Hladiny PAPP-A ve folikulární tekutině a krvi pacientek stimulovaných k IVF s hrozícím ovariálním hyperstimulačním syndromem

Follicular fluid and serum concentrations of PAPP-A in OHSS risk group of women undergoing IVF stimulation

Objective:
Ovarian Hyperstimulation Syndrome (OHSS) is a serious complication of In Vitro Fertilisation (IVF) treatment. It is estimated that 3-5% of treated women suffer of severe form of OHSS. OHSS pathogenesis remains unknown and its treatment is only symptomatic. It is difficult to predict the risk of OHSS of an individual woman, since a current criterion – the number of punctured follicles - is not very reliable.

Our aim was to find, whether in patients with a high risk of OHSS (more than 18 follicles punctured for oocyte pick-up) is possible to predict the individual risk of OHSS. As a marker we tested concentrations of Pregnancy Associated Plasma Protein - A (PAPP-A) in follicular fluid (FF) and blood serum (S).

Study design:
Prospective study.

Settings:
Assisted Reproduction Center, Clinic of Obstetrics and Gynecology, First Faculty of Medicine, Charles University in Prague and General Teaching Hospital in Prague.

Methodology:
Follicular fluid and serum of 118 female patients undergoing IVF treatment was collected at the day of oocyte pick-up and analysed for PAPP-A concentration. The resulting data were then correlated with the OHSS status of individual patient.

Results:
Mean concentration of PAPP-A in FF was 0,81 ± 0,29 IU/l, while in S it reached only 0.0017 ± 0.0003 IU/l. Patients with subsequent OHSS grade 1, 2 and 3 reached FF levels of PAPP-A 0.81; 0.52; and 0.73IU/l, respectively 0.0017; 0.0017 a 0.0017IU/l in blood serum. No correlation was found between PAPP-A FF or PAPP-A serum concentrations and the degree of OHSS.

No correlation was found between PAPP-A serum concentrations and the number of follicles.

Conclusion:
1. Pathological response on hormonal stimulation leading to OHSS is not related to the concentrations of PAPP-A in either FF or in blood serum. 2. PAPP-A does not pass from follicles to blood in a significant amount.

Key words:
IVF, OHSS, PAPP-A, follicular fluid.

Autoři: K. Řežábek ¹; M. Moosová ¹; J. Pavelková ¹; J. Moos ²; V. Filová ³
Působiště autorů: Centrum asistované reprodukce, Gynekologicko-porodnická klinika 1. LF UK a VFN, Praha přednosta prof. MUDr. A. Martan, DrSc. ¹; Sigma-Aldrich spol. s r. o., Praha ²; Immunotech a. s., Praha ³
Vyšlo v časopise: Ceska Gynekol 2009; 74(2): 80-84
Kategorie: Původní práce

Souhrn

Cíl studie:
Ovariální hyperstimulační syndrom (OHSS) patří k závažným komplikacím léčby metodami in vitro fertilizace (IVF). Vyskytuje se ve své závažné formě u 3-5 % IVF léčených žen. Jeho patogeneze je nejasná, a léčba tedy pouze symptomatická. Pravděpodobnost vzniku OHSS u konkrétní ženy je obtížně předpověditelná, současné kritérium – počet punktovaných folikulů - je nespolehlivé.

Cílem práce bylo zjistit, zda u pacientek s vysokým rizikem vzniku OHSS (vzhledem k odběru oocytů punkcí velkého počtu folikulů) lze predikovat, u které z nich je pravděpodobnost OHSS vysoká a u které nízká. Jako marker byla testována hladina Pregnancy Associated Plasma Protein - A (PAPP-A) ve folikulární tekutině a krevním séru.

Typ studie:
Prospektivní studie.

Název a sídlo pracoviště:
Centrum asistované reprodukce, Gynekologicko-porodnická klinika 1. LF UK a VFN v Praze.

Soubor a metodika:
Sledovali jsme 118 pacientek, u nichž jsme odebrali vzorky folikulární tekutiny (FF) a krve v den odběru oocytů pro IVF. Provedli jsme analýzu hladin PAPP-A ve FF a v krevním seru a porovnali je se stupněm závažnosti časného OHSS.

Výsledky:
Hladiny PAPP-A ve FF jsou 0,81 ± 0,29 IU/l a v krevním séru 0,0017 ± 0,0003 IU/l. U pacientek s následným OHSS 1., 2. a 3. stupně byl v den odběru oocytů PAPP-A ve FF v koncentraci 0,81; 0,52 a 0,73IU/l , respektive 0,0017; 0,0017 a 0,0017IU/l v séru. Tyto hodnoty nekorelují s následným rozvojem OHSS.

Koncentrace PAPP-A v krevním séru nekorelují ani s počtem folikulů.

