Nové možnosti testování chemosenzitivity u nádorových onemocnění

Overview

Východiska:
Vzhledem k nezastupitelné úloze chemoterapie při léčbě nádorových onemocnění se onkologický výzkum zaměřil na zvýšení účinnosti jednotlivých léčiv a maximální zmírnění, ne-li kompletní potlačení nežádoucích účinků. Vhodná léčba je primárně volena podle základních klinicko-patologických diagnostických kritérií, jako je velikost nádoru, stupeň diferenciace a přítomnost či absence standardních markerů. Situaci však komplikuje variabilita mezi jednotlivými pacienty spolu se značnou heterogenitou vlastního nádoru. Detailní charakterizace intratumorální heterogenity a získání spolehlivějších ukazatelů účinnosti léčiv by tak mělo vést k posílení personalizované terapie. Vývoj a výběr spolehlivých modelů tudíž představuje důležitou otázku ve výzkumu zaměřeném na predikci citlivosti nádorových buněk k léčbě.

Cíl:
Práce shrnuje poznatky o testovacích systémech zaměřených na stanovení citlivosti či rezistence nádorových buněk k chemoterapii a jejich zavádění do onkologické praxe od prvních dnes již historických pokusů až po současnost se snahou posoudit jejich uplatnění ve stávající klinické praxi či blízké budoucnosti. Značný důraz je kladen na porovnání 2D a 3D in vitro buněčných modelů, neboť jejich význam a popularita konstantně narůstá. Pozornost je též věnovaná systémům in vivo, které v poslední době zaznamenaly nemalý progres a jsou v rámci klinických studií testovány k predikci odpovědi na podávanou terapii.

Závěr:
Práce uvádí stručný přehled testů chemosenzitivity a hodnotí význam jednotlivých testů vzhledem k jejich zapojení do rozhodovacího procesu a stratifikace pacientů s cílem predikovat klinickou odpověď konkrétních pacientů a přispět tak k rozvoji cílené personalizované terapie.

Klíčová slova:
techniky tkáňových kultur – individualizovaná medicína – screening léčiv – biologické modely – nádorové buněčné linie – karcinom – cytotoxické testy

Úvod

Za ideálních podmínek ošetřující lékař správně diagnostikuje onemocnění a nasadí vhodnou léčbu, která bere v potaz celkový zdravotní stav pacienta a je současně maximálně účinná, avšak pokud možno bez nežádoucích vedlejších účinků (NÚ). V případě nádorových onemocnění je situace mnohem komplikovanější, neboť rakovina je značně heterogenní onemocnění. Jinými slovy i v případě nádorů nacházejících se ve stejné tkáni nemusí být tatáž léčba vždy rovnocenně účinná. Kromě toho je stále častěji skloňován i fenomén tzv. intratumorální heterogenity. To znamená, že nádorová masa je tvořena buněčnými populacemi (klony), které se mohou významně lišit v celé řadě vlastností vč. citlivosti k podávané léčbě. Avšak i přes tato úskalí jsou usilovně vyvíjeny testovací systémy, které by umožnily účinně predikovat citlivost nádorů k dostupným léčebným modalitám a zefektivnily by tak vlastní terapeutický efekt za současného minimalizování pro organizmus mnohdy značně devastujících NÚ protinádorové léčby.

