Význam stanovovania nazálneho oxidu dusnatého u detí – prvé skúsenosti

Overview

Úvod:
Oxid dusnatý (NO) pôsobí v dýchacom systéme ako neurotransmiter neadrenergnej necholinergnej mediácie a významne participuje na regulácii fyziologických funkcií. Významné je jeho pôsobenie na hladké svaly, cievy a priedušky. Oxid dusnatý difunduje do lúmenu dýchacích orgánov a následne môže byť meraný citlivým detektorom. Význam merania NO vo vydychovanom vzduchu sa potvrdil v diagnostike aj v optimalizácii liečby bronchiálnej astmy. V súčasnosti sa pozornosť zameriava na stanovenie nazálneho oxidu dusnatého (nNO) a možnosti jeho využitia v klinickej praxi. Vyšetrenie nNO nie je doposiaľ štandardizované a jeho klinický význam ako aj možnosti využitia sa stále hľadajú.

Metodika:
Do prospektívnej štúdie bolo zaradených 60 detí vo veku 2–12 rokov, ktorým bola vykonaná endoskopická adenotómia v celkovej anestézii na Klinike otorinolaryngológie a chirurgie hlavy a krku, UK JLF a UNM v Martine. Autori stanovovali koncentráciu nNO a analyzovali rozdiely nNO vzhľadom na vek, pohlavie, veľkosť adenoidných vegetácií, prítomnosť atopie a kolonizáciu horných dýchacích orgánov patogénnymi baktériami.

Výsledky:
Priemerná koncentrácia nazálneho oxidu dusnatého v súbore bola 337 ± 36 ppb. Mladšie deti (≤5 rokov) mali signifikantne nižšiu koncentráciu nNO v porovnaní so staršími deťmi (p <0,05). Identifikácia patogénnych baktérií v nosohltane bola spojená so signifikantne zvýšenou koncentráciou nNO (p <0,05). Rozdiely v koncentrácii nNO medzi pohlaviami, pravou a ľavou časťou nosovej dutiny sme nezaznamenali (p >0,05). Veľkosť adenoidných vegetácií ani prítomnosť atopie nemala vplyv na koncentráciu nNO (p >0,05).

Záver:
Nazálny oxid dusnatý je možné detegovať aj u malých detí. Meranie nNO je neinvazívna vyšetrovacia metóda, ktorá môže prispieť k diagnostike ochorení horných ako aj dolných dýchacích orgánov. Zmeny v oblasti nNO môžu signalizovať obštrukciu ako aj zápal horných dýchacích orgánov.

Kľúčové slová:
oxid dusnatý, horné dýchacie orgány, adenoidné vegetácie, patogénne baktérie

Úvod

Oxid dusnatý (NO) je z fylogenetického hľadiska veľmi starý mediátor a podieľa sa na veľkom množstve fyziologických regulácií a patofyziologických procesov od cievneho tonusu cez zápal až po behaviorálne poruchy. V dýchacom systéme pôsobí ako neurotransmiter neadrenergnej necholinergnej mediácie a významne participuje na regulácii fyziologických funkcií. Významné je jeho pôsobenie na hladké svaly, cievy a priedušky. V hladkom svale dýchacích orgánov dochádza pôsobením NO k jeho relaxácii. Prostredníctvom NO môže byť ovplyvnená hyperreaktivita dýchacích orgánov. Závisí na stupni aktivácie indukovateľnej NO-syntázy. V hladkom svale ciev spôsobí NO vazodilatáciu bronchov, ktorá môže podmieňovať zvýšené odplavenie bronchokonstriktorov. Môže byť tiež príčinou nadmernej exsudácie, vzniku edému a zápalu. Dôležitú funkciu má NO v epitelových bunkách, v regulácii mukociliárneho transportu [1]. Oxid dusnatý vplýva aj na imunitný systém. Má prozápalové, ale aj protizápalové účinky. Pre prozápalové mechanizmy NO je typická zvýšená infiltrácia a znížená apoptóza eozinofilov, zvýšená permeabilita ciev a rezistencia v dýchacích orgánoch. Protizápalové mechanizmy pôsobením NO znižujú chemotaxiu a aktivitu leukocytov, znižujú aktiváciu mastocytov a zvyšujú apoptózu eozinofilov. NO sa zúčastňuje aj na nešpecifických obranných reakciách organizmu proti vírusom, baktériám a parazitom. V leukocytoch je NO produkované relatívne vo veľkom množstve. Môže dosiahnuť až toxické hladiny, ktoré sú potrebné k eliminácii týchto patogénov [1, 2].

