Nekultivační stanovení mikroorganismů v plodové vodě u pacientek s předčasným odtokem plodové vody

Overview

Cíl studie:
Předčasný odtok plodové vody (preterm prelabor rupture of membranes) je závažná porodnická komplikace, která je často doprovázena přítomností mikroorganismů v plodové vodě. Cílem práce je charakterizovat současné možnosti nekultivačního stanovení mikrobiální invaze do amniální dutiny a zkušenosti s tímto přístupem ve Fakultní nemocnici Hradec Králové.

Typ práce:
Přehledová práce.

Název a sídlo pracoviště:
Ústav klinické biochemie a diagnostiky – úsek molekulární biologie, Fakultní nemocnice Hradec Králové.

Závěr:
Využití nekultivačních technik při stanovení mikroorganismů v plodové vodě u pacientek s předčasným odtokem plodové vody je v současné době dostupná metoda. Vzhledem k nálezu genitálních mykoplazmat jako dominantních patogenů v plodové vodě by tato technika měla být považována za standardní vyšetření.

Klíčová slova:
předčasný porod, genitální mykoplazmata, polymerázová řetězová reakce, bakteriální DNA

ÚVOD

Předčasný odtok plodové vody (PPROM – preterm prelabor rupture of membranes), definovaný jako porušení plodových obalů s odtokem plodové vody nejméně dvě hodiny před nástupem děložní aktivity před dokončeným 37. týdnem těhotenství, je závažnou porodnickou patologií komplikující přibližně 3 % všech těhotenství [1, 18, 19, 26, 27]. PPROM je příčinou jedné třetiny všech předčasných porodů [3, 6].

Příčina PPROM je podle posledních poznatků zejména neinfekční [2, 3, 4, 6, 12–16, 23]. Rozmanité rizikové faktory spojené s oxidativním stresem a zánětem vedou k aktivaci senescence, apoptózy a proteolýzy rezultující ve snížení pevnosti plodových obalů a jejich následné ruptuře [3, 4, 6,] Navzdory neinfekční etiologii PPROM je 15–32 % případů komplikováno přítomností mikroby indukovaného intraamniálního zánětu (průkaz mikroorganismů v plodové vodě a elevace zánětlivých mediátorů v plodové vodě), 4–6 % případů PPROM je komplikováno sterilním intraamniálním zánětem (elevace zánětlivých mediátorů v plodové vodě bez průkazu mikroorganismů v plodové vodě) a 13–15 % případů PPROM je komplikováno tzv. kolonizací (přítomnost mikroorganismů v plodové vodě bez elevace zánětlivých mediátorů v plodové vodě) [2, 3, 4, 6, 12–16, 23].

K diagnostice těchto komplikací je nutno použít dva přístupy: a) prokázat, či vyloučit přítomnost mikroorganismů v plodové vodě, b) potvrdit, či vyloučit elevaci zánětlivých mediátorů v plodové vodě. Druhý přístup je snazší, jednodušší, rychlejší a levnější, neboť k němu lze využít stanovení interleukinu-6 v plodové vodě pomocí tzv. bedside testu – vyšetření trvá asi 20 minut [9–11, 24, 25, 28].

K průkazu přítomnosti mikroorganismů v plodové vodě je možno použít kultivačních či molekulárně biologických technik. Vzhledem k náročnosti kultivace genitálních mykoplazmat a rychlosti dostupnosti výsledků není klasická mikrobiologická diagnostika v této oblasti tolik využívaná [4, 17].

Vzhledem k tomu, že nejčastějším původcem mikroby indukovaného intraamniálního zánětu jsou tzv. genitální mykoplazmata (Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealyticum a Mycoplasma hominis), která jsou zodpovědná asi za 80–85 % všech mikrobiálních nálezů v plodové vodě u pacientek s PPROM, je nutno nejprve pátrat po těchto mikroorganismech pomocí real-time PCR (Polymerase Chain Reaction) [3, 6, 7, 12, 15, 20, 29]. Při negativitě DNA (deoxyribonukleová kyselina) mykoplazmat se pokračuje v diagnostice jiných původců bakteriál­ní infekce pomocí širokospektré (broad-range) PCR s následnou sekvenací podle Sangera. Tímto způsobem je možné identifikovat DNA jakékoli bakterie přítomné ve vyšetřovaném biologickém materiálu [7, 20, 29].

