Detekce superantigenů u izolátů Streptococcus pyogenes na základě dat celogenomové sekvenace

Overview

Streptococcus pyogenes způsobuje rozličná lidská onemocnění od nekomplikovaných infekcí dýchacích cest a kůže až po vážná invazivní onemocnění, která mohou být doprovázena syndromem toxického šoku. Významnými faktory virulence vedle M proteinu kódovaného genem emm jsou pyrogenní exotoxiny, které se považují za superantigeny. V Národní referenční laboratoři pro streptokokové nákazy byly nově zavedeny bioinformatické nástroje pro zpracování dat z celogenomové sekvenace S. pyogenes. Použitím programu SRST2 a platformy BV-BRC byla analyzována WGS data 10 kmenů S. pyogenes izolovaných od pacientů s invazivním onemocněním a byly stanoveny emm typy, sekvenční typy a profily genů kódujících superantigeny. K sestavení sekvencí genomů z krátkých čtení byla zvolena assembly pipeline Unicycler s de novo assemblerem SPAdes.

Klíčová slova:

celogenomová sekvenace – Streptococcus pyogenes – GAS – superantigen

ÚVOD

Streptococcus pyogenes (streptokok skupiny A, Group A Streptococcus, GAS) způsobuje rozličná lidská onemocnění od nekomplikovaných infekcí dýchacích cest a kůže až po vážná invazivní onemocnění spojená s vysokou nemocností a smrtností. Od 80. let 20. století se do popředí zájmu v USA i v Evropě dostaly případy streptokokového syndromu toxického šoku (Streptococcal Toxic Shock Syndrome, STSS), invazivní GAS infekce kůže a měkkých tkání, bakteriémie a sepse [1].

Genom GAS obsahuje geny pro produkci faktorů virulence. Typování GAS je založeno na N-koncové hypervariabilní sekvenci genu emm kódujícího povrchový M protein (anti-phagocytic M protein). Nejčastěji zastoupené emm typy invazivních GAS jsou emm1, emm28 a emm89 [2]. Vedle genu emm některé GAS vykazují v genomu až dva emm-like geny, také známé jako mrp (M-related protein), enn a sic (streptococcal inhibitor of complement). Transkripci těchto genů řídí regulon mga (M-protein trans-acting positive regulator).

Kmeny GAS spojené s invazivním onemocněním produkují také exotoxiny a specifické superantigeny (SAg), které vyvolávají systémovou zánětlivou odezvu. Superantigeny se váží na molekuly MHC II (major histocompatibility complex class II) na povrchu antigen prezentujících buněk a současně na variabilní oblast β řetězce receptoru T lymfocytů. Tato interakce vede k aktivaci velkého množství T lymfocytů produkujících prozánětlivé cytokiny a k potlačení produkce imunoglobulinů [3]. V současné době je známo 13 SAg. Klasickými biochemickými metodami byly identifikovány superantigeny SpeA (streptococcal pyrogenic exotoxin), SpeC, SSA (streptococcal superantigen) a smeZ (streptococcal mitogenic exotoxin Z). Pomocí počítačové analýzy genomů byly dále identifikovány další SAg – SpeG, SpeH, SpeI, SpeJ, SpeK, SpeL, SpeM, SpeQ a SpeR. Geny speG, speJ a smeZ leží na chromozomu. Ostatní geny jsou neseny na profázích nebo na jiných mobilních elementech, jejichž integrace do genomu bakterie silně přispívá ke genomové diverzifikaci GAS a k výskytu vysoce virulentních kmenů.

Metoda celogenomové sekvenace (whole genome sequencing, WGS) poskytuje data, ze kterých lze získat informace o genomu bakterií. V současné době se v některých databázích podstatně navýšil počet popsaných genů GAS, což umožnilo skládání genomů invazivních izolátů. Jedním z programů využívaných v naší studii je SRST2 (Short Read Sequence Typing for Bacterial Pathogens) [4], který pracuje s databází VFDB (Virulence Factor DataBase) [5]. SRST2 umožňuje srovnání genomu vyšetřovaných izolátů s referenční databází genů, a tak stanoví geny SAg přítomné v genomu GAS. Další platformou použitou v naší studii je PubMLST databáze [6] nabízející rozsáhlou škálu nástrojů k analýze WGS dat a platforma Bacterial and Viral Bioinformatic Center (BV-BRC) [7]. Platforma BV-BRC pracuje s databázemi VFDB a Victor [8].

MATERIÁLY A METODY

Kmeny S. pyogenes

V rámci naší studie bylo celogenomové sekvenaci podrobeno deset izolátů invazivních GAS. Kmeny invazivních GAS byly získány z klinického materiálu pacientů s invazivním onemocněním v letech 2018–2019. Uvedené kmeny byly spojeny s diagnózami sepse, septický šok, flegmóna. Sedm z osmi pacientů zemřetypů, a to 5 kmenů typu emm1 a 5 kmenů typů emm28. Kmeny typu emm28 označené 96-19, 95-19 a 88-19 byly izolovány od jednoho pacienta v časovém rozmezí tří dnů a z materiálu rozličných biologických lokalit. Souhrn kmenů, klinické i epidemiologické informace o pacientech jsou uvedeny v tabulce 1.

