Stanovenie mukociliárneho klírensu u pacientov so symptómami laryngofaryngeálneho refluxu – preliminárne výsledky

Overview

Úvod: Mukociliárny klírens predstavuje dôležitý obranný mechanizmus dýchacích ciest. Výsledky viacerých prác naznačujú, že gastroezofágový reflux sa môže podieľať na zhoršovaní mukociliárneho klírensu, čo by mohlo viesť k laryngofaryngeálnym refluxným symptómom vrátane recidivujúcich infekcií dýchacích ciest. Preto sme sa rozhodli stanoviť frekvenciu kinematiky cílií epitelu horných dýchacích ciest u pacientov s laryngofaryngeálnym refluxom. Materiál a metódy: Zaradili sme 23 pacientov s laryngofaryngeálnymi refluxnými symptómami. Kontrolnú skupinu tvorilo 9 zdravých dobrovoľníkov. Pacientov sme zaradili na základe pozitivity dotazníka reflux symptom index (RSI > 13 bodov), bez terapie inhibítormi protónovej pumpy. Zrealizovali sme nazofaryngeálny ster a zhodnotili frekvenciu kmitania cílií respiračného epitelu pomocou vysokorýchlostnej videomikroskopie a špeciálneho softvéru Ciliary analysis. Hodnoty frekvencie kinematiky cílií sme porovnali s hodnotami u zdravej populácie. Výsledky: Stanovili sme medián, maximálnu a minimálnu hodnotu ciliárnej frekvencie. Medián ciliárnej frekvencie u zdravých dobrovoľníkov bol signifikantne vyšší ako u pacientov s laryngofaryngeálnou refluxnou symptomatológiou (10,86 ± 1,67 vs. 6,6 ± 2,2; p < 0,001). Maximálna frekvencia bola taktiež signifikantne vyššia u zdravých dobrovoľníkov v porovnaní s pacientami (17,9 ± 0,95 vs. 15,3 ± 2,39; p < 0,001). Hodnota minimálnej frekvencie bola bez signifikantného rozdielu. Korelačná analýza ukázala inverznú koreláciu medzi hodnotou mediánu ciliárnej frekvencie respiračného epitelu a symptómami LPR (hodnotou RSI) (p < 0,04). Záver: Pacienti s laryngofaryngeálnymi refluxnými symptómami majú nižšiu frekvenciu kinematiky cílií v porovnaní so zdravými dobrovoľníkmi. Miera poruchy kinematiky koreluje s mierou ich laryngofaryngeálnych symptómov. Sú potrebné ďalšie štúdie na priamy dôkaz účasti gastroezofágového refluxu v zhoršenom mukociliárnom klírense.

Klíčová slova:

mukociliárny klírens – laryngofaryngeálny reflux – cílie

Úvod

Laryngofaryngeálny reflux (LPR) je zápalové ochorenie horného aerodigestívneho traktu, ktoré vzniká pôsobením gastroduodenálneho refluxátu pri prieniku nad horný pažerákový zvierač. Patofyziológia ochorenia je multifaktoriálna, komplexná a doposiaľ nie úplne objasnená. Za vyššiu citlivosť laryngeálnej sliznice na refluxát zodpovedá jeho histologická stavba – cylindrický epitel. V porovnaní s viacvrstvovým dlaždicovým epitelom pažerákovej sliznice je menej odolný voči agresívnym zložkám refluxátu. Okrem toho neobsahuje pufrovacie systémy, nepôsobí tu neutralizačný efekt slín ani očisťovací vplyv peristaltiky pažeráka.

Gastroduodenálny refluxát môže na sliznici nosovej dutiny, prínosových dutín či nosohltana spôsobovať zápalové zmeny. Dochádza k edému sliznice, nadmernej sekrécii hlienov, ich zatekaniu a k opakovaným či pretrvávajúcim infekciám dýchacích ciest [1,2].

Typickými morfologickými zmenami sú granulóm hlasiviek, hypertrofia krčných mandlí či zadnej časti orofaryngu. Vplyvom mikro- a makroskopických slizničných zmien dochádza k narušeniu bio mechanických vlastností hlasiviek a k dysfónii.

