Analýza mikroRNA u extramedulárního relapsu mnohočetného myelomu

Východiska a cíle:
Mnohočetný myelom (MM) je druhé nejčastější hematoonkologické onemocnění. Zavedení nových léků do klinické praxe vedlo k výraznému zlepšení přežívání pacientů s MM. I přes tato opatření je přežívání pacientů negativně ovlivněno tzv. extramedulárním relapsem (EM). EM je způsoben ztrátou závislosti plazmatických buněk na mikroprostředí kostní dřeně a jejich migrací do měkkých tkání. Podstata a příčina tohoto procesu nejsou doposud objasněny. MikroRNA (miRNA) jsou krátké, nekódující molekuly RNA, které jsou zapojeny do mnoha fyziologických, ale i patologických procesů. V rámci několika studií byl prokázán význam těchto molekul i u patogeneze MM. Předpokládáme, že se miRNA podílejí rovněž na rozvoji EM. Cílem naší práce bylo analyzovat rozdílné exprese miRNA mezi skupinou MM a EM pacientů.

Materiál a metody:
Pomocí sekvenování nové generace bylo analyzováno 39 vzorků plazmatických buněk z kostní dřeně pacientů s MM při diagnóze a 9 vzorků plazmatických buněk z kostní dřeně nemocných s EM.

Výsledky:
Celkem bylo sekvenováno 2 278 miRNA, ale do analýzy bylo zahrnuto 658 miRNA, které byly exprimovány u všech vzorků a měly nejméně 20 čtení. Expresní data byla generována pomocí Chimira tool z fastq dat. Všechny sekvence byly mapovány pomocí miRBase v20. Další analýzy byly provedeny s použitím R/Bioconductor package. Pro normalizaci exprese byl použit Bayesův postup. P hodnoty byly adjustovány s použitím Benjamini-Hochberg metody. Analýza prokázala, že existuje 10 miRNA (p < 0,0005), které jsou statisticky signifikantně exprimovány u EM vs. MM pacientů – konkrétně se jedná o miR-26a-5p, miR-26b-5p, miR-30e-5p, miR-424-3p, miR-503-5p, miR-767-5p, miR-105-5p, miR-5695-5p, miR-450b-5p a miR-92b-3p. Tyto miRNA budou dále ověřeny metodou qPCR na větším souboru pacientů s MM a EM.

Závěr:
Naše pilotní studie ukázala, že existuje rozdíl expresních hladin některých miRNA mezi skupinou pacientů s MM a EM.

Klíčová slova:
mnohočetný myelom – mikroRNA – karcinogeneze – sekvenování nové generace

Úvod

S rozvojem sekvenačních metod bylo zjištěno, že je pouze malá část lidského genomu tvořena protein-kódujícími sekvencemi. Bylo stanoveno, že pouze 1,2 % genomu savců je z DNA přepisováno do mRNA. Ostatní sekvence byly považovány za tzv. junk DNA [1,2]. Následně se ukázalo, že tato junk DNA je přepisována do specifických molekul RNA, které ovšem nekódují proteiny [3], ale vykonávají funkce právě ve formě RNA. Tyto nekódující molekuly RNA tvoří přibližně 98 % genomu [4]. Značné množství protein-nekódujících RNA je asociováno s vývojem vyšších organizmů. Podle délky fragmentů bývají tyto nekódující transkripty rozdělovány na krátké (short non-coding RNA – sncRNA) a dlouhé nekódující molekuly RNA (long non-coding RNA – lncRNA) [1,3]. Hraniční hodnota délky fragmentů, rozdělující tyto molekuly do dvou uvedených skupin, je 200 nt [5]. Sekvence sncRNA nepřesahují délku 200 nt a podílejí se především na regulaci translace mRNA. LncRNA jsou naopak delší než 200 nt a jejich funkce jsou velmi rozmanité [6].

Jednou z hlavních tříd sncRNA jsou mikroRNA (miRNA). Tyto krátké (21–23 nt) jednořetězcové molekuly RNA jsou vysoce konzervované a regulují genovou expresi. Molekuly miRNA mají klíčovou úlohu v mnoha biologických procesech, ale i tumorigenezi [7]. miRNA fungují jako negativní regulátory genové exprese. Bylo zjištěno, že regulace prostřednictvím miRNA může probíhat dvěma různými způsoby v závislosti na stupni komplementarity mezi miRNA a cílovou mRNA. Vazba miRNA na příslušnou mRNA indukuje RNA zprostředkovanou interferenční (RNAi) dráhu. Při vysokém stupni komplementarity mezi sekvencemi dochází k degradaci cílové mRNA. Převládajícím mechanizmem u většiny živočišných buněk je pouze umlčení cílové mRNA vzhledem k neúplné sekvenční komplementaritě miRNA a mRNA. Molekuly miRNA vážou s neúplnou komplementaritou na 3’ nepřekládané oblasti (UTRs) jejich mRNA cíle a potlačují jeho genovou expresi posttranskripčně, zejména na úrovni translace [8]. Funkcí miRNA je tedy negativní regulace hladiny proteinů bez ovlivnění hladin mRNA. Nicméně se ukazuje, že i neúplně komplementární miRNA mohou indukovat mRNA degradaci [9,10].

