Může analýza buněčného lipidomu přispět k rozlišení nádorových a nenádorových buněk tlustého střeva?

Overview

Východiska:
Rozvoj nádorového onemocnění tlustého střeva je mimo jiné charakterizován abnormalitami v syntéze a metabolizmu lipidů, ovlivňujícími energetickou rovnováhu, strukturu a funkci biologických membrán, produkci specifických mediátorů a buněčné signálování. Změny buněčného lipidového profilu a metabolizmu (lipidomu) zásadně ovlivňují chování buněk i jejich odpověď na terapii. K lepšímu pochopení problematiky na buněčné a molekulární úrovni jsou využívány permanentní linie epiteliálních buněk tlustého střeva různého stupně nádorového rozvoje. Naše práce vycházela z předpokladu, že detailní analýza lipidomu různých buněčných linií tlustého střeva může odhalit takové rozdíly v množství a profilu specifických tříd/typů lipidů, které se mohou podílet na jejich rozdílné odpovědi k různým podnětům.

Materiál a metody:
Z buněk šesti lidských epiteliálních linií tlustého střeva odvozených z tkáně v různém stupni nádorového rozvoje byly izolovány lipidy a podrobeny LC/MS/MS (kapalinová chromatografie s tandemovou hmotnostní spektrometrií) analýze. Bylo stanoveno množství a hmotnostní profily všech tříd fosfolipidů (PL), lysofosfolipidů (lysoPL) a sfingolipidů. Tato data byla matematicky vyhodnocena (shluková a diskriminační analýza) s ohledem na vzájemné srovnání linií a na významně diskriminující typy lipidů.

Výsledky:
Výsledky shlukové analýzy seřadily buněčné linie dle stupně jejich nádorové transformace (normální buňky, adenom, karcinom, lymfatická metastáza). Výsledky diskriminačních analýz odhalily nejvíce rozlišující typy lipidů i odlišnosti v poměru PL: lysoPL. Ukázaly se zejména významné korelace zastoupení a profilu některých specifických tříd lysoPL a sfingolipidů se stupněm nádorové transformace buněk. Podobné přístupy jsou nyní aplikovány při srovnání lipidomu střevních epiteliálních buněk izolovaných z nádorové vs. nenádorové tkáně pacientů s nádory tlustého střeva.

Závěr:
Naše výsledky ukázaly, že a) vybrané buněčné linie jsou vhodným modelem pro lipidomické studie a mohou sloužit jako základ k navazujícímu klinickému výzkumu, b) analýza buněčného lipidomu by mohla přispět k rozlišení nádorových a nenádorových buněk také u klinických vzorků, u nichž by specifické typy lipidů mohly být využity jako biomarkery.

Klíčová slova:
nádory tlustého střeva – buněčné linie – kapalinová chromatografie – hmotnostní spektrometrie – fosfolipidy – sfingolipidy – bioinformatika

Východiska

Rozvoj nádorového onemocnění tlustého střeva je kromě jiného provázen abnormalitami v buněčném metabolizmu, které zahrnují rovněž specifické změny v syntéze, signálování a metabolizmu lipidů. Ty kromě energetické rovnováhy ovlivňují strukturu a funkce biologických membrán, a tak i aktivitu různých receptorů a transportérů, produkci specifických lipidových metabolitů, redoxní stav a buněčné signálování [1]. V souhrnu tzv. buněčný lipidom zásadně ovlivňuje buněčné chování a funguje jako důležitý modifikátor nádorů tlustého střeva [2]. Celkové změny pak přispívají k heterogenitě nádorů a ovlivňují odpověď buněk na endogenní i exogenní podněty vč. terapie. Existují studie dokumentující významné změny jak obsahu a složení fosfolipidů (phospholipids – PL), tak mastných kyselin (MK) doprovázející maligní transformaci tlustého střeva [3]. Pacienti často vykazují abnormality v profilu MK v plazmě a membránách erytrocytů [4]. Hledání rozdílů mezi nádorovou a nenádorovou tkání směřuje k nalezení takových změn lipidů a jejich metabolizmu, které by mohly sloužit jako biomarkery vývoje těchto onemocnění.

Buněčné linie odvozené z nádorové či nenádorové tkáně tlustého střeva jsou vhodným modelem pro studium molekulárních mechanizmů působení endogenních regulátorů i látek z vnějšího prostředí vč. složek diety a farmak. Výzkum změn jejich lipidomu může přinést další užitečný úhel pohledu a položit základ pro navazující klinické studie. Naše předcházející výsledky ukazují, že modulace lipidomu buněčných linií tlustého střeva působením dietetických polynenasycených MK (např. kyselina dokosahexaenová – DHA) a MK s krátkým řetězcem (butyrát) významně ovlivňuje proliferaci a apoptózu buněk tlustého střeva, přičemž odpověď na dané podněty se liší u buněk v různém stupni nádorového rozvoje [5,6]. I když přibývají další studie, spojitost specifických typů MK či lipidů a změn jejich metabolizmu s určitým stadiem rozvoje nádorů není doposud zdaleka objasněna. Naše práce proto vycházela z předpokladu, že detailní analýza lipidomu různých buněčných linií tlustého střeva může odhalit takové rozdíly v množství a profilu specifických lipidů, které se mohou podílet na jejich rozdílné odpovědi k různým podnětům.