V diagnostike ochorenia sa najčastejšie využíva diagnosticko-terapeutický test inhibítormi protónovej pumpy (PPI), dotazník Reflux symptom index (RSI) a 24-hodinová dvojkanálová pH-metria s impedanciou. Diagnosticko-terapeutický test pozostáva z liečby PPI vo vysokých dávkach (2-krát denne), aspoň počas 3 mesiacov s následným prehodnotením efektu na symptómy pacientov. Dotazník RSI v sebe zahŕňa najčastejšie sa vyskytujúce symptómy pri LPR. Pre diagnózu LPR svedčí dosiahnutie minimálne 13 bodov [3]. Dvojkanálová 24-hodinová pH-metria s impedanciou je diagnostická metóda, ktorá umožňuje zistiť počet a charakter refluxných epizód a umožňuje ich hodnotiť aj vo vzťahu k zaznamenaným symptómom (napr. kašeľ). Kombinácia impedancie a dvojkanálovej pH-metrie detegujúcej zmeny pH v distálnom pažeráku (5 cm nad dolným pažerákovým zvieračom) a hypofaryngu (1 cm nad horným pažerákovým zvieračom) umožňuje komplexné hodnotenie refluxnej epizódy [4].

Klinický a morfologický obraz LPR je nešpecifický a môže byť prítomný aj pri iných ochoreniach. Medzi najčastejšie symptómy patrí kašeľ, potreba odkašliavania/očisťovania hrdla, pocit cudzieho telesa v krku, zahlienenie a dysfónia. Pri LPR dochádza ku vzniku kašľa pravdepodobne v dôsledku mikroaspirácií refluxátu. Výsledky našej pracovnej skupiny nepotvrdili zvýšenú citlivosť kašľového reflexu ako mechanizmu kašľa pri LPR [5]. Kašeľ asociovaný s refluxátom býva zväčša dlhodobý a suchý, môže sa zhoršovať pri jedle alebo v horizontálnej polohe. Určenie refluxnej etiológie kašľa je napriek množstvu realizovaných štúdií náročné [6,7].

Refluxná laryngitída je zápalové ochorenie hrtanu a na jej vzniku sa často podieľa LPR. U pacientov je prítomné zachrípnutie, potreba častého odkašliavania, poruchy hlasu, hlasová únava či pocit zahlienenia v krku. Ochorenie môže mať chronický alebo recidivujúci charakter a môže viesť k vzniku komplikácií. Dôležité je laryngoskopické vyšetrenie ORL špecialistom v rámci pátrania po morfologických zmenách vznikajúcich pôsobením refluxátu.

Predpokladá sa, že reflux môže byť príčinou dlhotrvajúcich či rekurentných zápalov horných dýchacích ciest. Niektoré štúdie preukázali vyššiu prevalenciu LPR-like symptómov u pacientov s chronickou sinusitídou v porovnaní so vzorkou zdravých dobrovoľníkov [8,9]. Predpokladá sa, že okrem vzniku zápalových zmien sliznice nosovej dutiny a nosohltana môže refluxát ovplyvňovať aj mukociliárny klírens (MCT – mucociliary clearence time) [10,11].

V našej práci sme sa preto venovali sledovaniu ciliárneho pohybu respiračného epitelu u pacientov s LPR-like ťažkosťami. Chceli sme zistiť, či existujú rozdiely vo frekvencii ciliárneho pohybu medzi pacientami a zdravými dobrovoľníkmi bez pažerákových či mimopažerákových refluxných ťažkostí.

Ako diagnostickú metódu stanovenia frekvencie ciliárneho pohybu sme využili vysokorýchlostnú videomikroskopiu a softvérovú aplikáciu Ciliary Analysis. Jedná sa o unikátnu metódu, vytvorenú slovenskými autormi, pracovníkmi Elektrotechnickej fakulty Žilinskej univerzity v Žiline v spolupráci s Jesseniovou lekárskou fakultou v Martine [12]. Pomocou nej môžeme kvantifikovať mukociliárny klírens na základe stanovenia frekvencie ciliárnej kinematiky. Táto práca je prvou, ktorá využíva danú metódu v rámci sledovania MCT u dospelých pacientov (tab. 1).

