Vliv lipofosfonoxinů na inhibici bakteriální kolonizace kostních cementů

Overview

Cíl práce:
Cílem práce bylo stanovení schopnosti lipofosfonoxinu DR5026 inhibovat tvorbu bakteriálního biofilmu na povrchu kostního cementu a posoudit možnost vývoje bakteriální rezistence.

Materiál a metodika:
Kostní cement (Hi-Fatigue Bone Cement 2x 40, aap Biomaterials GmbH, Germany) byl polymerizován s lipofosfonoxinem DR5026. Vzorky cementů byly kultivovány s bakteriální suspenzí Staphylococcus epidermidis CCM7221 o hustotě inokula 10⁶ CFU/ml. Po inkubaci 3, 24 a 48 hodin při 35 °C byl vyhodnocen počet bakterií adherovaných na vzorku a byla stanovena jejich růstová křivka. Kmeny Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa a Streptococcus agalactiae byly ve 14 cyklech vystaveny subinhibičním koncentracím DR5026 a byly sledovány minimální inhibiční koncentrace (MIC).

Výsledky:
Po 3 hodinách kultivace v bakteriálním inokulu o iniciální koncentraci 10⁶ CFU/ml byl počet izolovaných kolonií z cementového vzorku s DR5026 o 2 řády nižší než z kontrolního cementového vzorku. Po 24 a 48 hodinách inkubace zůstává počet CFU u ošetřeného cementu 50, zatímco z kontrolních cementů bylo vykultivováno 10⁹ CFU. Při sestavení růstových křivek bakterií adherovaných na cementech je patrný inhibiční vliv lipofosfonoxinu na jejich růst a množení, zvláště po 48 hodinách. Po 14 cyklech opakované expozice subinhibičním koncentracím DR5026 nedošlo u testovaných kmenů k navýšení MIC.

Závěr:
Byl prokázán antibakteriální účinek lipofosfonoxinu DR5026 ve vazbě na kostní cement a inhibice tvorby bakteriálního biofilmu. Opakované vystavení testovaných bakterií subinhibičním koncentracím použitého lipofosfonoxinu nevedlo k indukci rezistence, respektive ke zvýšení MIC.

Klíčová slova:
kostní cement – infekce kloubních náhrad – lipofosfonoxiny – antibakteriální účinek – biofilm

ÚVOD

Jako kostní cement se v ortopedii označuje polymetylmetakrylát (PMMA), který vzniká polymerizační reakcí po smíchání práškové směsi PMMA a tekutého monomeru. V ortopedické praxi je využíván již přes 60 let v různých indikacích. Používá se běžně k fixaci kloubních náhrad, při terapii kostních nádorů, kostních a kloubních infekcí. Z biomechanického hlediska je důležitá především pevnost tohoto materiálu v kompresi. Při léčbě infekcí je významná schopnost PMMA absorbovat a poté postupně uvolňovat antibiotika.

Infekce kloubní náhrady (IKN) je jednou z nejčastějších časných komplikací endoprotetiky. Odhaduje se, že postihuje 1–5 % všech pacientů po primární endoprotéze, u reoperací je pravděpodobnost vzniku IKN ještě vyšší [24]. Typicky se manifestuje v průběhu 3–12 měsíců od operace. V poslední době se objevují práce poukazující na vyšší incidenci, než se uvádělo dříve [31]. IKN představuje závažný problém nejen v kontextu dopadu na pacienta, ale také v souvislosti s vysokou finanční náročností léčby [9]. Vznik IKN je multifaktoriální, ačkoliv ke kontaminaci rány dojde nejčastěji na operačním sále. Významnou roli hraje celkový stav hostitele (např. stav imunity, předchozí infekce, diabetes mellitus) a především jeho imunitního systému, který se zřejmě u pacientů s IKN není schopen ubránit bakteriální expozici spojené s operačním výkonem. Důležitou roli sehrávají vlastnosti původce, virulence, citlivost k antimikrobiálním látkám a schopnost adherovat na cizorodé povrchy [9, 27]. Na povrchu kostních cementů vytváří bakterie celkem snadno biofilm, v němž adherují k povrchu a produkují polysacharidovou hmotu, která je obklopuje. Vznikají složité struktury připomínající tkáně vyšších organismů. Bakterie v biofilmu jsou chráněny proti zásahům imunitního systému hostitele a rovněž jsou odolnější k antibiotické léčbě než planktonické buňky [30]. Standardní antibiotická léčba účinná při ostatních infekcích, jako jsou např. pneumonie, při léčbě IKN selhává. Nejčastěji izolované agens u IKN jsou stafylokoky a streptokoky [27, 20]. Tande ve své přehledové práci hodnotící celkem 2 435 případů IKN uvádí výskyt grampozitivních bakteriálních původců v 69 % (Staphylococcus aureus 27 %, koaguláza negativní Staphylococcus sp. 27 %, Streptococcus sp. 8 %, Enterococcus sp. 3 %, Propionibacterium acnes 4 %), gramnegativní tyčky byly zachyceny v 9 %, polymikrobiální infekce v 15 %. [24]. Velmi podobnou strukturu bakteriálních původců uvádí i jiní autoři [10, 19].

