Hladiny PAPP-A ve folikulární tekutině a krvi pacientek stimulovaných k IVF s hrozícím ovariálním hyperstimulačním syndromem

Overview

Cíl studie:
Ovariální hyperstimulační syndrom (OHSS) patří k závažným komplikacím léčby metodami in vitro fertilizace (IVF). Vyskytuje se ve své závažné formě u 3-5 % IVF léčených žen. Jeho patogeneze je nejasná, a léčba tedy pouze symptomatická. Pravděpodobnost vzniku OHSS u konkrétní ženy je obtížně předpověditelná, současné kritérium – počet punktovaných folikulů - je nespolehlivé.

Cílem práce bylo zjistit, zda u pacientek s vysokým rizikem vzniku OHSS (vzhledem k odběru oocytů punkcí velkého počtu folikulů) lze predikovat, u které z nich je pravděpodobnost OHSS vysoká a u které nízká. Jako marker byla testována hladina Pregnancy Associated Plasma Protein - A (PAPP-A) ve folikulární tekutině a krevním séru.

Typ studie:
Prospektivní studie.

Název a sídlo pracoviště:
Centrum asistované reprodukce, Gynekologicko-porodnická klinika 1. LF UK a VFN v Praze.

Soubor a metodika:
Sledovali jsme 118 pacientek, u nichž jsme odebrali vzorky folikulární tekutiny (FF) a krve v den odběru oocytů pro IVF. Provedli jsme analýzu hladin PAPP-A ve FF a v krevním seru a porovnali je se stupněm závažnosti časného OHSS.

Výsledky:
Hladiny PAPP-A ve FF jsou 0,81 ± 0,29 IU/l a v krevním séru 0,0017 ± 0,0003 IU/l. U pacientek s následným OHSS 1., 2. a 3. stupně byl v den odběru oocytů PAPP-A ve FF v koncentraci 0,81; 0,52 a 0,73IU/l , respektive 0,0017; 0,0017 a 0,0017IU/l v séru. Tyto hodnoty nekorelují s následným rozvojem OHSS.

Koncentrace PAPP-A v krevním séru nekorelují ani s počtem folikulů.

Závěr:
1.
Patologická odpověď organismu na hormonální stimulaci vedoucí k rozvoji OHSS nemá vztah ke koncentraci PAPP-A ve folikulární tekutině nebo v krvi. 2. PAPP-A nepřechází ve významném množství z folikulů do krve.

Klíčová slova:
IVF, OHSS, PAPP-A, folikulární tekutina.

Úvod

Ročně je v České republice stimulace ovarií prováděna u 7 000–10 000 žen. Cílem u převážné části je získat oocyty pro in vitro fertilizaci. Stejně jako ve světě, i u nás se u části pacientek (15-20 %) rozvíjí OHSS mírného, středního nebo závažného stupně. Ve své závažné formě (hemokoncentrace, ascites, zvětšení ovarií, fluidothorax, zvýšená koagulační pohotovost, trombózy, oligurie, dyspnoe, tachykardie) vyžaduje hospitalizaci (2-4 týdny) a je potenciálně letální komplikací léčby neplodnosti u jinak zdravých mladých žen [1].

Patogeneze OHSS je i přes řadu prací u nás i ve světě stále nejasná. Prevence je tedy obtížná a léčba pouze symptomatická.

PAPP-A byl původně popsán jako protein izolovaný ze séra těhotných žen, pravděpodobně produkovaný placentou [7]. Další práce však ukázaly, že PAPP-A je produkován i v jiných tkáních včetně granulózních buněk lidských ovariálních folikulů [2, 14].

PAPP-A je extracelulární metaloproteáza a v séru cirkuluje hlavně ve formě heterotetrameru o velikosti 500 kDa, skládajícího se ze dvou molekul PAPP-A a dvou molekul proMBP (Major Basic Protein), které jsou navzájem kovalentně vázány pomocí disulfidových můstků [13]. Molekula proMBP je inhibitorem PAPP-A a tetramer o tomto složení je neaktivní nebo vykazuje velmi nízkou aktivitu [12]. Aktivní PAPP-A je proteázou specificky štěpící IGFBP4 [6]. IGFBP4 se váže na IGF, a zabraňuje tak interakci IGF s IGF receptorem. PAPP-A štěpí IGFBP4, uvolňuje IGF z komplexu, a tak aktivuje IGF signální kaskádu.