Pacienti a metódy

Protokol štúdie bol schválený Etickou komisiou Jesseniovej lekárskej fakulty v Martine, Univerzity Komenského (EK 71/2021). Jednalo sa o prospektívnu, monocentrickú štúdiu. Realizovali sme ju u pacientov v ambulantnej starostlivosti, ktorí boli referovaní do ambulancie funkčných porúch tráviaceho traktu Internej kliniky – gastroenterologickej JLF UK a UN Martin s podozrením na LPR.

Pacientom sme odobrali osobnú anamnézu s dôrazom na gastrointestinálne a respiračné komorbidity. Zhodnotili sme refluxné symptómy, pričom pacienti vyplnili RSI dotazník. Inklúznym kritériom pre zaradenie do štúdie bola hodnota RSI > 13 bodov, ktorá svedčí pre prítomnosť LPR. Exklúznym kritériom bol vek pod 18 rokov, fajčenie, tehotenstvo, dojčenie, recentná infekcia dýchacích ciest, predchádzajúca veľká brušná či hrudná operácia, Nissenova fundoplikácia, achalázia pažeráka, aktívna malignita, ťažké neurologické ochorenie, nešpecifické zápalové črevné ochorenie a reumatologické ochorenie pre problematický vzťah k motilite pažeráka. Všetci pacienti podpísali informovaný súhlas so zaradením do štúdie. U pacientov sa pred odoslaním na naše pracovisko realizoval diferenciálno-diagnostický proces, ktorý neustanovil inú etiológiu ťažkostí.

Pacienti boli poučení, aby minimálne 10 dní pred vyšetrením neužívali PPI. Po získaní anamnestických dát a vyhodnotení RSI dotazníka sme realizovali odber materiálu. Frekvenciu ciliárneho pohybu (CBF – ciliary beat frequency) respiračného epitelu sme hodnotili pomocou digitálnej vysokorýchlostnej videomikroskopie a softvérovej aplikácie Ciliary Analysis.

Vzorku respiračného epitelu sme odobrali z horných dýchacích ciest pomocou cytologickej kefky. Odber sa vykonal pri izbovej teplote, t.j. 20 °C. Cytologická kefka sa zaviedla do nosovej dutiny mediokaudálnym smerom popri mediálnej strane nosového septa, pokiaľ nenarazila na prekážku. Následne sa vykonal rotačný a predo-zadný pohyb a kefka sa vybrala z nosovej dutiny. Materiál sa ihneď po odbere vložil do 2 ml transportného RPMI 1640 média.

Skúmavka s vloženou kefkou a materiálom sa premiešala a vzorka epitelu sa preložila na podložné sklíčko prekryté krycím sklíčkom a pozorovala sa pod svetelným mikroskopom Zeiss Axio Scope AI pod 40–60-násobným zväčšením. Následne sa pomocou vysokofrekvenčnej videokamery pripojenej k svetelnému mikroskopu a počítaču nahrali 4-sekundové videosekvencie pri rozlíšení 1 280 × 1 240 a frekvencii snímania 256–512 snímok za sekundu. U každého pacienta sme z daného preparátu zhotovili 10 videí korešpondujúcich s tými časťami preparátu, ktoré obsahujú cílie. Manuálne sme vyhľadali bunky respiračného epitelu s cíliami na svojom povrchu, jednotlivé oblasti označili a soft vérom Ciliary Analysis analyzovali frekvenciu ciliárneho pohybu v Herzoch (Hz). Z jednotlivých oblastí sme pomocou softvérovej aplikácie zistili medián, maximálnu, strednú a minimálnu frekvenciu kmitania cílií.

Na porovnanie jednotlivých hodnôt CBF sme použili nepárový Studentov T-test. Sila lineárnej asociácie medzi CBF a RSI sa určila s pomocou Pearsonovho korelačného koeficientu (r hodnota). Výpočet štatistickej významnosti (p hodnota) založená na r hodnote sa realizovala pomocou online aplikácie: https: //www.socscistatistics.com/pvalues/pearsondistribution.aspx. Hodnota p < 0,05 sa považovala za štatisticky signifikantnú.