Materiál a metody

Byl použit panel linií lidských epiteliálních buněk tlustého střeva kultivovaných standardně v příslušném médiu s 10 % fetálního séra. Linie byly odvozeny z tkáně normálního střeva – NCM460 (M300F medium – Incell corporation), adenomu – (AA/C1 – medium DMEM), diferencujícího (HT29) a nediferencujícího adenokarcinomu (DLD1, HCT-116) a lymfatické metastázy (SW620 – medium McCoy‘s 5A). Buňky byly sbírány v exponenciální fázi růstu, promyty a shromážděny v 1 ml metanolu. Lipidy byly extrahovány a analyzovány jak bylo uvedeno dříve [5]. PL a sfingolipidy byly separovány z 10⁷ buněk s využitím kapalinové chromatografie (HPLC, Agilent 1200) a detekovány tandemovou hmotnostní spektrometrií (TripleQuad 6410 s ESI a APPI, Agilent). K vyhodnocení hmotnostních spekter (plochy chromatografických píků) každé lipidové třídy/podtypů (PL, lysoPL a sfingolipidy) byl využit software MassHunter (Agilent). Data byla kvantifikována s využitím příslušných lipidových standardů a normalizována na 10⁶ buněk.

Množství lipidů je reprezentováno průměrem ze tří nezávislých opakování. Pro třídy PL jsou to fosfatidyl-cholin (phosphatidylcholines – PC), -etanolamin (phosphatidylethanolamine – PE), -serin (phosphatidylserine – PS), -inositol (phosphatidylinositol – PI) a kyselina fosfatidová (phosphatidic acid – PA). Byla kvantifikována celková suma PL. Pro ostatní třídy – lysoPL všech tříd a sfingolipidy (sfingomyelin (SM), ceramid (Cer), hexaceramid (HexCer), lactoceramid (LacCer) a lysoPL všech tříd) – bylo stanoveno také množství jednotlivých lipidových podtypů v hmotnostních profilech. Vzhledem k lognormálnímu rozložení dat byly hodnoty vyjadřující množství lipidů transformovány funkcí Log10. Analýza byla provedena ve dvou úrovních – 1. zastoupení lipidů z jednotlivých tříd jako celku a 2. zastoupení podtypů z dostupných tříd. Podobnost linií byla hodnocena pomocí shlukové analýzy (Wardova metoda, čtverec euklidovské vzdálenosti) na základě a) celkového zastoupení lipidů v jednotlivých třídách, b) zastoupení jednotlivých podtypů z vybraných tříd a c) poměru PL: lysoPL.

Výsledky

Matematické vyhodnocení dat získaných analýzou lipidů odhalilo, že již celkové množství jednotlivých lipidových tříd (PC, PE, PS, PI, příslušných lysoPL a sfingolipidů) rozlišilo jednotlivé buněčné linie. Výsledky shlukové analýzy seřadily linie dle stupně jejich nádorového potenciálu (normální buňky, adenom, karcinomy, lymfatická metastáza) (obr. 1). Data byla dále podrobena diskriminační analýze a vizualizována jako heat mapy. Nejvíce zastoupené třídy PL nevykázaly velký rozlišovací potenciál. Jako nejvíce diskriminující byly určeny na základě rozptylu hodnot mezi liniemi vůči jejich průměru (poměr SD a průměru) lysoPI, lysoPE, lysoPC a Cer. Proto byly dále detailněji vyhodnoceny i rozdíly v hmotnostních profilech lysoPL a sfingolipidů. Zde se projevila diskriminující úloha zejména některých dihydroCer a SM a nenasycených lysoPI. Posledním kritériem byl poměr jednotlivých PL: lysoPL. U normálních buněk NCM460 byl tento poměr výrazně nižší ve srovnání s ostatními liniemi. Vyšší zastoupení lysoPL tak ukazuje na sníženou syntézu PL. Nejvíce diskriminující byl pak poměr PI: lysoPI (obr. 2).

Diskuze

Výsledky lipidových analýz jasně prokázaly možnost odlišit od sebe různé typy buněk tlustého střeva podle několika aspektů celkového množství a hmotnostního profilu buněčných lipidů. Množství některých typů zejména lysoPL a sfingolipidů ukázalo na podobnosti či rozdílnosti jednotlivých linií. Specifické diskriminující podtypy v profilech těchto tříd a intenzita syntézy PL zjištěná z poměrů PL: lysoPL pak dále rozlišily zkoumané linie. Za důležité lze považovat zejména změny v úrovni a profilu lysoPL (např. lysoPI, který je ligandem receptoru GPR55) [7] a dále některých typů ceramidů a SM fungujících jako signální molekuly [8].

Závěr

Naše data potvrzují, že vybrané buněčné linie jsou vhodným modelem pro lipidomické studie a mohou sloužit jako základ pro navazující výzkum na klinickém materiálu. Podobné přístupy jsou nyní aplikovány při výzkumu lipidomu střevních epiteliálních buněk (izolace EpCAM pozitivních buněk na magnetických kuličkách) z nádorové a přilehlé nenádorové tkáně pacientů s nádory tlustého střeva. Cílem je detekovat takové typy lipidů a molekul regulujících lipidový metabolizmus, které odlišují nádorové a nenádorové buňky (biomarkery), a tak přispět k lepší diagnostice/prognóze u nádorů tlustého střeva.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Práce byla realizována za podpory agentury Aplikovaného zdravotnického výzkumu (AZV) MZ ČR pod reg. č. AZV 15-30585A.

prof. RNDr. Jiřina Hofmanová, CSc.

Oddělení cytokinetiky

Biofyzikální ústav AV ČR, v. v. i.

Královopolská 135 612 65 Brno

e-mail: hofmanova@ibp.cz

Obdrženo: 19. 3. 2018

Přijato: 18. 4. 2018