Nejlepší strategií v boji s bakteriální IKN zůstává prevence. Jedním z nejefektivnějších postupů je kombinovat celkové a lokální podání antibiotika v kostním cementu. Kostní cement s navázanou antibakteriální látkou si však musí mimo vlastní antibakteriální aktivitu zachovat mechanickou odolnost a biokompatibilitu. Množství přidané antimikrobiální susbstance je tedy limitováno. Výhodou cementů kombinovaných s antibiotiky je dosažení vysoké lokální koncentrace antibiotika bez rizika celkových komplikací a toxicity, čehož nelze dosáhnout při systémové aplikaci [4]. V praxi se pro prevenci a terapii infekcí muskoskeletárního aparátu používá například kostní cement obohacený gentamicinem (Palacos R + G, Hi-Fatigue G, Cemex Genta aj.), erytromycinem a kolistinem (Simplex PE + C), vankomycinem a gentamicinem (Vankogen X) nebo klindamycinem (Copal) [8].

Možným rizikem při používání kostních cementů s antimikrobiální látkou je vznik bakteriální rezistence. Po aplikaci cementu jsou organismus hostitele i bakterie vystaveny dlouhodobé expozici antimikrobiální látky. Antibiotika se z kostního cementu uvolňují dlouhodobě, ale eluce dostatečně vysokých účinných koncentrací probíhá pouze v několika prvních dnech po aplikaci cementu. Množství a doba eluce antibiotika z cementu je ovlivněna typem cementu, jeho povrchem, zpracováním, podmínkami prostředí a v neposlední řadě typem a množstvím přidaného antibiotika [4, 8, 18]. Dlouhodobé uvolňování subinhibičních koncentrací antibiotika představuje ideál­ní podmínky pro selekci bakteriální rezistence [4, 17].

Z důvodu rostoucí rezistence bakterií na antimikrobiální léčiva je nutné hledat jiné možnosti a postupy v prevenci a léčbě IKN. Lipofosfonoxiny jsou nedávno objevené látky, u kterých byla zjištěna antibakteriální aktivita proti grampozitivním bakteriím, na které působí baktericidně destrukcí cytoplazmatické membrány [21]. Jsou to uměle vytvořené modulární látky vycházející ze struktury fosfonoxinů [26], skládají se ze čtyř strukturních modulů: nukleosid, iminocukr, hydrofobní lipofilní alkylový řetězec a spojovací fosfonát [22], který spojuje jednotlivé moduly (schéma 1).

K účinným lipofosfonoxinům patří látka DR5026 (schéma 2) vykazující antibakteriální aktivitu proti grampozitivním bakteriím včetně multirezistentních kmenů, jako jsou vankomycin-rezistentní Enterococcus faecium nebo methicilin-rezistentní Staphylococcus aureus [21].

Cíl práce

Cílem předložené práce bylo stanovení schopnosti látky DR5026 inhibovat tvorbu bakteriálního biofilmu na povrchu kostního cementu a posoudit možnost vývoje bakteriální rezistence.

