HPLC štúdium vplyvu teploty na separáciu niektorých enantiomérov sulfoxidov, stanovenie niektorých enantiomérov sulfoxidov v sére potkana

Overview

Metylovaný teikoplanín aglykón ako chemicky viazaná chirálna stacionárna fáza (CSP) sa použila na štúdium separácie enantiomérov a štúdium vplyvu teploty na enantioselektivitu niektorých chirálnych sulfoxidov – deväť rôznych aryl metyl sulfoxidov, 1-(metylsulfinyl) naftalén a [(1,1-dimetyl-2-fenyletyl)sulfinyl]benzén v polárnom organickom móde. Vplyv teploty na separáciu enantiomérov sa študoval v rozsahu od 10 °C do 50 °C v metanole ako mobilnej fáze s rozdielnou koncentráciou organického modifikátora v mobilnej fáze. Na základe van’t Hoffových závislostí (grafická závislosť ln k od 1/T a ln α od 1/T, kde k je retenčný faktor, T je teplota a α je selektivitný faktor) sa vypočítali termodynamické parametre pre 12 chirálnych sulfoxidov. Van’t Hoffove závislosti mali lineárny priebeh pre všetky enantioméry. Elučné poradie enantiomérov sa v danom rozsahu teploty nemenili, (S) (+) enantiomér eluoval prvý. Na analýzu sulfoxidov vo vzorke potkanieho séra sa použila extrakcia tuhou fázou, po prečistení vzorky sa číry roztok dávkoval do chirálnej kolóny s mobilnou fázou metanol – kyselina octová (17,48 mmol/l) – dietylamín (4,79 mmol/l). Medza stanovenia sa vypočítala pre všetky študované sulfoxidy a bola v rozsahu od 7,0 do 24,2 ng/ml, účinnosť extrakcie bola v intervale od 82 % do 96 %.

Klúčové slová:
separácia chirálnych látok – metylovaný teikoplanín CSP – sulfoxidy – extrakcia tuhou fázou – HPLC

Úvod

Makrocyklické antibiotiká, zvlášť teikoplanín glykopeptidy, sú veľmi vhodnými chirálnymi selektormi na separáciu enantiomérov väčšiny chirálnych látok ^1–4). V dôsledku väčšieho počtu stereogénnych centier, pri separácii sa môžu využiť rôzne interakčné stereošpecifické mechanizmy, najčastejšie sa vyskytujú polárne a iónové interakcie ^{3, 5)}. Vo všeobecnosti glykopeptidické chirálne selektory využívajú možné interakcie s viacerými funkčnými skupinami naviazaných na skelete aglykónu (napríklad hydroxylová, amínová, amidická, karboxylová skupina), interakcie pomocou π-elektrónov (hlavne benzénové jadrá) a interakcie s hydrofóbnymi centrami. Tieto interakcie umožňujú využiť rozdielne molekulové vlastnosti separovaných látok vrátane hydrofóbnych, iónových, dipól – dipól, π – π a stérických interakcií ⁶⁾. Glykopeptidické chirálne selektory sa môžu použiť aj v reverzom fázovom systéme, v konvenčnom a polárnom – organickom móde ⁷⁾. Účinnosť separácie sa niekedy môže zvýšiť použitím metylovaného teikoplanínu (MTAG), čím sa značne obmedzí tvorba interakcií cez vodíkové väzby a v niektorých prípadoch sa môže podstatne zvýšiť enantioselektivita ^{6, 8)}.

Chirálne sulfoxidy sa často používajú ako intermediátory pri syntézach, dôležitých bioaktívnych látok ^9–12), pri asymmetrických syntézach ^{13, 14)} a zaraďujú sa medzi často používané reagenty pri syntéze liečiv ¹⁵⁾. Z tohto hľadiska je potrebné kontrolovať prítomnosť sulfoxidov v biologických vzorkách. Termodynamické štúdie a zhodnotenie vplyvu teploty na selektivitu separácie enantiomérov sulfoxidov môže vysvetliť niektoré interakčné mechanizmy pri chromatografickej separácii.