Přibližně polovina anotovaných lidských miRNA je mapována do fragilních míst chromozomů. Nedávné studie naznačují, že miRNA mohou fungovat jako nádorové supresory a onkogeny, a proto jsou označovány jako oncomirs. Faktory, které jsou potřebné pro biogenezi miRNA, jsou rovněž spojovány s různými typy nádorových onemocnění a mohou mít samy funkci nádorových supresorů a onkogenů. Dále bylo zjištěno, že subtypizace a klasifikace nádorů do určitých podskupin pomocí jejich miRNA profilů je přesnější než klasifikace pomocí expresních profilů protein-kódujících genů. Právě rozdíly v expresi určitých miRNA v různých typech nádorových onemocnění by se mohly stát velice užitečným nástrojem při diagnóze a léčbě nádorů [11].

Mnohočetný myelom (MM) je krevní nádorové onemocnění, které je charakterizováno infiltrací kostní dřeně (KD) monoklonálními plazmatickými buňkami (plasma cells – PC), osteolytickými lézemi a přítomností monoklonálního imunoglobulinu v séru a/nebo v moči. Během posledních 10 let bylo dosaženo velkých úspěchů v léčbě, která vedla ke zvýšení mediánu přežití až na 7–8 let [12]. Na druhou stranu éra nových léků přinesla i nová úskalí. Jedním s nich je zvýšená incidence tzv. extramedulárního relapsu (EM) [13]. Proces vývoje EM je zahájen vycestováním subklonu PC a jejich infiltrací do měkkých tkání, tyto buňky ztrácí závislost na mikroprostředí KD [14]. Některé studie ukázaly přítomnost sekundárních změn v subklonu PC, agresivní progresi nemoci a špatnou prognózu pro pacienty [15]. Další hypotézou pro zvýšenou incidenci EM je možnost, že vysoká aktivita nových léčebných protokolů téměř dokonale vymýtí senzitivní maligní buňky, nicméně vede k vývoji rezistentních, agresivních buněk, které ztrácí závislost na mikroprostředí KD [16]. Hypoteticky je možné, že kombinace nových léčebných modalit selektuje více agresivní klony, které osídlují i měkké tkáně [16]. Jiné studie tuto teorii zavrhují [17].

První studie o EM se objevily již ve 40. a 50. letech 20. století [18,19]. Je tedy zřejmé, že EM není nová entita, ale objevoval se i před érou chemoterapie. V současné době však není jasná incidence ani molekulární mechanizmy, které vedou ke vzniku EM. Existuje velmi málo studií, které analyzovaly větší počet pacientů [13,14,20], většina dalších publikací používala velmi malé kohorty.

EM může být identifikován při diagnóze MM (tzv. primární EM) nebo při relapsu MM (tzv. sekundární EM). Další rozlišení EM, které zatím není běžné, je rozlišení podle stupně „samostatnosti“ EM buněk. EM-B (bone-related) je EM, kdy buňky vytvoří nádor, který je stále svou částí připojen ke kosti. Buňky jsou tak alespoň částečně závislé na mikroprostředí KD. Druhým typem je EM-S (soft-tissue), kdy buňky vycestovávají do měkkých tkání, kde buď tvoří nádorky, nebo infiltrují do celého orgánu a jsou již zcela nezávislé na mikroprostředí KD [13]. Důvody a podmínky, za jakých jsou PC schopny vycestovat z KD a přežívat bez pomoci a podpory cytokinů a stromálních buněk, nejsou objasněny.

Vzhledem k tomu, že se miRNA podílejí na mnoha procesech, vč. tumorigeneze, je naší hypotézou zapojení miRNA v procesu EM relapsu. Cílem této práce je pak stanovit rozdílně exprimované miRNA mezi dvěma skupinami pacientů – MM při diagnóze a EM.

Materiál a metody

Pomocí sekvenování nové generace bylo analyzováno 39 vzorků separovaných PC z KD pacientů s MM při diagnóze a 9 vzorků PC z KD nemocných s EM. Všichni pacienti podepsali informovaný souhlas schválený etickou komisí před zařazením do studie.

Výsledky

Celkem bylo sekvenováno 2 278 miRNA, ale analyzováno bylo pouze 658 miRNA, které byly exprimovány u všech vzorků a měly nejméně 20 čtení. Expresní data byla generována pomocí Chimira tool z fastq dat. Všechny sekvence byly mapovány pomocí miRBase v20. Další analýzy byly provedeny s použitím R/Bioconductor package. Pro normalizaci exprese byl použit Bayesův postup. P hodnoty byly adjustovány s použitím Benjamini-Hochberg metody.

Analýza prokázala, že existuje 10 miRNA (p < 0,0005), které jsou statisticky signifikantně exprimovány u EM vs. MM pacientů – jsou to miR-26a-5p, miR-26b-5p, miR-30e-5p, miR-424-3p, miR-503-5p, miR-767-5p, miR-105-5p, miR-5695-5p, miR-450b-5p a miR-92b-3p. Tyto miRNA budou dále ověřeny metodou qPCR na větším souboru pacientů s MM a EM.

Závěr

Naše pilotní studie ukázala, že existují rozdílně exprimované miRNA mezi skupinou pacientů s MM a EM.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Tato práce byla podpořena grantem MZ ČR AZV 17-29343A.

doc. RNDr. Sabina Ševčíková, Ph.D.

Babákova myelomová skupina

Ústav patologické fyziologie, LF MU

Kamenice 5 625 00 Brno

e-mail: sevcik@med.muni.cz

Obdrženo: 17. 3. 2018

Přijato: 20. 3. 2018