IGF a IGFBP4 byly navrženy jako důležité signální molekuly účastnící se regulace růstu a dozrávání ovariálních folikulů po stimulaci gonadotropiny [11]. IGF stimuluje syntézu steroidů v granulózních buňkách a tento efekt je inhibován vazbou IGF na IGFBP4. PAPP-A byl ve folikulární tekutině identifikován jako jediná proteáza specifická pro IGFBP4, a také jako marker dominantních folikulů v lidských ovariích [3]. Matsui [8] ukázal, že produkce PAPP-A v granulózních buňkách je pod kontrolou FSH. Tato práce i většina dalších dat o regulaci exprese PAPP-A/IGFBP4 v ovariích však pocházejí ze zvířecích modelů [4, 5, 9]. Není nám známa žádná práce zabývající se analýzou PAPP-A a IGFBP4 ve folikulární tekutině v souvislosti s OHSS.

HYPOTÉZA

Hormonální stimulace vyvolává změny v expresi ovariálních proteinů, růst a zrání folikulů, zvýšení objemu folikulární tekutiny a expanzi extracelulární matrix kumulárních buněk. Zvýšení koncentrace FSH stimuluje expresi PAPP-A v granulózních buňkách a jeho sekreci do folikulární tekutiny. PAPP-A reaguje jako specifická proteáza pro IGFBP4 a proteolýzou IGFBP4 se z neaktivního komplexu IGF/IGFBP4 uvolní IGF. Volný IGF pak aktivuje růst folikulu. PAPP-A je tedy klíčová signální molekula účastnící se regulace růstu folikulu po stimulaci FSH. Patologická odpověď organismu na hormonální stimulaci vedoucí k rozvoji OHSS se pravděpodobně odrazí v rozdílném stupni exprese PAPP-A, tedy v rozdílné koncentraci PAPP-A a IGFBP4 ve folikulární tekutině, ve srovnání s fyziologicky reagujícími ovarii. Změny koncentrace uvedených proteinů ve folikulární tekutině se pravděpodobně projeví i změnou v koncentracích v krvi.

Soubor a metodika

Studie byla schválena Etickou komisí Všeobecné fakultní nemocnice v Praze. Ženy byly informovány o projektu a podepsaly informovaný souhlas.

Do studie jsme zařadili 118 žen, směřujících v rámci léčby neplodnosti k in vitro fertilizaci za pomoci řízené hyperstimulace ovarií, ve standardní skupině (věk do 35 let, bazální FSH do 10 IU/l).

Ženy byly stimulovány gonadotropiny (v dlouhém protokolu s agonisty nebo v krátkém protokolu s antagonisty), indukce dozrání oocytů byla vyvolána aplikací hCG (Pregnyl, Organon) v dávce 10 000 IU, 36 hodin před odběrem oocytů.

Odběr oocytů jsme prováděli transvaginální punkcí folikulů vedenou ultrazvukem. Folikulární tekutinu jsme po vybrání oocytů v ní přítomných centrifugovali (abychom ji zbavili zbytků buněk) a vzorky zmrazili při –20 st.C. Žilní krev odebranou v den odběru oocytů jsme po koagulaci centrifugovali a takto získané sérum jsme uchovali při –70 st.C. Koncentraci PAPP-A ve folikulární tekutině jsme stanovili pomocí soupravy PAPP-A IRMA (výrobce Immunotech, Praha, Česká republika).

Koncentraci PAPP-A v krevním séru jsme stanovili ultra-senzitivním ELISA imunokitem PAPP-A US (výrobce DRG instruments GmbH - Marburg, Germany), s citlivostí 0,023 ng/ml (0,000 005 IU/l).