MATERIÁL A METODY

Za sterilních podmínek byl připraven kostní cement (Hi-Fatigue Bone Cement 2x 40, aap Biomaterials GmbH, Germany) s testovaným lipofosfonoxinem DR5026 (Ústav organické chemie a biochemie AV ČR v. v. i.). Bylo smícháno 300 mg DR5026 s 5 g kostního cementu a polymerizováno přidáním 2,5 ml polymerizačního média. Z připraveného cementu byly vytvarovány kuličky o průměru cca 5 mm. Jako kontrola byl použit cement, který byl připraven ze stejné výrobní šarže, avšak bez přidané antimikrobiální látky.

Christensenovou metodou byla u kmene Staphylococcus epidermidis CCM7221 (Česká sbírka mikroorganismů, Brno; pozitivní kontrola pro detekci tvorby biofilmu a ica operonu) ověřena schopnost tvorby biofilmu statickou kultivací v kultivačním mediu (Brain heart infusion, HIMEDIA, s 0,5 % glukózy) při 35 °C [6, 23, 25]. Testování bylo provedeno v mikrotitrační destičce typu P (GAMEDIA). Počáteční koncentrace inokula odpovídala 10⁶ CFU/ml. Po 24hodinové inkubaci při 35 °C byla destička šetrně promyta vodou a utvořený biofilm byl fixován přidáním 200 μl 99% metanolu na dobu 15 minut. Po odsátí a vyschnutí byly jamky nabarveny přidáním 160 μl 1% krystalové violeti na dobu 10 minut, důkladně promyty vodou a fixované barvivo rozpuštěno přidáním 160 μl 33% kyseliny octové. Intenzita zbarvení byla hodnocena spektrofotometricky při vlnové délce 570 nm. Silná produkce biofilmu je potvrzena, pokud optická denzita zbarvení čtyřnásobně překročí optickou denzitu negativní kontroly zvětšenou o 3 směrodatné odchylky vypočítané ze 4 měření. Jako negativní kontrola bylo použito kultivační médium bez bakterie [25].

Antibakteriální účinnost látky DR5026 u Staphylococcus epidermidis CCM7221 byla testována pomocí standardní diluční mikrometody určením minimální inhibiční koncentrace (MIC) potřebné k inhibici růstu bakterie a minimální baktericidní koncentrace (MBC) potřebné k usmrcení. Testování bylo prováděno v mikrotitračních destičkách, vzorky byly ředěny geometrickou řadou v kultivačním médiu (Brain heart infusion, HIMEDIA) na koncentrace 200–1,56 mg/l. Do destiček bylo očkováno standardní množství testovaného mikroba – hustota inokula odpovídala 10⁶ CFU/ml. Po 24hodinové inkubaci při 35 °C byla odečtena MIC jako nejnižší koncentrace testované látky, která inhibovala viditelný růst mikroorganismu. Jamky bez viditelného růstu byly inokulovány na krevní agar pro stanovení MBC [14, 29].

Pro sledování počtu a aktivity adherovaných buněk na kostních cementech byly vzorky umístěny do 12jamkových panelů a zality 3 ml kultivačního média s bakte­riální suspenzí Staphylococcus epidermidis CCM7221. Počáteční hustota bakteriálního inokula odpovídala 10⁶ CFU/ml. Následovala statická inkubace po dobu 3, 24 a 48 hodin, poté byly vzorky z jamek vyjmuty, třikrát opláchnuty sterilním fyziologickým roztokem a umístěny do 2 ml kultivačního média (Brain heart infusion, HIMEDIA, s 0,5 % glukózy) ve zkumavce. Pro uvolnění adherovaných buněk následovala sonikace a důkladné roztřepání. Do jamek sterilní mikrotitrační destičky bylo následně přeneseno 100 µl sonikovaného kultivačního média a destička byla umístěna do spektrofotometru se zabudovaným inkubátorem. Statická inkubace probíhala 24 hodin při 35 °C, v intervalu 1 hodiny byla po dvouminutovém roztřepání měřena optická denzita (OD) při 630 nm. Ze získaných hodnot byla sestavena růstová křivka [1]. Zároveň bylo 100 µl sonikovaného média přeneseno na MH agar (Trios) a rozetřeno inokulační hokejkou. Po 24hodinové inkubaci při 35 °C byly spočítány narostlé kolonie.