Závěr:
1.
Patologická odpověď organismu na hormonální stimulaci vedoucí k rozvoji OHSS nemá vztah ke koncentraci PAPP-A ve folikulární tekutině nebo v krvi. 2. PAPP-A nepřechází ve významném množství z folikulů do krve.

Klíčová slova:
IVF, OHSS, PAPP-A, folikulární tekutina.

Úvod

Ročně je v České republice stimulace ovarií prováděna u 7 000–10 000 žen. Cílem u převážné části je získat oocyty pro in vitro fertilizaci. Stejně jako ve světě, i u nás se u části pacientek (15-20 %) rozvíjí OHSS mírného, středního nebo závažného stupně. Ve své závažné formě (hemokoncentrace, ascites, zvětšení ovarií, fluidothorax, zvýšená koagulační pohotovost, trombózy, oligurie, dyspnoe, tachykardie) vyžaduje hospitalizaci (2-4 týdny) a je potenciálně letální komplikací léčby neplodnosti u jinak zdravých mladých žen [1].

Patogeneze OHSS je i přes řadu prací u nás i ve světě stále nejasná. Prevence je tedy obtížná a léčba pouze symptomatická.

PAPP-A byl původně popsán jako protein izolovaný ze séra těhotných žen, pravděpodobně produkovaný placentou [7]. Další práce však ukázaly, že PAPP-A je produkován i v jiných tkáních včetně granulózních buněk lidských ovariálních folikulů [2, 14].

PAPP-A je extracelulární metaloproteáza a v séru cirkuluje hlavně ve formě heterotetrameru o velikosti 500 kDa, skládajícího se ze dvou molekul PAPP-A a dvou molekul proMBP (Major Basic Protein), které jsou navzájem kovalentně vázány pomocí disulfidových můstků [13]. Molekula proMBP je inhibitorem PAPP-A a tetramer o tomto složení je neaktivní nebo vykazuje velmi nízkou aktivitu [12]. Aktivní PAPP-A je proteázou specificky štěpící IGFBP4 [6]. IGFBP4 se váže na IGF, a zabraňuje tak interakci IGF s IGF receptorem. PAPP-A štěpí IGFBP4, uvolňuje IGF z komplexu, a tak aktivuje IGF signální kaskádu.

IGF a IGFBP4 byly navrženy jako důležité signální molekuly účastnící se regulace růstu a dozrávání ovariálních folikulů po stimulaci gonadotropiny [11]. IGF stimuluje syntézu steroidů v granulózních buňkách a tento efekt je inhibován vazbou IGF na IGFBP4. PAPP-A byl ve folikulární tekutině identifikován jako jediná proteáza specifická pro IGFBP4, a také jako marker dominantních folikulů v lidských ovariích [3]. Matsui [8] ukázal, že produkce PAPP-A v granulózních buňkách je pod kontrolou FSH. Tato práce i většina dalších dat o regulaci exprese PAPP-A/IGFBP4 v ovariích však pocházejí ze zvířecích modelů [4, 5, 9]. Není nám známa žádná práce zabývající se analýzou PAPP-A a IGFBP4 ve folikulární tekutině v souvislosti s OHSS.

HYPOTÉZA

Hormonální stimulace vyvolává změny v expresi ovariálních proteinů, růst a zrání folikulů, zvýšení objemu folikulární tekutiny a expanzi extracelulární matrix kumulárních buněk. Zvýšení koncentrace FSH stimuluje expresi PAPP-A v granulózních buňkách a jeho sekreci do folikulární tekutiny. PAPP-A reaguje jako specifická proteáza pro IGFBP4 a proteolýzou IGFBP4 se z neaktivního komplexu IGF/IGFBP4 uvolní IGF. Volný IGF pak aktivuje růst folikulu. PAPP-A je tedy klíčová signální molekula účastnící se regulace růstu folikulu po stimulaci FSH. Patologická odpověď organismu na hormonální stimulaci vedoucí k rozvoji OHSS se pravděpodobně odrazí v rozdílném stupni exprese PAPP-A, tedy v rozdílné koncentraci PAPP-A a IGFBP4 ve folikulární tekutině, ve srovnání s fyziologicky reagujícími ovarii. Změny koncentrace uvedených proteinů ve folikulární tekutině se pravděpodobně projeví i změnou v koncentracích v krvi.

Soubor a metodika

Studie byla schválena Etickou komisí Všeobecné fakultní nemocnice v Praze. Ženy byly informovány o projektu a podepsaly informovaný souhlas.

Do studie jsme zařadili 118 žen, směřujících v rámci léčby neplodnosti k in vitro fertilizaci za pomoci řízené hyperstimulace ovarií, ve standardní skupině (věk do 35 let, bazální FSH do 10 IU/l).