Oxid dusnatý voľne difunduje do lúmenu dýchacích orgánov a následne môže byť meraný citlivým detektorom. Význam merania NO vo vydychovanom vzduchu sa potvrdil v diagnostike ako aj v optimalizácii liečby chorôb dolných dýchacích orgánov, predovšetkým bronchiálnej astmy [3, 4]. V súčasnosti sa pozornosť zameriava na stanovenie nazálneho oxidu dusnatého (nNO), a to tak pri ochoreniach horných ako aj dolných dýchacích orgánov. Zmeny v oblasti nNO môžu signalizovať obštrukciu ako aj zápal horných dýchacích orgánov (HDO). Vyšetrenie nNO nie je doposiaľ štandardizované a jeho klinický význam ako aj možnosti využitia sa stále hľadajú.

Materiál a metodika

Dizajn štúdie

Do prospektívnej štúdie bolo zaradených 60 detí vo veku 2–12 rokov, ktorým bola vykonaná endoskopická adenotómia v celkovej anestézii na Klinike otorinolaryngológie a chirurgie hlavy a krku, UK JLF a UNM v Martine. Adenotómia bola indikovaná pre obturáciu nosohltana a recidivujúce infekcie horných dýchacích orgánov.

Podľa veku boli pacienti rozdelení do 3 skupín: A. ≤5 rokov, B. 6–9 rokov, C. 10–12 rokov. Veľkosť faryngeálnej tonzily sme stanovili predoperačne endoskopickým vyšetrením. Podľa obturácie nosohltana lymfoepitelovým tkanivom sme hltanovú mandľu rozdelili do troch stupňov: I. stupeň – po horný okraj choány, II. stupeň – do polovice choány, III. stupeň – obturácia celej choány.

Zo súboru boli vyradení pacienti:

• s recidivujúcimi tonzilitídami (zápalom podnebných mandlí),
• so zvýšeným C-reaktívnym proteínom,
• s infekciou horných dýchacích orgánov počas 2 týždňov pred endoskopickou adenotómiou,
• ktorým boli podávané lokálne a/alebo celkové antibiotiká v priebehu 4 týždňov pred endoskopickou adenotómiou,
• ktorí užívali lieky s možným efektom na výsledok prick-testov (celkové/lokálne antihistaminiká alebo kortikosteroidy),
• bez úplnej dokumentácie.

Všetci pacienti a ich zákonní zástupcovia boli informovaní o charaktere štúdie a podpísali informovaný súhlas. Štúdia bola schválená Etickou komisiou Jesseniovej lekárskej fakulty Univerzity Komenského v Martine.

V sledovanom súbore pacientov sme určovali mikrobiologický nález v strednom nosovom priechode a v noso-hltane, prítomnosť atopie a stanovovali sme koncentráciu nazálneho oxidu dusnatého.

Mikrobiologické vyšetrenie

Pred plánovaným výkonom v celkovej anestézii sme odobrali ster zo stredného nosového priechodu a z nosohltana pomocou sterilného vatového tampónu pod endoskopickou kontrolou. Tampón s odobratou vzorkou sme v sterilnom transportnom systéme (skúmavka s pôdou Stuart) v priebehu 2–4 hodín zaslali na mikrobiologické vyšetrenie. Vzorka sa naočkovala na kultivačné pôdy – ovčí krvný agar (Columbia Bio-Rad), čokoládový agar s bacitracínovým diskom, Mac Conckey agar (Bio rad) a vložili sa do inkubátora s 7% CO₂ pri teplote 37° C. Kultivačné pôdy sa hodnotili po 18–24 hodinách inkubácie. Na detekciu pomaly rastúcich mikroorganizmov sa doba inkubácie predĺžila na 48 hodín. Jednotlivé kolónie baktérií boli identifikované na základe ich typickej morfológie, farbením podľa Grama, použitím štandardných rýchlych testov (katalázy, pyrrolidonylaminopeptidázy – PYR a oxidázové testy), latex aglutinačných a biochemických testov.