Chemoterapie představuje jednu ze základních modalit při léčbě nádorových onemocnění. Jedná se o systémovou terapii, při níž jsou podávána tzv. cytostatika, jejichž cílem je usmrtit nádorové buňky. Připravují se nejčastěji synteticky, případně se jedná o deriváty pocházející z rostlin či plísní. Cytostatika obecně zasahují do průběhu buněčného cyklu a brání dalšímu dělení buněk. Proto jsou k nim velmi citlivé právě rychle se dělící nádorové buňky, případně buňky se sníženou schopností opravovat poškozenou DNA. Je třeba si však uvědomit, že chemoterapie působí nespecificky a účinky cytostatik se manifestují i vzhledem k fyziologicky rychle se dělícím buňkám, a to je spojeno právě s řadou NÚ. Tato skutečnost je jedním z hlavních důvodů neutuchajícího výzkumného úsilí o vývoj nových, selektivnějších a současně účinnějších léků. Nemalý úspěch zaznamenaly např. inhibitory tyrozinkináz interferující s významnými onkogenními signálními dráhami [1]. Renesanci v současné době zažívá imunoterapie, která je efektivní u celého spektra nádorových onemocnění, a není tudíž omezena jen na specifické skupiny nádorů a především její účinnost je dlouhodobá [2,3]. Dalším důležitým aspektem při léčbě nádorových onemocnění je možnost predikovat účinnost jednotlivých potenciálně aplikovatelných léků a zvolit tak pro daného pacienta co možná nejvhodnější, resp. nejúčinnější léčebný režim. První oficiální snahy v tomto směru se datují již ke konci první poloviny 20. století, kdy byly vyvíjeny a zaváděny první in vitro testy [4]. Přestože se jedná o značně atraktivní aplikovaný výzkum se zjevným praktickým uplatněním, dosud nebyl vytvořen, schválen ani systematicky zaveden univerzální protokol umožňující personalizovanou predikci chemosenzitivity u nádorových onemocnění.

Cílem této práce je shrnout poznatky o testovacích systémech založených na kultivaci nádorových buněk, příp. nádorových xenotransplantátů umožňujících stanovení citlivosti/rezistence nádorových onemocnění k chemoterapii vč. snahy o jejich zavádění do onkologické praxe od prvních dnes již historických pokusů až po současnost a posoudit jejich uplatnění ve stávající klinické praxi či blízké budoucnosti.

Historie testování chemosenzitivity nádorových onemocnění

Od 50. let minulého století byly vyvíjeny přístupy umožňující testování citlivosti lidských nádorových buněk k cytostatikům v podmínkách in vitro s cílem najít jednodušší alternativu k testům aktivity tehdy dostupných účinných látek prováděným především na hlodavcích.

První pokus popsali Black a Speer v roce 1954 [5]. Inkubovali řezy nádorové tkáně s cytostatiky a pozorovali inhibici metabolické aktivity buněk pomocí tetrazoliové soli. V několika následujících desetiletích byla publikována řada studií srovnávajících na podobném principu vyvinuté in vitro testy (ať již buňky kultivované v monovrstvě, nebo tkáňové řezy) s hodnocením citlivosti orgánových kultur in vivo s obecným cílem optimalizovat in vitro testy a přiblížit se stavu in vivo. Závěry mnoha z nich však připustily, že korelace výsledků není absolutní, přičemž testy in vitro jsou zatíženy řadou negativních faktorů, které jsou evokovány izolací buněk z původního mikroprostředí [6,7] a promítají se i do hodnocení metabolické aktivity buněk kultivovaných in vitro. Z metodických, tehdy zaváděných přístupů k testování životaschopnosti nádorových buněk se ujaly především ty, které byly založené na stanovení metabolické aktivity, jako je např. měření enzymatické aktivity sukcinát dehydrogenázy [5], kyselé fosfatázy [8,9] či založené na analýze inkorporace radioaktivně značených prekurzorů 3H-uridinu/3H-thymidinu během syntézy nukleových kyselin [10–12] v krátkodobých buněčných kulturách. Další skupinu představují metody hodnotící viabilitu testovaných buněk na bázi membránové integrity pomocí selektivního barvení mrtvých buněk. Tyto však byly obecně vnímány jako přístupy produkující nepřesné výsledky a v porovnání s ostatními metodami byly hodnoceny spíše jako nevyhovující [13,14].

V roce 1977 Hamburger a Salmon [15] kultivovali nádorové buňky na měkkém agarovém médiu a ke stanovení jejich chemosenzitivity použili test nazvaný HTCA (Human Tumor Colony Assay), který je založen na selektivním růstu nádorových buněk na médiu umožňujícím vznik kolonií. Přibližně po 10–21 dnech kultivace jsou kultury ovlivněné cytostatiky a kontrolní kultura vzájemně porovnány vzhledem k počtu vytvořených kolonií, z čehož se následně vyvozuje účinek testované látky.