Extrakce DNA

Z kmenů invazivních GAS byla izolována deoxyribonukleová kyselina (DNA) použitím kitu MagAttract® HMW DNA Mini kit (QIAGEN). Izolovaná DNA byla následně podrobena kvalitativní kontrole s použitím gelové elektroforézy a kvantitativní kontrole spektrofotometrickým měřením koncentrace DNA.

Celogenomová sekvenace a úprava dat

Příprava knihoven a celogenomová sekvenace byla provedena na pracovišti EMBL (European Molecular Biology Labolatory, Heidelberg, Německo) s využitím přístroje Illumina MiSeq. Našemu pracovišti byla následně poskytnuta raw WGS data ve formátu fastq souborů. K sestavení genomů z primárních raw WGS dat se použila platforma BV-BRC, která využívá assembly pipeline Unicycler verze v0.4.8 [9] s de novo assemblerem SPAdes [10]. Hodnota parametru K-mer byla zvolena 127. U dvou izolátů byla využita hodnota parametru K-mer 115. Průměrný počet kontigů v sestavených genomech byl 55 (47–62).

Zpracování dat z celogenomové sekvenace 

K emm typování invazivních GAS se použila databáze PubMLST podporovaná platformou Bacterial Isolate Genome Sequence Database (BIGSdb) [11]. Ke zjištění přítomnosti genů virulentních faktorů speA, speC, speG, speH, speI, speJ, speK, speL, speM, smeZ a ssa a emm z dat WGS byl použit nástroj komplexní analýza genomu (Comprehensive Genome Analysis) platformy BV-BRC a program SRST2.

VÝSLEDKY A DISKUSE

Použitím databáze PubMLST byl pro všechny izoláty stanoven emm typ (viz tab. 1). Emm typy byly dále ověřeny použitím programu SRST2 a platformy BV-BRC, které zpracovávají primární raw WGS data. Program SRST2 potvrdil totožné emm typy všech kmenů. Platforma BV-BRC potvrdila emm geny u všech izolátů a umožnila vizualizovat uspořádání emm a emm-like genů. Mga locus u pěti kmenů typu emm28 označené 45-19, 88-19, 95-19, 96-19 a 385-19 obsahoval geny mga, mrp, emm, enn a scpA (C5a peptidáza). Další variantu uspořádání emm a emm-like genů vykazují izoláty typu emm1 označené 39-18, 86-18, 93-18, 213-18 a 62-19, kde se ve Mga lokusu vyskytují geny mga, emm, sic, scpA a je zde začleněn gen mlp (mobile element protein).

U všech deseti kmenů invazivních GAS se WGS analýzou s použitím platformy BV-BRC určil MLST (multilocus sequence typing) sekvenční typ (ST). Kmeny emm1 patří shodně k ST-28 a kmeny emm28 k ST-52.

Distribuce streptokokových pyrogenních toxinů speA, speC, speG, speH, speI, speJ, speK, speL, speM a streptokokového mitogenního toxinu smeZ a streptokového superantigenu ssa byla u kmenů stejného emm typu stejná. Potvrdila se jak použitím programu SRST2 pracujícího s referenční databází VFDB, tak komplexní analýzou genomu pomocí platformy BV-BRC pracující s referenčními databázemi VFDB a Victors.

Na základě alignmentu genomů všech izolátů invazivních GAS typu emm28 provedených použitím platformy BV-BRC se domníváme, že kmeny 95-19 a 96-19 izolované od jednoho pacienta jsou shodné, přičemž izolát 88-19 od téhož pacienta je geneticky odlišný.

ZÁVĚR

Tato studie vedla k zavedení možnosti využití programu SRST2 (tab. 2) a nástrojů platforem PuMLST a BV-BRC ke zpracování WGS dat invazivních GAS do NRL pro streptokokové nákazy. Analýza WGS dat invazivních GAS různými nástroji přispěje k upřesnění konfliktních výsledků týkajících se profilů streptokokových superantigenů publikovaných v literatuře. Streptokokové superantigeny se považují za významné faktory virulence, i když jejich spojitost s konkrétními klinickými projevy se nepodařilo definitivně prokázat. Geny streptokokových superantigenů mohou být považovány za markery přítomnosti a přenosu profágů. Přítomnost genů superantigenů v genomech invazivních GAS je podmínka nutná, nikoliv však dostačující, k jejich expresi na povrchu mikroorganismu nebo jako extracelulární produkt.

Podpořeno MZ ČR – RVO („Státní zdravotní ústav –SZU, 75010330“)

Do redakce došlo dne 8. 12. 2022.

Adresa pro korespondenci:
Ing. Renata Veselá
Státní zdravotní ústav
Šrobárova 49/48
110 00 Praha 10
e-mail: renata.vesela@szu.cz