Atopia

Kožné prick-testy (SPT) boli realizované na základe platných odporúčaní Európskej akadémie pre klinickú imunológiu a alergológiu (EAACI) [5], pričom panel testovaných alergénov zahŕňal: roztoče (Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae), zmes brezovitých stromov (breza, lieska, jelša, hrab), zmes drevín (buk, gaštan, dub), zmes 5 tráv (lipnica, reznačka, mätonoh, tomka, timotejka), palina, pes, mačka, Alternaria alternata a Aspergilus fumigatus). Ako pozitívnu kontrolu sme použili roztok histamín dihydrochloridu v destilovanej vode (10 mg//ml) a glycerol vo fyziologickom roztoku bol použitý ako negatívna kontrola. Alergénové extrakty, pozitívna a negatívna kontrola boli nanesené po kvapkách na očistenú a klinicky kľudnú volárnu stranu predlaktia. V mieste kvapky bol povrch kože narušený lancetou s krátkym hrotom a po 1–2 minútach bola kvapka zotretá. Na každý prick bola použitá samostatná jednorázová lanceta (Stallerpoint, Francúzko). Po 15 minútach bola vzniknutá kožná reakcia odčítaná. Za pozitívnu reakciu bola považovaná indurácia (papula) s minimálnym priemerom 3 mm. Deti s aspoň jedným pozitívnym výsledkom SPT na inhalačné alergény sme označili za atopické.

Nazálny oxid dusnatý

Koncentráciu oxidu dusnatého v nazálnom vzduchu sme stanovovali neinvazívnou metódou pomocou chemiluminiscenčného analyzátora – prístroja Niox MINO^® (Aerocrine, Švédsko) (obr. 1). Hodnotu nNO sme určili metódou pasívnej aspirácie NO z  každej nosovej dierky pri prietoku 5 ml/s pri uzávere mäkkého podnebia, aby sa zabránilo miešaniu NO z dolných dýchacích ciest s NO v nosovej dutine. Vyšetrovaný pohodlne sedí a v úvode sa 3-krát nadýchne a vydýchne cez nosovú dutinu, aby sa odventiloval NO z iných častí respiračného systému. Uzáver mäkkého podnebia sme dosiahli podľa veku a tolerancie vyšetrovaného probanda po maximálnom nádychu cez ústa zadržaním dychu počas pasívnej aspirácie NO cez jemne priloženú vyšetrovaciu nazálnu olivku prístroja k nosovej dierke (obr. 2). U netolerujúcich probandov sme metodiku merania modifikovali pomalým výdychom ústami oproti odporu 10 cm H₂O. Hodnoty nNO boli samostatne kalkulované pre pravú a ľavú nosovú dierku.

Štatistická analýza

Charakteristiku súboru pacientov a sledované dáta sme vyhodnotili pomocou frekvenčnej sumarizácie a deskriptívnej štatistiky: priemer, medián, smerodajná odchýlka, medián, kvartil minima a maxima. Rozdiely sledovaných parametrov medzi sledovanými skupinami pacientov sme vyhodnotili pomocou Mannova-Whitneyho U testu (2 nezávislé kategórie) a Kruskalovho-Wallisovho testu (3 nezávislé kategórie). Na analýzu rozptylu sledovanej hodnoty s prítomnosťou viacerých faktorov sme použili dvojfaktorovú ANOVA s post hoc Duncan testom.

Za štatisticky významné sme v rámci všetkých použitých testov považovali hodnoty hladiny významnosti p <0,05. Na štatistickú analýzu sme použili program STATISTICA CZ 10.