Zmenu parciálnej mólovej entalpie (ΔH_i) a zmenu parciálnej mólovej entropie (ΔS_i) pri prechode molekúl separovanej látky z jednej fázy do druhej možno vypočítať podľa van’t Hoffovej rovnici [1]:

kde k_i je retenčný faktor, ΔH_i je zmena parciálnej mólovej entalpie, ΔS_i je zmena parciálnej mólovej entropie, R je plynová konštanta, T je teplota chromatografickej kolóny a φ je pomer fáz definovaný ako pomer objemu stacionárnej fázy V_s, a objemu mobilnej fázy V_m. Uvedená rovnica sa rieši graficky použitím regresnej analýzy tak, že sa zostrojí graf ln k v závislosti od 1/T, potom zo smernice závislosti (–ΔH_i/R) možno vypočítať ΔH_i a ΔS_i, sa vypočíta z úseku na osi y (ΔS_i+ ln φ).

Podobným spôsobom možno zistiť vplyv teploty na enantioselektivitu podľa rovnice [2], ktorá sa rieši graficky použitím regresnej analýzy na základe závislosti lnα od 1/T, kde hodnota Δ(ΔH_2,1) sa vypočíta zo smerice závislosti a  Δ(ΔS_2,1) z úseku na osi y.

Hodnota Δ(ΔH_2,1) reprezentuje rozdiel v zmene entalpie a hodnota Δ(ΔS_2,1) vyjadruje rozdiel v zmene entropie medzi dvojicou enantiomérov. Inými slovami tento rozdiel termodynamických parametrov znázorňuje zmenu uvedených termodynamických parametrov, ktorá je potrebná na enantioseparáciu.

Cieľom tejto práce bolo preskúmať vplyv zloženia mobilnej fázy na selektivitu separácie z hľadiska termodynamických parametrov pri použití MTAG ako chirálnej stacionárnej fázy. Na úpravu biologickej vzorky pred dávkovaním do chirálnej chromatografickej kolóny sa použila extrakcia tuhou fázou (SPE).

POKUSNÁ ČASŤ

Chemikálie

Štruktúra študovaných chirálnych sulfoxidov sa uvádzajú na obrázku 1. Všetky sulfoxidy sa pripravili na Ústave analytickej chémie, Fakulta chemickej a potravinárskej technológie, STU v Bratislave podľa postupu uvedeného v literatúre ^{16, 17)}. Chemikálie a rozpúšťadlá pre HPLC (metanol, kyselina octová, dietylamín a voda) sa zakúpili od fy. Merck (Nemecko).

Prístrojová technika

V práci sa použil kvapalinový chromatografický systém Hewlett Packard 1100, ktorý pozostával z vysokotlakového čerpadla, dávkovacieho ventilu (Rheodyne 7724) s 20 μl dávkovacou kapilárou, spektrofotometrický detektor s diódovým poľom a polarimetrický detektor (Chiralyzer, IBZ MESSTECHNIK, Nemecko). Detektory boli zapojené v sérii. Teplota chromatografickej chirálnej kolóny sa kontrolovala termostatom (LCT 5100, INGOS, Česká republika).

Pracovný postup

Chirálna kolóna (150× 4,6 mm I.D., Astec, USA) s metylovaným aglykónom teikoplanínu (MTAG) sa použila na štúdium chirálnych vlastností enantiomérov sulfoxidov. Mobilnou fázou boli čistý metanol (MP1) a metanol so 17,48 mmol/l kyseliny octovej (Hac) a s rozdielnou koncentráciou dietylamínu (Dea). Použili sa nasledujúce koncentrácie Dea: bez prídavku Dea (MP2), ďalej s prídavkami 2,39 mmol/l (MP3), 4,79 mmol/l (MP4), 9,57 mmol/l (MP5) a 14,36 mmol/l (MP6). Termodynamické parametre sa merali pri izotermických podmienkach v rozsahu teplôt od 10 °C do 50 °C pri 10 °C intervaloch. Relatívna smerodajná odchýlka teploty kolóny bola ± 0,1 °C. Analyty sa rozpustili v metanole (koncentrácia 1 mg/ml). Roztoky štandardov sa zriedili na konečné koncentrácie v rozsahu od 2,5 μg/ml do 100 μg/ml (5 roztokov s rôznymi koncentráciami). Roztoky štandardov sa pripravili pre každú racemickú zmes a rovnica kalibračnej priamky sa vypočítala metódou regresnej analýzy. SPE sa použila na prípravu vzoriek potkanieho séra k analýze, ku ktorým sa pridali prídavky štandardu, tak aby koncentrácia štandardov bola 5 μg/ml séra. SPE kolónka OASIS HLB (30 mg, 1ml, Waters, Ireland) sa najprv premyla 1 ml metanolom a 1 ml deionizovanej vody; 0,5 ml vzorky séra sa nadávkovalo do SPE kolónky. Po nadávkovaní sa SPE kolónka premyla 1 ml zmesou deionizovanej vody a metanolu (95/5 v/v). Sorbované analyty sa vymyli zmesou metanolu, 17,48 mmol/l kyseliny octovej a 4,79 mmol/l dietylaminu (MP4) v objeme 0,5 ml. 20 μl eluátu sa potom dávkoval do chirálnej chromatografickej kolóny. Rovnaký pracovný postup sa použil aj pri analýze potkanieho séra bez prídavku štandardu. Na detekciu separovaných látok sa použila vlnová dĺžka 254 nm. Elučné poradie separovaných enantiomérov sulfoxidov sa zistilo polarimetrickým detektorom a pre všetky racemické zmesi študovaných sulfoxidov sa prvý eluoval (S) (+) - enantiomér.