Hodnocení OHSS jsme prováděli sledováním klinického stavu a laboratorních známek a hodnotili podle Navota do 4 stupňů (viz tabulku 1), přičemž v našem souboru se žádný kritický OHSS nevyskytl.

Získaná data z jednotlivých vzorků folikulární tekutiny byla porovnána s tíží OHSS u dané pacientky.

Výsledky

Nejprve jsme stanovili základní rozmezí hodnot PAPP-A ve folikulární tekutině (0,81 ± 0,29 IU/l) a krevním séru (0,0017 ± 0,0003 IU/l) u žen, které neměly OHSS.

Poté jsme ověřili předpoklad, že není souvislost mezi hladinami PAPP-A ve folikulech a mezi počtem folikulů (viz graf 1). Počet folikulů je totiž odrazem vztahu intenzity stimulační dávky FSH vůči ovariální rezervě u dané pacientky. Tím jsme vyloučili možnost, že bychom museli v dalších výpočtech brát tento faktor v úvahu.

Vzhledem k vysoké koncentraci PAPP-A ve folikulární tekutině a nízké koncentraci v krvi se nabízí předpoklad, že PAPP-A se dostává do krve převážně přestupem z folikulů, a tedy jeho koncentrace v krvi bude záviset na jeho koncentraci ve folikulech. Tento předpoklad se však již dříve z dat v našem souboru nepotvrdil [10].

Vzhledem k velké diverzitě v počtu folikulů u jednotlivých pacientek jsme ještě porovnali vztah mezi počtem folikulů a koncentrací PAPP-A v krevním séru (viz graf 2). Ani zde se neukázala významná korelace.

Folikulární membrána tedy neumožňuje přestup významného množství PAPP-A do krve. Z toho lze předpokládat, že stanovení PAPP-A v krvi tedy téměř jistě nebude mít smysl pro predikci OHSS.

Pro zjištění, zda hladina PAPP-A souvisí se vznikem OHSS a zda její hladina umožní predikci závažnosti OHSS, jsme stanovili hladiny folikulárního PAPP-A u pacientek, které vzhledem k počtu punktovaných folikulů měly empiricky vyšší riziko vzniku OHSS – tedy u žen, kde počet punktovaných folikulů byl nad 18, viz tabulku 2.

Výsledky neukazují statisticky významnou (na 5% hladině významnosti) závislost hladin PAPP-A (jak ve folikulární tekutině, tak v krevním séru) na stupni závažnosti OHSS.

Diskuse

V dostupné literatuře k datu 2. 12. 2008 jsme nenalezli žádnou práci, která by sledovala hodnoty PAPP-A ve folikulární tekutině jako prediktor OHSS.

Hodnoty koncentrace PAPP-A ve folikulární tekutině a v krevním séru námi stanovené jsou ve shodě s literaturou [15].

Ve shodě s publikací Moos et al. [10] ani přes vysoký poměr koncentrací PAPP-A ve folikulech a v krvi (přibližně 500 :1) nedochází k výraznému přestupu do krve ve směru koncentračního spádu (není korelace sérových hladin s počtem folikulů, ani s koncentrací folikulárního PAPP-A).

Závěr

Naše práce se jako první zabývala vztahem mezi hladinami PAPP–A a OHSS.

Potvrdili jsme ve shodě s publikací Moos et al. [10], že PAPP-A nepřechází ve významném množství z folikulů do krve.

Získaná data o folikulární koncentraci PAPP-A nepotvrdila hypotézu asociace OHSS se signální drahou využívající PAPP-A. Bude vhodné prozkoumat vztah OHSS s jinými biomarkery, které by pravděpodobně optimálně bylo možné zjistit využitím proteomických technik.

Podpořeno grantem MZ ČR IGA NR/8932-3.

MUDr. Karel Řežábek, CSc.

Gynekologicko-porodnická klinika

1. LF UK a VFN

Apolinářská 18

128 00 Praha 2

e-mail: karel.rezabek@vfn.cz