Kangas et al [16] a Sevin et al [17,18] navíc využili k testování chemorezistence in vitro měření hladiny adenozin trifosfátu (adenosine triphosphate – ATP) jako základního zdroje energie živých buněk, a to pomocí bioluminiscence. Izolované buňky nádoru/shluky buněk byly kultivovány na agarovém médiu a po 6–7 dnech byl ATP z buněk extrahován, přidán komplex luciferin-luciferáza a hladina bioluminiscence byla měřena luminometrem.

Nejrozšířenější metodou stanovení citlivosti nádorových buněk in vitro se však stal tetrazoliový test (MTT test) [5,19,20] vycházející z původního konceptu a postupně zdokonalovaný díky vývoji kultivačních médií a laboratorního vybavení. Izolované buňky nádoru jsou kultivovány v kultivačních deskách s médiem obsahujícím cytostatikum o různých koncentracích a přežívání buněk v tomto prostředí je hodnoceno na základě zachování jejich metabolické aktivity. Ta je hodnocena mírou schopnosti živých buněk redukovat žlutou rozpustnou tetrazoliovou sůl, MTT (3-[4,5-dimethylazol-2-yl]-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromid), pomocí mitochondriálních oxidoreduktáz na nerozpustný modrý formazan [21], který je následně rozpuštěn organickým rozpouštědlem [22,23]. Absorbance barevného produktu je následně měřena fotometricky a hodnoty získané u buněk kultivovaných s testovaným cytostatikem jsou srovnány s hodnotami identické kontrolní kultury bez ovlivnění. Následně jsou sestrojeny křivky přežití a hodnocena inhibiční koncentrace (IC) nebo též efektivní koncentrace (EC) cytostatika. Tato metoda byla taktéž zavedena v Masarykově onkologickém ústavu v Brně s cílem konsekutivně testovat chemorezistenci u vzorků odebraných v rámci léčby u většiny onkologických diagnóz [24,25]. Výsledky však nebyly uspokojivé a i přes další optimalizace [26] bylo rutinní testování v roce 2009 ukončeno.

Všechny dosud jmenované přístupy představují maximálně zjednodušené metody testování chemorezistence in vitro v 2D uspořádání, a to v podstatě až na úrovni jednotlivých separovaných buněk. Na druhou stranu je však třeba si uvědomit, že ve své jednoduchosti systém pomíjí vlastnosti nádorové tkáně (komplexnost a heterogenitu) a 2D uspořádání se značně vzdaluje podmínkám in vivo, proto může docházet k nemalému zkreslení dat. Souběžně se tedy objevují první práce pokoušející se kultivovat nádorové buňky v 3D uspořádání a toto využít i k testování chemosenzitivity.

3D in vitro modely

Již na počátku 20. století popsal Carrel [27] úspěšné experimenty s tkáňovými fragmenty dlouhodobě kultivovanými v podmínkách in vitro. V 50. letech pak Leighton provedl řadu in vitro studií, při nichž nádorové buňky nebo jejich shluky byly kultivovány na pórovité matrix (sponge-matrix) s cílem lépe simulovat 3D prostředí in vivo [28,29].

Rotman et al v roce 1988 [30] získali jemnou homogenizací nádoru shluky buněk (označené jako „micro-organs“), které vystavil fluorescein-acetátu s cílem selektovat „živé“ shluky pomocí fluorescence, tzv. fluorescent cytoprinting. Ty následně imobilizoval na matrix z celulózových vláken impregnovaných kolagenem a inkuboval 5–10 dní na ocelové destičce v Petriho misce s kultivačním médiem spolu s přídavkem testovaného cytostatika. Následně byla vyvolána další fluorescence a účinek cytostatika byl hodnocen porovnáním hladin fluorescence před a po vystavení shluků cytostatiku. Vescio [31] vyvinul systém histokultury in vitro, tzv. HDRA (Histoculture Drug-response Assay), v níž byly kousky (1–2 mm) nádoru kultivovány na gelu (native-state collagen-sponge gel) odvozeném od extracelulární matrix prasečí kůže podporující 3D růst nádoru, který byl ponořen do kultivačního média s cytostatiky v kultivační misce.