K testování indukce rezistence, respektive zvýšení hodnot MIC, byly použity kmeny Staphylococcus aureus CCM4223, Enterococcus faecalis CCM4224, Pseudomonas aeruginosa CCM3955 (Česká sbírka mikroorganismů, Brno) a Streptococcus agalactiae AV2006 (sbírka Ústavu mikrobiologie LF UP v Olomouci). Minimální inhibiční koncentrace látky DR5026 u testovaných bakteriálních kmenů byly stanoveny opět standardní diluční mikrometodou [14, 29].

Indukce rezistence byla provedena v mikrotitrační destičce opakovanou expozicí výše uvedených bakteriálních kmenů subinhibičním koncentracím testované látky DR5026, která byla v kultivačním médiu (Brain heart infusion, HIMEDIA) exponenciálně naředěna na koncentrace 1,6–200 mg/l. Připravené destičky byly skladovány při -20 °C. Do rozmražené mikrotitrační desky byl inokulován příslušný bakteriální kmen. Konečná koncentrace inokula v jamce byla 10⁶ CFU/ml. Destičky byly inkubovány při 35 °C po dobu 24 hodin. Po inkubaci bylo 10 µl bakteriální suspenze z jamky s nejvyšší subinhibiční koncentrací testované látky vyočkováno na krevní agar a inkubováno 24 hodin při 35 °C. Získané bakterie byly použity pro další cyklus. Popsaný postup představuje 1 cyklus indukce rezistence a celkem bylo provedeno 14 cyklů. Po posledním cyklu byla stanovena MIC původního kmene a srovnána s MIC po indukci [11].

Jako kontrolní látka pro indukci vzniku rezistence byl použit ciprofloxacin, ke kterému vzniká rezistence velmi rychle [12, 15]. Ciprofloxacin byl testován za stejných podmínek v koncentracích 0,06–8 mg/l.

VÝSLEDKY

Inhibice tvorby biofilmu

Christensenovou metodou byla za použitých podmínek u Staphylococcus epidermidis CCM7221 potvrzena silná produkce biofilmu. Minimální inhibiční koncentrace látky DR5026 byla stanovena na 12,5 mg/l a odpovídala hodnotě minimální baktericidní koncentrace.

Počet bakterií uvolněných pomocí sonikace a roztřepání biofilmu z testovaného cementu se lišil v závislosti na době inkubace. Po tříhodinové inkubaci kostního cementu kombinovaného s látkou DR5026 bylo z cementové kuličky uvolněno 50 CFU Staphylococcus epidermidis CCM7221, zatímco z neošetřeného cementu bylo vykultivováno 10³ CFU. Po 24- a 48hodinové expozici zůstával počet kolonií u ošetřeného cementu 50 CFU, zatímco u kontrolního neošetřeného cementu dosahoval hodnot 10⁹ CFU.

Získané růstové křivky potvrzují antibakteriální účinek látky DR5026 (grafy 1–3). Po tříhodinové inkubaci cementů v hustém bakteriálním inokulu odpovídajícím koncentraci 10⁶ CFU/ml dochází na cementu s obsahem látky DR5026 k opožděnému nárůstu bakteriální masy. Exponenciální fáze růstové křivky u neošetřeného cementu nastává po 7 hodinách, zatímco u cementu s obsahem látky DR5026 až po 15 hodinách (graf 1). Stejný efekt je patrný i v případě cementů inkubovaných s bakteriální suspenzí po dobu 24 hodin (graf 2). Po 48hodinové inkubaci cementové kuličky s obsahem látky DR5026 dochází jednak k opoždění nástupu exponenciální fáze růstu a dále ke snížení nárůstu bakteriální masy pod hodnotou kontroly, optická denzita bakteriální masy je nižší o 38 % oproti kontrole (graf 3).