Výsledky

Charakteristika súboru pacientov

Do prospektívnej štúdie bolo zaradených 60 detí s adenoidnými vegetáciami, ktorým bola vykonaná endoskopická adenotómia v celkovej anestézii na Klinike ORL a ChHaK UK JLF a UNM v Martine. Adenotómia bola indikovaná pre obturáciu nosohltana a recidivujúce infekcie horných dýchacích orgánov. V súbore bolo 43 chlapcov, priemerný vek 4,5 ± 1,9 rokov (2–12 rokov) a 17 dievčat, priemerný vek 5 ± 2,9 rokov (2,5–12 rokov). Sedemnásť (28 %) detí malo AV II. stupňa a 43 (72 %) AV III. stupňa. Obturácia nosohltana lymfoepitelovým tkanivom I. stupňa (po horný okraj choány) sa v súbore nevyskytovala.

Mikrobiologický nález v strednom nosovom priechode a v nosohltane

Na základe kultivačného vyšetrenia sme identifikovali baktérie u 50 (83 %) vzoriek zo stredného nosového priechodu a u 60 (100 %) vzoriek z nosohltana. Identifikované baktérie zo stredného nosového priechodu a nosohltana sú uvedené v tabuľke 1.

Koaguláza-negatívne Staphylococcus spp., Corynebacterium spp., druh Streptococcus viridans a Neisseria spp. kolonizujú respiračnú sliznicu za normálnych podmienok a tvoria tak súčasť nepatogénnej bakteriálnej flóry sliznice horných dýchacích orgánov. Preto výskyt patogénnych baktérií v našom súbore bol nasledovný: 29 (58 %) v strednom nosovom priechode a 43 (72 %) v nosohltane. Signifikantné rozdiely medzi výskytom patogénnych baktérií v nosovej dutine a nosohltane sme nezaznamenali (p = 0,133). Polymikrobiálny rast patogénnych baktérií sa vyskytoval častejšie v nosohltane v porovnaní so stredným nosovým priechodom (p = 0,006).

Atopia

Atopiu na základe výsledkov prick-testov sme diagnostikovali u 83 % detí. Najčastejším aeroalergénom boli roztoče (58 %) a alergény mačky (25 %) (graf 1).

Nazálny oxid dusnatý

Priemerná koncentrácia nazálneho oxidu dusnatého v súbore bola 337 ± 36 ppb. Rozdiely v koncentrácii nNO medzi pravou a ľavou časťou nosovej dutiny sme nezaznamenali (p = 0,884). Koncentrácia nNO sa nelíšila medzi pohlaviami (p = 0,727). Zaznamenali sme koreláciu vzhľadom na vek – mladšie deti (skupina A) mali signifikantne nižšiu koncentráciu nNO v porovnaní so staršími deťmi (skupina B: p = 0,015, skupina C: p = 0,009) (graf 2).

Veľkosť adenoidných vegetácií nemala vplyv na koncentráciu nNO (p = 0,451). Rozdiely medzi koncentráciou nNO a prítomnosťou atopie sme nezaznamenali (p = 0,879).

Identifikácia patogénnych baktérií v nosohltane bola spojená so signifikantne zvýšenou koncentráciou nNO (p = 0,038). Kolonizácia stredného nosového priechodu patogénnymi baktériami významne nemala vplyv na koncentráciu nNO (p = 0,265) (graf 3).

Diskusia

Horné dýchacie a prehĺtacie orgány sú často iniciálnym miestom vstupu baktérií do organizmu. Kolonizácia mikroorganizmami je prvým krokom k rozvoju chorôb tejto oblasti. Recidivujúci zápal je tiež jedným z dôležitých faktorov vzniku adenoidných vegetácií [6, 7, 8]. V práci sme porovnávali osídlenie mikroorganizmami v nosohltane a v strednom nosovom priechode. Patogénne baktérie sme izolovali u 29 (58 %) detí v strednom nosovom priechode a u 43 (72 %) v nosohltane. Z patogénov sme najčastejšie identifikovali druhy Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Haemophillus influenzae a Moraxella catarrhalis, a to v strednom nosovom priechode ako aj v nosohltane. Podobné výsledky zaznamenali aj iní autori [7, 8, 9]. Polymikrobiálny rast, čiže identifikácia viacerých patogénov súčasne, bol častejší v nosohltane v porovnaní s nosovou dutinou. Vysvetľujeme si to hypertrofiou lymfoepitelového tkaniva, ktoré predstavuje zdroj infekcie. Opakujúce sa infekcie lymfoepitelového tkaniva vedú k chronickej aktivácii bunkami sprostredkovanej a humorálnej imunitnej odpovede s následnou hyperpláziou lymfoidného tkaniva, ktoré zase predstavuje vhodné prostredie pre kolonizáciu patogénnymi baktériami [7].