Ženy byly stimulovány gonadotropiny (v dlouhém protokolu s agonisty nebo v krátkém protokolu s antagonisty), indukce dozrání oocytů byla vyvolána aplikací hCG (Pregnyl, Organon) v dávce 10 000 IU, 36 hodin před odběrem oocytů.

Odběr oocytů jsme prováděli transvaginální punkcí folikulů vedenou ultrazvukem. Folikulární tekutinu jsme po vybrání oocytů v ní přítomných centrifugovali (abychom ji zbavili zbytků buněk) a vzorky zmrazili při –20 st.C. Žilní krev odebranou v den odběru oocytů jsme po koagulaci centrifugovali a takto získané sérum jsme uchovali při –70 st.C. Koncentraci PAPP-A ve folikulární tekutině jsme stanovili pomocí soupravy PAPP-A IRMA (výrobce Immunotech, Praha, Česká republika).

Koncentraci PAPP-A v krevním séru jsme stanovili ultra-senzitivním ELISA imunokitem PAPP-A US (výrobce DRG instruments GmbH - Marburg, Germany), s citlivostí 0,023 ng/ml (0,000 005 IU/l).

Hodnocení OHSS jsme prováděli sledováním klinického stavu a laboratorních známek a hodnotili podle Navota do 4 stupňů (viz tabulku 1), přičemž v našem souboru se žádný kritický OHSS nevyskytl.

Získaná data z jednotlivých vzorků folikulární tekutiny byla porovnána s tíží OHSS u dané pacientky.

Výsledky

Nejprve jsme stanovili základní rozmezí hodnot PAPP-A ve folikulární tekutině (0,81 ± 0,29 IU/l) a krevním séru (0,0017 ± 0,0003 IU/l) u žen, které neměly OHSS.

Poté jsme ověřili předpoklad, že není souvislost mezi hladinami PAPP-A ve folikulech a mezi počtem folikulů (viz graf 1). Počet folikulů je totiž odrazem vztahu intenzity stimulační dávky FSH vůči ovariální rezervě u dané pacientky. Tím jsme vyloučili možnost, že bychom museli v dalších výpočtech brát tento faktor v úvahu.

**Graf 1. Počet folikulů a koncentrace PAPP-A ve folikulu**

Vzhledem k vysoké koncentraci PAPP-A ve folikulární tekutině a nízké koncentraci v krvi se nabízí předpoklad, že PAPP-A se dostává do krve převážně přestupem z folikulů, a tedy jeho koncentrace v krvi bude záviset na jeho koncentraci ve folikulech. Tento předpoklad se však již dříve z dat v našem souboru nepotvrdil [10].

Vzhledem k velké diverzitě v počtu folikulů u jednotlivých pacientek jsme ještě porovnali vztah mezi počtem folikulů a koncentrací PAPP-A v krevním séru (viz graf 2). Ani zde se neukázala významná korelace.

**Graf 2. Počet folikulů a sérová hladina PAPP-A**

Folikulární membrána tedy neumožňuje přestup významného množství PAPP-A do krve. Z toho lze předpokládat, že stanovení PAPP-A v krvi tedy téměř jistě nebude mít smysl pro predikci OHSS.

Pro zjištění, zda hladina PAPP-A souvisí se vznikem OHSS a zda její hladina umožní predikci závažnosti OHSS, jsme stanovili hladiny folikulárního PAPP-A u pacientek, které vzhledem k počtu punktovaných folikulů měly empiricky vyšší riziko vzniku OHSS – tedy u žen, kde počet punktovaných folikulů byl nad 18, viz tabulku 2.

**Tab. 2. Závislost hladin PAPP-A na stupni závažnosti OHSS**

Výsledky neukazují statisticky významnou (na 5% hladině významnosti) závislost hladin PAPP-A (jak ve folikulární tekutině, tak v krevním séru) na stupni závažnosti OHSS.

Diskuse

V dostupné literatuře k datu 2. 12. 2008 jsme nenalezli žádnou práci, která by sledovala hodnoty PAPP-A ve folikulární tekutině jako prediktor OHSS.

Hodnoty koncentrace PAPP-A ve folikulární tekutině a v krevním séru námi stanovené jsou ve shodě s literaturou [15].

Ve shodě s publikací Moos et al. [10] ani přes vysoký poměr koncentrací PAPP-A ve folikulech a v krvi (přibližně 500 :1) nedochází k výraznému přestupu do krve ve směru koncentračního spádu (není korelace sérových hladin s počtem folikulů, ani s koncentrací folikulárního PAPP-A).

Závěr

Naše práce se jako první zabývala vztahem mezi hladinami PAPP–A a OHSS.

Potvrdili jsme ve shodě s publikací Moos et al. [10], že PAPP-A nepřechází ve významném množství z folikulů do krve.