SEZNÁMENÍ S TERMINOLOGIÍ

Nejprve si objasníme terminologii molekulárně biologických metod, které se k diagnostice genitálních mykoplazmat a jiných původců bakteriální infekce využívají.

PCR je metoda, umožňující zmnožení (amplifikaci) vybraného úseku DNA. Lze provést analýzu i ze vzorku s velmi nízkou koncentrací mikroba. Konkrétní amplifikovaný úsek DNA je ohraničen dvěma primery (krátká sekvence oligonukleotidů). Po vlastní PCR se amplifikovaný produkt značený ethidium bromidem vizualizuje pomocí gelové elektroforetické detekce.

PCR má mnoho modifikací. V současné době se nejvíce využívá PCR v reálném čase real-time (rt) PCR. Amplifikace produktu je s narůstající fluorescencí snímána laserem v reálném čase, což umožňuje okamžitý odečet výsledku. Od standardní PCR se liší tím, že odpadá závěrečný krok elektroforetické detekce produktu (rychlejší odečet výsledku) a že je k amplifikaci nutno použít nejen primery, ale i sondu (krátká sekvence oligonukleotidů značených příslušnou fluorescenční značkou, která nasedá mezi dva primery ohraničující amplifikovaný úsek DNA a svým zářením umožňuje měřit amplifikaci produktu). V případě modifikace PCR multiplex rt-PCR je více sond značeno rozdílnou fluorescenční značkou, což zajišťuje současnou diagnostiku například čtyř patogenů v jedné zkumavce – urychlení času a dřívější vydání výsledku. Pozitivní výsledek (esovitě prohnutá amplifikační křivka) (viz obr. 1) se prokládá „přímkou“ (příslušným thresholdem – práh detekce), která protíná amplifikační křivku, a tím určuje hodnotu CT (cycle threshold). CT vypovídá o intenzitě pozitivity. Čím je nižší hodnota CT (amplifikační křivka se dříve zvedá), tím je větší nálož mikroba ve vzorku. Pokud je mikrob ve vzorku jen v nízké koncentraci, amplifikační křivka se zvedne až později a CT hodnota je vyšší. CT lze využít i k tzv. semikvantitě – orientační kvantifikaci.

MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÁ DIAGNOSTIKA PŮVODCŮ MYKOPLAZMATICKÝCH INFEKCÍ

K diagnostice původců mykoplazmatických infekcí se využívá multiplex rt-PCR, detekující přítomnost DNA Ureaplasma species, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Chlamydia trachomatis v reálném čase a současně zajišťující koamplifikaci vnitřní inhibiční kontroly vzorku (vyloučení falešně negativního výsledku). Vlastní multiplex rt-PCR předchází izolace DNA – nejčastěji se jedná o kolonkovou izolaci, ale lze využívat i jiné technologie (magnetické partikule, manuální či automatické izolátory). Následná amplifikace kaž­dého patogena je zajištěna specifickými primery a sondou z příslušného konkrétního úseku genu jednotlivého mikroba (obr. 1). Analýzou výsledků se získá CT hodnota, která vypovídá o intenzitě amplifikace pozitivního nálezu (slabě, silně pozitivní). CT hodnotu je možné využívat jako náhradu relativní kvantifikace a pro kliniky je cennou informací. Lékař tak získá představu o náloži DNA patogena způsobujícího intraamniální zánět. Citlivost multiplex real-time PCR je 50–100 kopií/mL a umožňuje rychlou diagnostiku nejčastěji přítomných patogenů v plodové vodě u PPROM [22].

MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÁ DIAGNOSTIKA JINÝCH PŮVODCŮ BAKTERIÁLNÍCH INFEKCÍ S NÁSLEDNOU SEKVENACÍ PODLE SANGERA

Při negativitě DNA mykoplazmat se pokračuje v diagnostice pomocí širokospektré (broad-range) PCR s primery cílenými do oblasti 16S rRNA (ribozomální ribonukleová kyselina) s následnou sekvenací podle Sangera. Gen pro 16S rRNA je přítomen ve všech bakteriích, a proto je vhodný pro identifikaci druhu bakterie. Tvoří ribozomální malou podjednotku, je 1542 nukleotidů dlouhý a skládá se z devíti hypervariabilních regionů V1 až  V9, ve kterých je značná sekvenční diverzita mezi různými bakteriemi (viz obr. 2). Oblasti konzervovaných sekvencí C1–C9 se využívají pro design univerzálních primerů [5, 8, 21].

K průkazu bakteriální DNA se využívá standardní PCR, zajišťující amplifikaci konkrétního úseku 16S rRNA ohraničeného primery. Po amplifikaci následuje elektroforetická detekce vzniklého produktu na 2% agarózovém gelu. Při pozitivním nálezu bakteriální DNA následuje sekvenační analýza na sekvenátoru ABI 3130. Intenzita bandu pozitivní kontroly je kritériem, zda je možné bakteriální DNA sekvenovat, a je zjištěna experimentálně. Vzorky o stejné či slabší intenzitě identifikovat sekvenační analýzou nelze (obr. 3). Citlivost metody průkazu bakteriální DNA je 1–5 kopií/μL; 10–15 kopií/μL již lze sekvenovat (zjištěno experimentálně).

Konečným výsledkem je získaná sekvence bakteriální DNA ve FASTA formátu (obr. 4). Ta se vyhodnocuje pomocí identifikačních programů, volně dostupných na internetu (BLAST, SepsiTest^TM BLAST). Pomocí těchto programů je získaná sekvence porovnávána s referenčními a za výsledek je považována bakterie s nejvyšším procentem identifikace (98–100 %).

PRAKTICKÉ INFORMACE

Odebranou plodovou vodu (přibližně 1,5 ml) ve sterilní odběrové zkumavce bez aditiv je důležité do laboratoře dopravit co nejrychleji. Čím dříve je biologický materiál laboratoři dodán, tím dříve může laboratoř poskytnout výsledek lékaři. V případě urgentního vyšetření je vhodné před odesláním telefonicky informovat laboratoř, která se vzorkem pak pracuje ve statimovém režimu. Pokud odebranou plodovou vodu nelze transportovat do laboratoře hned po odběru, uchovává se v lednici při 4 °C. Při této teplotě je DNA stabilní po dobu asi pěti až sedmi dnů od odběru. V případě delšího transportu je nutné zajistit, aby vzorek byl transportován v chladu. Pokud je vzorek plodové vody dodán do laboratoře v dopoledních hodinách, výsledek real-time PCR mykoplazmat a průkazu bakteriální DNA je k dispozici tentýž den. V případě pozitivity bakteriální DNA je výsledek sekvenační analýzy podle Sangera vydán následující den.

Doba odezvy jednotlivých kroků vyšetření je uvedena v tabulce 1.

ZÁVĚR

Znalost informace o přítomnosti či absenci mikrobiální invaze do amniální dutiny je u pacien­tek s PPROM důležitá. Umožňuje totiž individualizovat léčbu a management této porodnické komplikace. Vyžaduje to však odběr vzorku plodové vody, přítomnost laboratoře, která je schopna provést výše popsaná vyšetření, a těsnou spolupráci klinika s personálem laboratoře.

Mgr. Radka Kutová

Ústav klinické biochemie a diagnostiky

Fakultní nemocnice

Sokolská 581

500 05 Hradec Králové – Nový Hradec Králové

e-mail: radka.kutova@centrum.cz