Dôležitou asociovanou komorbiditou adenoidných vegetácií je aj atopický (alergický) terén v dýchacích cestách klinicky exprimovaný vo forme alergickej rinosinusitídy či bronchiálnej astmy [10, 11]. Aj v našej práci sme zaznamenali vysoké percento detí s atopiou. Atopiu na základe prick-testov sme diagnostikovali až u 83 % detí, ktoré podstúpili endoskopickú adenotómiu. Najčastejším aeroalergénom boli roztoče a srsť mačky. Ide o jednoznačný dôkaz, že atopia je dôležitý faktor v patogenéze adenoidných vegetácií. Komplexná anti-alergická liečba (systémová, lokálna) môže teda prispieť spolu s adenotómiou k normalizácii zápalu v HDO ako aj k zmierneniu príznakov obštrukcie dýchacích ciest, prípadne k reštitúcii slizničných pomerov po adenotómii. Vyšetrenie kožnými prick-testami by preto malo byť štandardnou súčasťou manažmentu a diagnostického postupu u detí s adenoidnými vegetáciami. Včasnou diagnostikou a liečbou alergických chorôb sa tak môže predchádzať vzniku ich komplikácií. Atopia navyše signifikantne ovplyvňuje mikrobiálnu kolonizáciu HDO a jej zloženie [12].

V našej prospektívnej štúdii sme sa zamerali na detekciu nazálneho oxidu dusnatého u detí s adenoidnými vegetáciami. Oxid dusnatý je vysoko reaktívny biologický mediátor, ktorý sa podieľa na patogenéze rôznych respiračných ochorení vrátane alergickej rinitídy, rinosinusitídy, astmy, cystickej fibrózy či ciliárnej dyskinézie. Môže byť považovaný za marker zápalu dýchacích orgánov [13–16].

Hlavným producentom NO v HDO je epitel prinosových dutín. Zmeny v oblasti nNO môžu signalizovať obštrukciu nosovej dutiny, zápal ako aj choroby dolných dýchacích orgánov. Nosový NO nie je doteraz štandardizovaný. Hladiny koncentrácie sú zvýšené u nekomplikovanej rinosinusitídy. Znižuje sa pri nefunkčnosti ostiomeatálnej jednotky (opuch, zápal) [17, 18].

Hodnota nNO sa podľa literárnych údajov pohybuje od 200 do 450 ppb [19–23]. Priemerná koncentrácia nazálneho oxidu dusnatého v súbore bola 337 ± 36 ppb. Rozdiely v koncentrácii nNO medzi pravou a ľavou časťou nosovej dutiny sme nezaznamenali. Jeho hodnota sa nelíšila medzi pohlaviami. Zaznamenali sme koreláciu vzhľadom na vek – mladšie deti (≤5 rokov) mali signifikantne nižšiu koncentráciu nNO v porovnaní so staršími deťmi. Podobné výsledky zaznamenali aj iní autori [19, 23]. Torreta a spol. [19] vo svojej štúdii zistili vyššiu koncentráciu nNO u detí s adenoidnými vegetáciami (>450 ppb). Navyše deti s adenoidnými vegetáciami, ktoré obturovali nosohltan, mali signifikantne nižšie hodnoty nNO v porovnaní s deťmi s adenoidnými vegetáciami bez obštrukcie HDO. Tieto výsledky poukazujú na možnú úlohu NO v patogenéze adenoidných vegetácií. V našom súbore veľkosť adenoidných vegetácií nemala vplyv na koncentráciu nNO. Vysvetľujeme si to charakterom súboru pacientov. Všetky deti v sledovanom súbore boli liečené chirurgicky a adenoidné vegetácie bez obštrukcie nosohltana sa nevyskytovali. Preto sa prípadné rozdiely medzi veľkosťou lymfoepitelového tkaniva nosohltana a koncentráciou nNO nemohli detegovať.