Získaná data o folikulární koncentraci PAPP-A nepotvrdila hypotézu asociace OHSS se signální drahou využívající PAPP-A. Bude vhodné prozkoumat vztah OHSS s jinými biomarkery, které by pravděpodobně optimálně bylo možné zjistit využitím proteomických technik.

Podpořeno grantem MZ ČR IGA NR/8932-3.

MUDr. Karel Řežábek, CSc.

Gynekologicko-porodnická klinika

1. LF UK a VFN

Apolinářská 18

128 00 Praha 2

e-mail: karel.rezabek@vfn.cz

Zdroje

1. Aboulghar, MA., Mansour, RT. Ovarian hyperstimulation syndrome: classifications and critical analysis of preventive measures. Hum Reprod Update, 2003, 9, 3, p. 275-289.

2. Conover, CA., Faessen, GF., Ilg, KE., et al. Pregnancy-associated plasma protein-a is the insulin-like growth factor binding protein-4 protease secreted by human ovarian granulosa cells and is a marker of dominant follicle selection and the corpus luteum. Endocrinology, 2001, 142, p. 2155.

3. Conover, CA., Bale, LK., Durham, SK., et al. Insulin-like growth factor (IGF) binding protein-3 potentiation of IGF action is mediated through the phosphatidylinositol-3-kinase pathway and is associated with alteration in protein kinase B/AKT sensitivity. Endocrinology, 2001, 142, 5, p. 2155.

4. Gérard, N., Oxvig, C., .et al. Proteolytic degradation of IGF-binding protein (IGFBP)-2 in equine ovarian follicles: involvement of pregnancy-associated plasma protein-A (PAPP-A) and association with dominant but not subordinated follicles. J Endocrinol., 2004, 182, 3, p. 457-466.

5. Hourvitz, A., Kuwahara, A., Hennebold, JD., et al. The regulated expression of the pregnancy-associated plasma protein-A in the rodent ovary: a proposed role in the development of dominant follicles and of corpora lutea. Endocrinology, 2002, 143, 5, p. 1833-1844.

6. Lawrence, JB., Oxvig, C., Overgaard, MT., et al. The insulin-like growth factor(IGF)-dependent binding protein-4 protease secreted by human fibroblasts is pregnancy associated plasma protein-A. Proc Natl Acad Sci USA, 96, p. 3149-3153.

8. Matsui, M., Sonntag, B., Hwang, SS., et al. Pregnancy-associated plasma protein-a production in rat granulosa cells: stimulation by follicle-stimulating hormone and inhibition by the oocyte-derived bone morphogenetic protein-15. Endocrinology, 2004, 145, p. 3686-3695.

9. Mazerbourg, S., Overgaard, MT., Oxvig, C., et al. Pregnancy-associated plasma protein-A (PAPP-A) in ovine, bovine, porcine, and equine ovarian follicles: involvement in IGF binding protein-4 proteolytic degradation and mRNA expression during follicular development. Endocrinology, 2001, 142, 12, p. 5243-5253.

10. Moos, J., Filova, V., Pavelkova, J., et al. Follicular fluid and serum levels of Inhibin A and pregnancy-associated plasma protein A in patients undergoing IVF. Fertil Steril, 2008, E pub ahead of print.

11. Nardo, LG., Bellanca, SA., Burrello, N., et al. Concentrations of insulin-like growth factor (IGF)-I and IGF binding protein-3 in the follicular fluid of women undergoing ovarian hyperstimulation with different gonadotropin preparations. Gynecol Endocrinol., 2001, 15, 6, p. 413-420.

12. Overgaard, MT., Haaning, J., Boldt, HB., et al. Expression of recombinant human pregnancy-associated plasma protein-A and identification of the proform of eosinophil major basic protein as its physiological inhibitor. J Biol Chem, 2000, 275, p. 31128-31133.

13. Oxvig, C., Sand, O., Kristensen, T., et al. Circulating human pregnancy-associated plasma protein-A is disulfide-bridged to the proform of eosinophil major basic protein. J Biol Chem, 1993, 268, p. 12243-12246.

14. Sinosich, MJ., Porter, R., Sloss, P., et al. Pregnancy-associated plasma protein A in human ovarian follicular fluid. J Clin Endocrinol Metab, 1984, 58, p.500-504.

15. Young, Sik Choi, Seung-Yup, Ku, Byung-Chul, Jee, et al. Comparison of follicular fluid IGF-I, IGF-II, IGFBP-3, IGFBP-4 and PAPP-A concentrations and their ratios between GnRH agonist and GnRH antagonist protocols for controlled ovarian stimulation in IVF-embryo transfer patients. Hum Reprod, 2006, 21, 8, p. 2015-2021.