Výsledky a diskusia

Závislosť hodnôt retenčných faktorov jednotlivých enantiomérov od zloženia mobilnej fázy je na obrázku 2. Hodnoty retenčných faktorov klesajú so zvyšovaním koncentrácie Dea v mobilnej fáze. Ak mobilnou fázou je čistý metanol (MP1), potom retenčné faktory nadobúdajú vyššie hodnoty v porovnaní s inými mobilnými fázami s organickými modifikátormi. Možno predpokladať, že acidita alebo bazicita ale aj iónová sila mobilnej fázy má vplyv na retenčný mechanizmus študovaných enantiomérov sulfoxidov. Na druhej strane hodnoty selektivitných faktorov sa zvyšujú so zvyšovaním bázicity mobilnej fázy do určitej hodnoty, kedy zrejme sa mení interakčný mechanizmus (obr. 3).

V tabuľkách 1–6 sa uvádzajú termodynamické parametre, ktoré sa vypočítali zo vzťahov 1 a 2. Podmienkou správneho výpočtu týchto parametrov je, aby van’t Hoffove závislosti (ln k_i vs. 1/T) boli lineárne v danom rozsahu teplôt. Pre všetky študované sulfoxidy hodnoty korelačných koeficientov van’t Hoffových závislostí boli nad hodnotou 0,99, čo dokumentovalo lineárny priebeh závislostí. Podobne v prípade závislostí enantioselektivity od teploty (obr. 4) boli hodnoty korelačných koeficientov v rozsahu od 0,98 do 0,99. Na základe získaných výsledkov možno konštatovať, že v danom rozsahu teplôt nedochádza k zmene retenčného mechanizmu a k zmene poradia eluovaných enantiomérov, enantiomér (S) (+) mal hodnotu retenčného faktora vždy nižšiu ako enantiomér (R) (-). Závislosť retenčného faktora od teploty čiastočne ovplyvňovala zmena zloženia mobilnej fázy (tab. 1–6).

Na stanovenie enantiomérov sulfoxidov v biologických vzorkách sa musela použiť extrakcia tuhou fázou, čím sa dosiahlo skoncentrovanie sulfoxidov v menšom objeme a zabránilo sa možnému znehodnoteniu chirálnej kolóny MTAG v dôsledku ireverzibilnej sorpcie látok z biologickej vzorky. Postup pri extrakcii je opísaný v Experimentálnej časti. Účinnosti extrakcie tuhou fázou s hodnotami medze stanovenia (LOD) pre všetky študované sulfoxidy sa uvádzajú v tabuľke 7. Na obrázku 5 sa prezentujú chromatografické záznamy separácie sulfoxidov v reálnej vzorke. Je zrejmé, že teplota ovplyvňuje hodnoty retenčných faktorov sulfoxidov prítomných v sére potkana. Z obrázku vyplýva, že i pri vyššej teplote chromatografickej kolóny nedochádza k interferencii s ostatnými látkami zo vzorky a týmto spôsobom možno skrátiť čas analýzy.

Táto práca sa uskutočnila vďaka finančnej podpore Grantovej agentúry Slovenskej republiky (grant 1/0058/08), APVV projekt No. 20-035-205 and VEGA projekt č. 1/4291/07.

Došlo 23. března 2009 / Přijato 15. dubna 2009

Adresa pre korešpondenciu:

prof. ing. Jozef Lehotay, DrSc.

Ústav analytickej chémie FChPT, STU

Radlinského 9, 812 37 Bratislava, SR

e-mail: jozef.lehotay@stuba.sk