Výsledky

Do štúdie sme zaradili 23 pacientov (14 žien a 9 mužov) vo veku 23 až 77 rokov. Priemerný vek bol 51,4 (±14,9) rokov. Kontrolnú skupinu tvorilo 9 zdravých dobrovoľníkov (7 žien a 2 muži). Ich priemerný vek bol 39,2 (±15) rokov. 56,5 % pacientov udávalo prítomnosť typických pažerákových refluxných ťažkostí. U 30,4 % pacientov mali PPI efekt na refluxné ťažkosti a u 26,1 % boli na endoskopickom vyšetrení popisované známky erozívnej ezofagitídy.

Priemerná hodnota RSI u pacientov bola 24,1 ± 7,99 bodov (tab. 2).

Hodnoty mediánu, maximálnej a stred -nej frekvencie ciliárneho pohybu boli sig nifikantne nižšie u pacientov s LPR v porovnaní so zdravou skupinou (grafy 1, 2, 4). Minimálna frekvencia bola bez signifikantného rozdielu (graf 3).

Vzhľadom na nižšie hodnoty CBF u pacientov v porovnaní so zdravými dobrovoľníkmi sme sa rozhodli overiť vzťah medzi CBF a mierou symptómov podľa RSI. Takáto korelácia by mohla poukazovať na význam CBF v genéze symptómov pacientov. Zrealizovali sme preto korelačnú analýzu, kde sme spozorovali signifikantnú inverznú koreláciu medzi CBF a RSI (p < 0,04) (graf 5).

Diskusia

Mukociliárny klírens predstavuje dôležitý obranný mechanizmus dýchacích ciest. Je zodpovedný za odstraňovanie hlienu a ochranu respiračného systému pred pôsobením inhalovaných mikróbov a iritačných častíc. Je definovaný časom potrebným na odstránenie inhalovaného aerosólu. Podieľajú sa na ňom viskoelastické vlastnosti hlienu, koordinovaný ciliárny pohyb a frekvencia ich kmitania [13].

Dát ohľadne ovplyvnenia mukociliárneho klírensu gastroduodenálnym refluxátom je málo. Teórie refluxnej etiológie pri vzniku respiračných ťažkostí predpokladajú priame aj nepriame pôsobenie refluxátu. Priamym pôsobením refluxátu na sliznicu dýchacích ciest môže dochádzať k indukcii zápalových zmien, vzniku edému, hypersekrécii hlienu a nadmernej sekrécii zápalových mediátorov [1,2]. K nepriamemu mechanizmu pôsobenia dochádza prostredníctvom nervus vagus. Stimuláciou chemoreceptorov v distálnej časti pažeráka refluxátom dochádza k nadmernej produkcii hlienu v oblasti laryngu prostredníctvom H⁺/K⁺ ATP-ázy, morfologickým zmenám, kašľu, pocitu cudzieho telesa v krku a potrebe odkašliavania [14].

Našu štúdiu sme realizovali v rámci predpokladu ovplyvnenia MCT refluxátom a následným vznikom LPR-like symptómov vrátane recidivujúcich zápalov horných dýchacích ciest. Na stanovenie frekvencie ciliárneho pohybu ako merateľného aspektu MCT sme použili jedinečnú a unikátnu metódu – vysokorýchlostnú videomikroskopiu a soft vérovú analýzu Ciliary Analysis. S jej pomocou je možné stanoviť hodnotu CBF v herzoch (Hz). Výsledky našej práce preukázali signifikantne nižšie hodnoty frekvencie ciliárneho pohybu u pacientov s pozitívnym výsledkom dotazníka RSI oproti zdravým dobrovoľníkom. Signifikantné rozdiely CBF sme pozorovali pri mediáne, maximálnej a strednej frekvencii ciliárneho pohybu respiračného epitelu medzi pacientami a zdravými dobrovoľníkmi.