V současné době existuje řada modelových systémů, které se mohou uplatnit nejen v rámci výzkumu zaměřeného na biologii nádorové buňky, ale i prakticky např. při screeningu nových léčivých přípravků. Na druhou stranu však úspěšnost potenciálních protinádorových léků, které se ukazovaly jako velmi slibné v rámci testování v in vitro 2D kultivačních systémech, bývá v klinické praxi jen okolo 5–10 % [32–34]. Využití zvířecích modelů, které obvykle představuje navazující fázi v rámci preklinického testování, je naopak finančně i časově značně náročné a navíc ani tyto modelové systémy plně neodpovídají lidské fyziologii [35].

Tato skutečnost tedy nutí k vývoji modelového systému, který by umožnil monitorovat buněčnou proliferaci a životaschopnost (viabilitu) nádorových buněk a současně co možná nejvěrněji napodoboval situaci v lidském těle. V optimálním případě by pak měl současně umožňovat i monitorování migrace a invazivity nádorových buněk do přilehlého okolí, neboť se jedná o významné parametry spojené s tvorbou metastáz, které představují jednu z hlavních příčin selhání protinádorové terapie [36]. Dalším v dnešní době stále více skloňovaným požadavkem na vhodný buněčný model je možnost analýzy angiogeneze a schopnosti interagovat, resp. uniknout imunitnímu systému organizmu, ve kterém se nádor vytvořil [3,35].

Třídimenzionální (3D) kultivační modely řadu výše zmíněných vlastností splňují a představují tak atraktivní nástavbu testování cytotoxicity i efektivnosti a bezpečnosti nových léčiv v 2D in vitro podmínkách, a v řadě aspektů dokonce překonávají experimenty na zvířecích modelech [37]. Zavedení 3D in vitro modelů tak jednoznačně vedlo k eliminaci málo účinných protinádorových léků a redukci počtu experimentů na zvířecích modelech [38–40].

3D buněčné kultury jsou pokusem o simulaci prostředí tkání, ve kterých jsou buňky mezi sebou spojeny, interagují spolu a reagují na podněty z okolí [41]. Existuje celá řada variací 3D modelů. Dnes již klasickým a nejjednodušším 3D modelem jsou tzv. multicelulární sféroidy (MCS), ve kterých se adherentní nádorové buňky shlukují do útvarů připomínajících koule. Během přípravy sféroidů je možné využít syntetické buněčné lešení nebo přirozenou schopnost buněk produkovat extracelulární matrix (ECM). Pro vytvoření MCS jsou kritické 3 etapy:

1. Vazba dlouhých řetězců ECM tvořících vlákna na integriny nacházející se na buněčném povrchu, což umožní přiblížení buněk rozptýlených v suspenzi a zajistí tvorbu agregátu. Buněčné shlukování pak aktivuje expresi kadherinů.
2. Kadheriny jsou následně akumulovány na buněčném povrchu.
3. Dochází k vytvoření mezibuněčných homofilických vazeb kadherin-kadherin, čímž vzniká MCS [42].

Důležitým krokem k vytvoření MCS je taktéž nutnost kultivovat buňky v prostředí, kde je adhezivita mezi buňkami silnější než přilnavost buněk k substrátu. Z toho důvodu se využívají kultivační desky se speciálním nepřilnavým povrchem, případně se používá metoda visící kapky, agitační míchaní nebo elektricky/magneticky indukovaná tvorba MCS [43]. Na našem pracovišti se nejčastěji používá metoda visící kapky – buňky se nanesou v kapce na víčko kultivační nádoby a po jejím otočení vznikne kapka. Buňky zde nemají možnost přisednout k povrchu a vytvářejí MCS ve spodní části kapky na rozhraní kultivačního média a vzduchu.