Indukce rezistence

MIC látky DR5026 byla u Staphylococcus aureus CCM4223 stanovena na 25 mg/l, v případě Enterococcus faecalis CCM4224 činila 6,2 mg/l, u Pseudomonas aeruginosa CCM3955 > 200 mg/l a Streptococcus agalactiae AV2006 3,1 mg/l. Po 14 krocích opakované expozice testovaných bakterií subinhibičním koncentracím se hodnoty MIC látky DR5026 nezměnily (tab. 1). Naopak u ciprofloxacinu byl zaznamenán rozdíl, MIC původního kmene Pseudomonas aeruginosa byla 0,25 mg/l, po indukci dosáhla hodnoty 4 mg/l. Opakovaná expozice kmene Staphylococcus aureus subinhibičním koncentracím ciprofloxacinu rovněž vedla ke vzniku rezistence, respektive zvýšení MIC z 0,1 mg/l na 2 mg/l (viz tab. 1).

DISKUSE

V předložené studii byl prokázán in vitro silný antibakteriální a antibiofilmový efekt kostního cementu obohaceného látkou ze skupiny lipofosfonoxinů. K demonstraci efektu byl použit koaguláza-negativní stafylokok, potenciálně nejzávažnější původce IKN. Jedná se o první studii popisující zmiňovaný účinek lipofosfonoxinů v ortopedické aplikaci.

Lipofosfonoxin v kombinaci s kostním cementem by mohl být potenciálně významnou alternativou k dnes široce využívaným antibiotikům. Antibiotika jsou do kostního cementu přidávána již více než 40 let [5] a jejich účinnost byla opakovaně doložena [2]. Významnou výhodou antibiotiky obohaceného cementu je dosažení vysoké lokální koncentrace, které by nebylo možné dosáhnout při systémové aplikaci. Používání cementů s antibiotiky má však i své nevýhody. Množství přidaného antibiotika je limitováno biomechanickými vlastnostmi cementu [4]. Problémem může být i volba antibiotika, protože nelze předem odhadnout, jaká bakterie se bude podílet na infekci a jakou bude mít citlivost [17]. Některá antibiotika, například gentamicin, jsou nefrotoxická a nelze predikovat, zda se u pacienta s antibiotickým cementem v budoucnu nerozvine renální selhání [28]. Významným faktorem je také uvolňování antibiotika z cementu. Gallo et al. ve své práci prokázali, že z kostního cementu Vancogen X se uvolňuje vankomycin i gentamicin, a to po dobu 8 dní [8]. S dlouhodobým uvolňováním subinhibičních koncentrací antibiotik narůstá riziko selekce rezistentních kmenů [4, 13, 16]. Corona et al. popisují signifikantně vyšší výskyt grampozitivních koků rezistentních k aminoglykosidům (gentamicinu a tobramycinu), pokud byl použit cement s obsahem aminoglykosidů [7].

Z výše zmíněných důvodů je vyvíjena celá řada strategií a protiinfekčních povrchových úprav ortopedických materiálů, od prevence bakteriální adheze a adsorpce, přes baktericidní povrchy na bázi kovů, organických či anorganických látek až k takzvaným „chytrým“ povrchům [9]. Byly publikovány práce hodnoticí antibakteriální a antibiofilmové vlastnosti PMMA obohaceného chitosanem, stříbrem, antibakteriálními peptidy a dalšími látkami [3]. Největším problémem není antibakteriální a antibiofilmový efekt uvedených látek, ale dosažení těchto účinků na povrchu PMMA a v jeho bezprostředním okolí (pokrytí tzv. mrtvého prostoru) při uchování biokompatibility takto upraveného kostního cementu. V případě PMMA pro preventivní účely musí být současně zachovány také požadované mechanické vlastnosti materiálu.