Okrem zistenia hodnôt CBF bolo našim cieľom zistiť či miera zníženej frekvencie ciliárneho pohybu odráža mieru LPR-like ťažkostí. Preto sme realizovali korelačnú analýzu medzi výsledkom dotazníka RSI, ktorý odráža symptomatickú záťaž pacienta, a mediánom CBF. Preukázali sme signifikantnú inverznú koreláciu medzi mediánom frekvencie ciliárneho pohybu a mierou ťažkostí (výsledkom dotazníka RSI) (p < 0,04). Na základe našich výsledkov môžeme povedať, že pacienti s LPR-like ťažkosťami majú zhoršený mukociliárny klírens.

Priame dáta na porovnanie našich výsledkov k dispozícii nemáme. Nami použitá metodika sa doposiaľ pri sledovaní ovplyvnenia MCT refluxom nepoužila. Dáta získané danou metodikou máme len od detských pacientov z práce Marušiakovej et al. [15]. U 64 detských pacientov zistili pomocou vysokorýchlostnej videomikroskopie s softvérovej aplikácie Ciliary Analysis vyššie hodnoty CBF 6 mesiacov po endoskopickej adenoidektómii [15].

Iné práce, ktoré sledovali ovplyvnenie mukociliárneho klírensu refluxátom, použili na hodnotenie MCT sacharínový test [10,16], ktorý je tradičnou metódou vyšetrovania MCT. Pozostáva z vloženia sodnej soli sacharínu s priemerom 1 mm k dolnej nosovej mušli pacienta, ktorý je následne inštruovaný k prehltnutiu každú minútu. Pocítenie horko-sladkej chuti oznámi vyšetrujúcemu. Uvedené testuje dobu prechodu sacharínu a hodnoty sa porovnávajú s referenčnými hodnotami v minútach. Oneskorená odpoveď sa považuje za nález porušeného mukociliárneho klírensu [10,17]. Delehaye et al. pozorovali u 50 pacientov s pažerákovými refluxnými symptómami a endoskopicky potvrdeným GERD vyššie hodnoty sacharínového testu voči referenčným hodnotám. Pacienti, ktorí mali len mimopažerákové refluxné ťažkosti, mali hodnoty MCT v norme [10]. Vasu et al. sledovali zmeny MCT u 45 pacientov s LPR diagnostikovaným na základe dotazníka RSI a u 45 zdravých dobrovoľníkov. 62 % pacientov s LPR malo predĺžený MCT. Hodnoty MCT boli u všetkých zdravých dobrovoľníkov v norme [16].

Napriek zisteniu nižšej frekvencie ciliárneho pohybu respiračného epitelu u pacientov s LPR-like symptómami a korelácie medzi zníženým CBF a mierou ťažkostí, jednoznačnú kauzálnu súvislosť medzi refluxátom a zníženým CBF dokázať nevieme. Nevieme jednoznačne vylúčiť, že MCT nie je okrem gastroezofageálneho refluxu ovplyvnený aj inými faktormi. K zisteniu mechanizmu priameho ovplyvnenia ciliárneho pohybu refluxátom je potrebné realizovať viacero štúdií obsahujúcich väčší počet pacientov s LPR.

Problém predstavuje náročné stanovenie refluxnej etiológie ťažkostí. V našej štúdii sme diagnózu LPR stanovili na základe dotazníka RSI, všeobecne používanej a uznávanej diagnostickej metódy, ktorá ale má svoje limitácie. Zahŕňa v sebe najčastejšie sa vyskytujúce symptómy LPR, avšak dané ťažkosti nie sú pre dané ochorenie špecifické a vyskytujú sa aj pri iných ochoreniach. Dodávame však, že pacienti pred odoslaním na naše pracovisko absolvovali diferenciálne diagnostický proces, na základe ktorého sa neustanovila iná etiológia ťažkostí.

