravit, nicméně se snaží na nepoškozeném vlákně DNA vložit „správné“ nukleotidy komplementární k DNA-aduktu, tím celou molekulu učiní velice nestabilní, a to může být jeden z důvodů spuštění apoptoických drah v buňce. Předpokládá se, že rezistentní nádorové linie buněk mají buď mutace právě v genech kódující tyto opravné proteiny, či snesou daleko větší poškození DNA, kterou by normální buňku přimělo ke spuštění apoptózy.

HMG proteiny jsou nehistonové proteiny vyskytující se v chromatinu. Tyto proteiny rovněž nedokáží opravit cisplatinou napadenou DNA, nicméně dokáží rozeznat tyto adukty a navázat se na ně (2). Zatím není příliš jasné, jaká je přesně spojitost s rezistivitou nádorových buněk těmito proteiny, nicméně bylo navrženo několik možností. Jedna z nich je, že navázáním HMG proteinu na vzniklý adukt DNA a cisplatiny je tato struktura „ukryta“ před opravnými proteiny. Tím samozřejmě narůstá počet chybných úseků na DNA, ale stoupá i rezistivita buňky, neboť opravné proteiny poté nemohou spustit apoptotické dráhy. Ve věci indukce fenoménu rezistence si mnoho studií protiřečí ve výsledcích a je jasné, že rezistence vznikne kooperací několika opravných mechanismů, z nichž je každý zastupitelný. Postupně se tak do vzniku rezistivity zapojuje eflux cytostatika, jeho inaktivace thioly a jako poslední proteiny opravující defektní strukturu DNA, způsobenou právě navázáním cisplatiny (29).

Thioly obecně jsou látky obsahující volné -SH skupiny aminokyseliny cysteinu. Tento velice účinný nukleofil je výborným ligandem u komplexotvorných reakcí. Další vlastností sulfhydrylové skupiny je, že je velice jednoduše oxidovatelná (30). Ve vzniku rezistence nádorových buněk vůči cisplatině hrají největší vliv dva thioly; a to sice glutathion (GSH) a metalothionein (MT). Prvně jmenovaný je malý tripeptid (γ-glutamylcysteinylglycin), jedna z nejrozšířenějších molekul v buňce s řadou funkcí. Pokud se zaměříme čistě na interakci s cisplatinou, glutathion se na ni naváže (v poměru 2:1) a poté se, podle obecně uznávané teorie, tento komplex aktivně transportuje do extracelulárního prostoru (31).

Cesty exkrece cisplatiny nebyly ještě plně prozkoumány, jedním z předpokládaných způsobů je vyloučení močí, v plazmě je pak cisplatina inaktivována plazmatickými proteiny či se navazuje do tkání (9).

Dalším příspěvkem GSH k obraně buňky před cisplatinou je jeho možná spojitost přímo s opravnými mechanismy DNA. Ukázalo se, že se snížením množství GSH v buňce pomocí buthioninu sulfoximinu (BSO), což je syntetická aminokyselina používající se v kombinaci s chemoterapeutiky – inhibuje syntézu GSH, podařilo inhibovat i reparační procesy na DNA (32). Navíc, GSH slouží také jako účinný antioxidant; jeho sulfhydrylové skupiny mohou být oxidovány (za vytvoření disulfidické vazby – S-S-) namísto jiných důležitých molekul citlivých k oxidačnímu stresu. Tím je zajištěno dostatečně redukční prostředí pro biochemické reakce. Pro některé proteiny z HMG rodiny je pro jejich správnou funkci potřebné, aby byly v redukovaném stavu. Tato podmínka je zaručena dostatečným množstvím GSH v buňce.

Za zmínku ještě stojí regulační vlastnosti GSH vůči transkripčním faktorům c-jun a c-fos, které jsou potenciálně zodpovědné za regulaci exprese opravných proteinů pro DNA. Tyto transkripční faktory jsou onkogeny uplatňující se při diferenciaci a proliferaci buněk a apoptóze. Jejich transkripce je zřejmě indukována oxidačním efektem ultrafialového záření, přičemž molekuly GSH jsou účinné zhášeče volných radikálů a regulací jejich hladiny dokáže zároveň ovlivňovat i úroveň exprese těchto transkripčních faktorů. Vliv GSH na vznik rezistence je komplexní záležitost a studie této problematiky je těmito aspekty velice znesnadněna (33).

Další thiolem spjatým s buněčnou obranou proti cisplatině je metalothionein (MT). MT se v normálním fyziologickém stavu stará o transport esenciálních iontů kovů, zejména pak Zn a Cu. Avšak v případě intoxikace těžkým kovem je schopen jej navázat a transportovat mimo buňku. Nejvíce prací vztažených k tomuto jevu bylo věnováno interakci MT-Cd (34). Cisplatina patří do skupiny látek, které mohou být takto metalothioneinem navázány (metalothionein je schopen navazovat i transplatinu). MT má k cisplatině větší afinitu než k zinku, a reakce mezi cisplatinou a MT nesoucím zinek má za důsledek uvolnění Zn²⁺ mimo protein. Volné ionty potom mohou opět indukovat expresi metalothioneinu a amplifikovat reakci. MT může také hrát roli v regulaci exprese dalších proteinů, potenciálně obranných (35).

Závěr

Plné porozumění fenoménu rezistence je zásadní pro zefektivnění protinádorové léčby a stejně tak pro pochopení samotného fungování nádorových buněk. Celá problematika je značně komplexní a pro získání nových údajů ohledně vztahu metalothioneinu k karcinogenezi, hlavně na poli molekulárně-genetickém, je velmi nutné pokračovat ve výzkumu na buněčných liniích nádorových buněk, zejména pak resistentních.

Poděkování

Práce na tomto projektu byla podpořena projektem Grantové Agentury AV ČR IAA401990701.

Doc. Ing. René Kizek, Ph.D.

Laboratoř molekulární biochemie a bioelektrochemie,

Ústav chemie a biochemie,

Mendelova zemědělská

a lesnická univerzita v Brně

Zemědělská 1,

613 00 Brno,

e-mail: kizek@sci.muni.cz

tel: +420-5-4513-3350

fax: +420-5-4521-2044