Lipofosfonoxiny nejsou registrované pro použití v humánní medicíně. Jedná se o nově objevené látky s prokázanou účinností proti grampozitivním bakteriím včetně rezistentních kmenů [21], které představují slibnou možnost dalšího vývoje nejen v oblasti prevence IKN. Byl prokázán antibiofilmový účinek látky DR5026, a ani po 14 cyklech nedošlo ke zvýšení hodnot MIC této látky u testovaných bakterií. Získané výsledky jsou podle našeho názoru jasným důkazem inhibice tvorby biofilmu. Z obohacených kuliček cementu bylo po 3, 24 i 48 hodinách kultivace izolováno na MH agaru vždy 50 kolonií stafylokoka. Tyto uvolněné bakterie se ale chovají odlišně při sledování růstových křivek. Dochází k opožděnému nástupu exponenciální fáze i k nižšímu množství bakteriální masy. Bakterie zůstávají živé, ale je ovlivněn jejich růst a množení. Doba testování pouze 48 hodin byla zvolena záměrně, v klinické praxi má zásadní význam pro vznik IKN prvních několik hodin po operaci [9]. Také z hlediska laboratorního průkazu biofilmu je optimální doba sledování do 48 hodin. Poté může docházet k odlučování biofilmu díky nižší soudržnosti biofilmové vrstvy vlivem regulačního quorum-sensing systému [23].

Zajímavým jevem je tvar růstové křivky stafylokoka na neupraveném cementu. Na konci exponenciální fáze růstu vzniká vlna s vyšší optickou denzitou. Tento jev jsme zaznamenali za stejných testovacích podmínek i v jiných experimentech, ale pouze u stafylokoků. Možným vysvětlením by mohla být změna ve vzájemném uspořádání stafylokoků (dvojice, čtveřice, nepravidelné shluky) při přechodu do stacionární fáze.

Zjištěné údaje však nejsou pro možnosti využití lipofosfonoxinů v této indikaci dostatečné. Cílem publikace bylo upozornit na možnost inhibice bakteriálního biofilmu lipofosfonoxinem I. generace. Jedná se o pilotní studii testování kostního cementu, při jehož přípravě byl do navážky přidán lipofosfonoxin v jedné koncentraci. Zatím nebyl vypracován standardní postup a stanoveno optimální množství lipofosfonoxinu v nosných materiálech. Antimikrobiální vlastnosti „hand-made“ cementů nejsou konstantní, jsou závislé na technice výroby, způsobu míchání a vzniklé konzistenci cementu [19]. Uvolňování z vazby na cement a stanovení koncentrace lipofosfonoxinu v různých prostředích bude předmětem dalšího testování, které plánujeme zároveň s testováním nových generací lipofosfonoxinů.

ZÁVĚR

V řešení IKN mají stále důležitou roli cementy obohacené antibiotiky, ale zároveň jsou rozšiřovány alternativní možnosti s cílem redukovat, nejlépe však zcela eliminovat rizika, která s sebou používání cementů s antibiotiky přinášejí. Slibné řešení přinášejí lipofosfonoxiny, které lze vázat na cementy. Na základě výsledků naší studie byl prokázán antibakteriální účinek lipofosfonoxinu DR5026 ve vazbě na kostní cement a inhibice tvorby bakteriálního biofilmu. Za velmi důležitý lze považovat výsledek, že při opakované expozici bakterií subinhibičním koncentracím použitého lipofosfonoxinu nebyl prokázán vznik bakteriální rezistence. Případnému využití lipofosfonoxinů pro prevenci a léčbu IKN ale musí předcházet další studie týkající se toxicity, eluce a difuze látky z cementu do okolních tkání, způsobu přípravy, stability a v neposlední řadě změn mechanických vlastností obohaceného cementu.

Práce byla podpořena vnitřním grantem LF UP v Olomouci (LF_2015_035) a grantem TA02010035 (TAČR, Technological Agency of the Czech Republic).

Do redakce došlo dne 17. 12. 2015.

Adresa pro korespondenci:

Mgr. Renata Večeřová

Ústav mikrobiologie LF UP v Olomouci

Hněvotínská 3

779 00 Olomouc

e-mail: renata.vecerova@fnol.cz