Další možností přípravy 3D kultur je využití trojrozměrných polymerních lešení. Nejčastěji se používají přírodní hydrogely, jako je Matrigel (gelová směs proteinů extracelulární matrix) nebo kolagen, které současně simulují přirozené vytváření spojů mezi nádorovými buňkami a ECM, která rovněž významně ovlivňuje buněčnou signalizaci [44,45]. Společná kultivace nádorového 3D sféroidu s dalšími buňkami jiného typu (např. endoteliální buňky, fibroblasty apod.) umožňuje kopírovat vliv nádorového mikroprostředí na progresi nádorového onemocnění [46]. Oproti nádorovým buňkám majícím při kultivaci v monovrstvě na Petriho misce plochý „rozprostřený“ tvar, vykazují buňky tvořící sféroid morfologii, která mnohem věrněji kopíruje morfologii buněk uvnitř nádoru, ze kterého byly odvozeny [47]. Dále buňky kultivované v monovrstvě proliferují v podstatě rovnoměrně, zatímco vytvořením buněčného sféroidu dochází ke vzniku rozdílných zón tvořených buňkami v různých fázích buněčného cyklu, s čímž je spojena i rozdílná rychlost proliferace [48,49]. Rovněž dochází k vytvoření gradientu živin, růstových faktorů, léčiv, plynů a dalších metabolických produktů a ke změnám v pH, které charakterizují nádor in vivo. Naopak buňky v 2D modelech jsou rovnoměrně vystavené působení látek, živin, růstových faktorů a léčiv nacházejících se v kultivačním médiu (obr. 1). Napodobování této vlastnosti nádoru in vitro může mít ve svém důsledku nejen stimulační nebo inhibiční efekt na progresi nádoru, ale současně se může podílet i na účinnosti terapie a odpovědi na ni [37,50]. Navíc bylo prokázáno, že v nádorové tkáni dochází vlivem hypoxie, hladovění (z důvodu zhoršeného zásobování živinami) a sníženého pH k indukci exprese proteinů spojených s rezistencí k chemoterapii, např. MRP1 (multidrug resistance protein) nebo LRP (lung resistance-related protein) [51,52].

Rozdíly v intenzitě proliferace spolu s vytvořením gradientu v distribuci léčiva jsou hlavními důvody, proč jsou nádorové buňky kultivované v 3D modelu zpravidla více rezistentní k chemoterapii v porovnání s týmiž buňkami kultivovanými v monovrstvě [53–55]. Příkladem může být:

• 1. Dvojnásobné snížení citlivosti buněk melanomu kultivovaných v 3D podmínkách vzhledem k působení NPrCAP (4N-acetyl-4S-cysteaminylfenol) [56].
• 2. Snížení cytotoxického účinku paklitaxelu o 20–40 % u epiteliálních ovariálních buněk kultivovaných ve 3D modelu v porovnání s buňkami kultivovanými ve 2D podmínkách [54].
• 3. Významně snížená účinnost všech čtyř běžně používaných modalit při léčbě kolorektálního karcinomu (colorectal cancer – CRC) – melfalan, 5-fluorouracil, oxaliplatina a irinotekan – u buněčné linie HCT-116 odvozené od CRC, kultivované ve 3D sféroidech v porovnání s buňkami ve 2D kultivačním modelu, u něhož byly tytéž látky výrazně efektivnější [55].

Klíčovou úlohu při odpovědi na terapii hrají lokalizace a exprese buněčných povrchových receptorů spolu s buněčnými signálními drahami, jejichž aktivita se značně liší při porovnání 2D a 3D modelů, byť jsou tvořeny původně stejnými buňkami. To úzce souvisí se skutečností, že buňky kultivované ve 2D modelech mohou být citlivější k podávané terapii, než je tomu ve skutečnosti [57]. Současně pak může nastat i opačná situace, kdy jsou k terapii senzitivní pouze buňky kultivované v 3D modelu s tím, že in vitro 2D model poskytuje falešně negativní výsledky.