Oxid dusnatý predstavuje tiež významnú obrannú líniu v ochrane HDO. V nose a predovšetkým v prinosových dutinách sú koncentrácie NO v rámci celého dýchacieho systému a pravdepodobne celého organizmu najvyššie. V porovnaní s dolnými dýchacími orgánmi sú približne stonásobne vyššie. Predpokladá sa, že tieto vysoké koncentrácie NO sú baktericídne a pomáhajú udržiavať prinosové dutiny sterilné. Vysoké koncentrácie NO sa zistili aj v nosovej dutine novorodencov, ktorí ešte nemajú prinosové dutiny vyvinuté [24]. Medzi nežiaduce, potenciálne škodlivé účinky NO v dýchacích cestách patrí vazodilatácia a zápal. Endogénny NO môže zvýšiť extravazáciu plazmy navodením zvýšeného prietoku v postkapilárnych venulách, prípadne až vznik edému [25].

V sledovanom súbore identifikácia patogénnych baktérií v nosohltane bola spojená so signifikantne zvýšenou koncentráciou nNO, čo si vysvetľujeme jeho reaktívnym zvýšením pri kolonizácii patogénmi a tým aj zdroja infekcie. Na druhej strane kolonizácia stredného nosového priechodu patogénnymi baktériami významne nemala vplyv na koncentráciu nNO. Prítomnosť patogénnych baktérií v strednom nosovom priechode môže mať za následok opuch v tejto oblasti so znížením uvoľňovania nNO z prinosových dutín. Preto prípadné zmeny pri reaktívne zvýšenej tvorbe pri adenoidných vegetáciách sa nemohli uplatniť.

Oxid dusnatý sa zúčastňuje aj v alergickom zápale. Dokázala sa jeho zvýšená produkcia pri eozinofilnom zápale pri astme [1, 4, 26]. V našom súbore sme však nezaznamenali rozdiely medzi koncentráciou nNO a prítomnosťou atopie a rozdiel od známej asociácie medzi atopickým zápalom a vydychovaným oxidom dusnatým [27].

Záver

Vyšetrovanie vydychovaného NO má svoje dôležité miesto pri diferenciálnej diagnostike rôznych respiračných chorôb. Okrem detekcie NO v dolných dýchacích orgánoch sa v súčasnosti pozornosť zameriava na stanovenie nazálneho oxidu dusnatého. Hlavným zdrojom nNO sú prinosové dutiny. Oxid dusnatý predstavuje významnú obrannú líniu v ochrane HDO. Monitorovanie hodnôt nNO možno použiť jednak v diferenciálnej diagnostike ochorení dýchacích ciest (napr. vyhľadávanie ciliárnej dyskinézy asociovanej s rinosinusitídou) ako aj pri objektivizácii stupňa obštrukcie HDO pri adenoidných vegetáciách. Následne meranie nNO môže prispieť k zhodnoteniu efektu adenotómie na parametre v HDO, či už v zmysle zlepšenia anatomických pomerov, priechodnosti nosových prieduchov, zlepšenia drenáže prinosových dutín ako aj z hľadiska zlep-šenia parametrov zápalu a imunitnej obrany v sliznici HDO.

Práca bola podporená grantom VEGA 1/0252/14.

Došlo: 6. 11. 2015

Přijato: 14. 1. 2016

MUDr. Barbora Uhliarová, PhD.

ORL oddelenie FNsP F. D. Roosevelta

Nám. L. Svobodu 1

974 01 Banská Bystrica

Slovenská republika

e-mail: b.uhliarova@gmail.com