Ďalšiu limitáciu výsledkov predstavuje fakt, že výsledky použitého dotazníka RSI odrážajú subjektívne hodnotenie ťažkostí. Konečná hodnota dotazníka je u každého pacienta určená jeho individuálnym vnímaním symptómov. Aj percepcia LPR symptómov je u pacientov nad 60 rokov nižšia [18]. Hodnota RSI môže byť ovplyvnená aj tým, že niektorí zaradení pacienti dlhodobo užívali PPI. Napriek tomu, že sú poučení a 10 dní pred vyšetrením PPI neužívajú, v dotazníku RSI sa hodnotia ťažkosti v období posledného mesiaca a tie môžu byť vplyvom liečby miernejšie, čím je aj výsledok RSI nižší.

Na druhej strane priznávame, že sme zámerne upustili od použitia dvojkanálovej pH-metrie s impedanciou pri diagnostike LPR z dôvodu výsledkov našich predchádzajúcich prác, z ktorých konzistentne vyplývajú jej nedostatky. Preukázali sme, že refluxná záťaž na pH-metrii neodráža mieru symptómov ani závažnosť laryngoskopického nálezu a rovnako ani nereflektuje zlepšenie symptómov pacientov na PPI liečbe [19,20].

Vzhľadom na to, že sa jedná o novú metodiku stanovenia CBF, referenčné „fyziologické“ hodnoty nie sú k dispozícii. Rovnako nie sú dostupné ani údaje o vplyve pohlavia na CBF. Ohľadne vplyvu veku na MCT, výsledky štúdií s použitím sacharínového testu prinášajú protichodné výsledky. V niektorých je vek považovaný za nezávislý faktor ovplyvnenia CBF, iné preukázali nižšie hodnoty CBF u staršej populácie [21,22]. Je dôležité zdôrazniť, že ciliárny pohyb sme vyšetrovali pri izbovej teplote, t.j. 20 °C. V prípade ďalšej interpretácie výsledkov je treba myslieť na to, že frekvencia ciliárneho pohybu sa s teplotou mení. V in vitro podmienkach sa CBF medzi teplotou 19 a 32 °C lineárne so stúpajúcou teplotou zvyšuje, medzi 32 a 40 °C dochádza k plató a od teploty 40 °C dochádza k postupnému poklesu CBF [23].

Napriek zisteným signifikantným rozdielom medzi CBF pacientov a zdravých dobrovoľníkov nateraz nepredpokladáme jej priame uplatnenie v diagnostike LPR. Skôr sa domnievame, že v prípade potvrdenia, že uvedená zhoršená kinematika cílií je skutočne navodená refluxom, mohlo by sa jednať o ďalší patogenetický mechanizmus, ktorý sa môže podieľať na vzniku LPR symptómov. Preto bude potrebné zrealizovať korelačné analýzy medzi ciliárnym pohybom a výsledkami pH-metrického impedančného vyšetrenia (napr. počtom a charakterom refluxných epizód či časom expozície kyseline) či laryngoskopickými nálezmi. Ďalšie analýzy budú smerovať k overovaniu či existujú rozdiely CBF medzi pacientami s LPR a pacientami, ktorí majú okrem LPR aj arbitrárne potvrdený GERD (pozitívnym pH-metrickým/impedančným vyšetrením).

Pri zisťovaní kauzálnej súvislosti možno zvažovať aj imunohistochemické vyšetrenie pepsínu v slinách [24]. Viacerí odborníci však majú o prínose vyšetrenia, vzhľadom na nižšie hodnoty senzitivity a špecificity, pochybnosti [25–27], nakoľko pepsín nie je jedinou súčasťou gastroduodenálneho refluxátu. V patogenéze ťažkostí sa uplatňuje aj charakter refluxátu, hodnota pH [28], kyselina chlorovodíková [29,30] či žlčové kyseliny [31,32].

Záver

U pacientov s LPR-like symptómami sú nižšie hodnoty ciliárneho pohybu respiračného epitelu v porovnaní so zdravými dobrovoľníkmi. Miera zníženého pohybu koreluje s mierou ich laryngofaryngeálnych symptómov. Avšak potvrdenie priameho dôkazu účasti gastroezofágového refluxu pri zhoršenom ciliárnom pohybe a mukociliárnom klírense vyžaduje ďalšie dáta.