Přestože testování chemosenzitivity, resp. chemorezistence založené na troj-rozměrných kultivacích teprve vstupuje do povědomí odborné veřejnosti a většina experimentů byla provedena prozatím jen s ustavenými nádorovými buněčnými liniemi, v poslední době se stále hlasitěji o slovo hlásí příprava a praktické využití primárních buněčných linií (tzv. primokultur) získaných přímo od pacientů. Jednoznačně se jedná o krok směrem k rozvoji personalizované medicíny. Kondo et al [58] ve své studii úspěšně izolovali buňky z CRC od řady pacientů a připravili z nich 3D kultury in vitro, které věrně kopírovaly vlastnosti nádoru in vivo. Následně na 3D sféroidech analyzovali chemosenzitivitu a aktivaci signálních drah. Podařilo se jim prokázat, že odpověď na terapii 5-fluorouracilem (5-FU) je individuální. U tří pacientů byl růst sféroidů inhibován už při koncentraci 0,1 µg/ml, zatímco ve dvou případech ani koncentrace 10 µg/ml nebyla dostatečně účinná, aby docházelo k inhibici růstu sféroidů.

Vzhledem k obrovskému přínosu 3D kultur je v současné době hlavní snahou ve výzkumu nových protinádorových léků plnohodnotné začlenění trojrozměrně kultivovaných nádorových organoidů do preklinického „highthroughput“ screeningu léčiv. S tím úzce souvisí vývoj obecně platných postupů pro přípravu těchto 3D kultur, jejich management a testování citlivosti k léčbě, které musí být aplikovatelné napříč všemi světovými laboratořemi. Jednou z prvních vlaštovek by mohla být příprava uniformních reprodukovatelných sféroidů v 384 jamkovém formátu pomocí metody visící kapky. Tato metoda je plně kompatibilní s automatizovanými robotickými systémy běžně využívanými při velkokapacitním screeningu léčiv a byla nedávno úspěšně využita při testování citlivosti různých 3D kultur k 5-fluorouracilu [59].

Významným aspektem souvisejícím se zdomácněním 3D kultur v aplikovaném výzkumu zaměřeném na testování účinnosti nových nebo již dříve používaných léčiv představuje po jejich zavedení a optimalizaci také automatizace, jež by umožnila rutinní využití 3D kultur v běžné praxi při výzkumu jednotlivých nádorových onemocnění. Jako ilustrativní příklad mohou sloužit nedávno vytvořené platformy pro studium biologie nádorových kmenových buněk získaných z ascitu od pacientek s karcinomem vaječníku [60].

Nemalý význam je též kladen na vývoj metodik vedoucích k vytváření sféroidů, které by byly reprodukovatelné, snadno proveditelné a přitom cenově dostupné. Jednou z možností mohou být modifikace dříve používaných metod, např. analýza schopnosti nádorových buněk tvořit kolonie po expozici léčivu, která byla již úspěšně převedena do 3D formátu a nyní je ve stavu vývoje plně automatizovaného systému [61]. Nedávno byla publikována studie, v rámci které se podařilo připravit platformu pro jednoduché a současně kvantitativní testování chemosenzitivity buněk v 3D formátu [62]. Byla však pozorována různá míra úspěšnosti tvorby sféroidů pohybující se v rozmezí 50–99 % [63].

Hlavním přínosem testů chemosenzitivity je predikce citlivosti k plánované léčbě a s tím spojená selekce pacientů, kteří budou z léčby profitovat. Pěkným příkladem je tzv. CD-DST (Collagen gel Droplet-embedded culture Drug Sensitivity Test), který byl vyvinut již před 20 lety [64], avšak jeho přednosti v testování chemosenzitivity různých nádorů se využívají i v současnosti. CD-DST byl využit k predikci rezistence pacientů s hepatocelulárním karcinomem k standardně podávané léčbě a v související klinické studii umožnil poměrně spolehlivě stanovit, který z pacientů bude z adjuvantní chemoterapie skutečně profitovat [65,66]. Jen v roce 2017 bylo publikováno hned několik prací, které se zabývaly aplikací CD-DST u dalších malignit, jako je karcinom dutiny ústní, plic nebo nádory trávicího traktu [65,67,68].

Predikce chemosenzitivity s využitím in vivo modelů

Historicky tento přístup vychází z tzv. xenogenních (xenograftových) modelů, kdy je nádorová linie (většinou lidská) transplantována imunodeficitnímu xenogennímu příjemci. Nejčastěji se jedná o athymické Nu/Nu myši (chybí brzlík, neprodukují T buňky) nebo SCID myši (severe combined immunodeficiency disease), které nesou autozomalně recesivni mutaci SCID způsobujicí těžkou kombinovanou imunodeficienci (chybí protilátková i T buněčna imunita) a hodnocena je obvykle dynamika nádorového růstu a parametry přežití. V současnosti se při testování chemosenzitivity in vivo uplatňují zejména myší modely, které vykazují ještě vyšší stupeň imunodeficience v porovnání s klasickými xenogenními modely. Typickým příkladem je kmen NOD (non-obese diabetic) /SCID, u něhož nedochází k rozvoji diabetu, avšak myši vykazují sníženou aktivitu NK (natural killer) buněk a vrozené imunity vůbec, což až 10násobně zvyšuje toleranci vůči lidským hematopoetickým buňkám. Jiným příkladem je inbrední kmen nesoucí homozygotní mutaci IL2rg-/-(interleukin-2 receptor), která potlačuje tvorbu T a B lymfocytů a brání vzniku NK buněk. Křížením těchto dvou kmenů vznikl hybridní kmen NOD/SCID IL2rg-/-, který svými vlastnostmi umožňuje a zároveň významně zvyšuje úspěšnost uchycení a růstu nádorových buněk, a dokonce i dalších lidských tkání vč. kmenových a progenitorových buněk izolovaných z pupečníkové krve nebo kostní dřeně.

Imunodeficitní myši nesoucí lidské xenogenní nádory představují velice účinný nástroj v rámci preklinických studií zaměřených na screening potenciálních léčiv a identifikaci potenciálních terapeutických cílů. Současně mohou být i přímo využity v rámci konceptu tzv. personalizované terapie. Zjednodušeně jsou nádorové buňky/tkáně jednotlivých pacientů vneseny do vhodných imunodeficitních myší, kterým jsou následně podávány protinádorové léčebné modality s cílem vybrat co nejvhodnější lék, případně kombinaci vybraných léků.

Metodicky jsou xenogenní myší modely připravovány vnesením malého kousku nádoru nebo buněčné suspenze získané z krve pacienta či excizí nádorové tkáně. Při tomto procesu je bezpodmínečně nutná sterilita vnášené tkáně [69]. Nádorové buňky nebo kousky tkáně bývají často před vlastní injikací do myši smíchány s Matrigelem, který zefektivní růst xenogenního nádoru a přispívá k udržení původního fenotypu nádoru. Ze stejného důvodu bývají nádorové buňky často koinjikovány s dalšími buňkami, např. endoteliálními, stromálními, fibroblasty apod. V případě malého množství vstupního materiálu je nádorový materiál implantován subkutánně do omezeného počtu myší. Jakmile jsou xenogenní nádory dostatečně veliké, jsou odebrány a je z nich připravena buněčné suspenze, jež se následně aplikuje do další generace myší.

Další nemalou výhodou xenogenních myších modelů je možnost implantace nádorových buněk či tkání dvěma způsoby – ortotopicky nebo heterotopicky. Hlavními výhodami heterotopické implantace je jednoduchost a snadné monitorování růstu nádoru, přičemž v případě solidních tumorů se většinou jedná o subkutánní aplikaci, zatímco v případě krevních malignit o aplikaci intravenózní. Technicky mnohem náročnější je ortotopická implantace, při které se nádorové buňky vnášejí do stejného typu tkáně, resp. orgánu, ze kterého původně pocházejí. Tím se pro lidské nádorové buňky vytváří přívětivější okolní mikroprostředí, které mnohem věrněji simuluje vnější nádorové milieu v lidském těle. U ortotopických implantací je obvykle pozorována zvýšená incidence metastáz, čehož lze využít k predikci účinnosti léčby metastatického onemocnění, příp. k identifikaci buněčných populací, resp. molekulárních biomarkerů, které jsou s procesem vzniku metastáz asociovány [70]. Xenogenní myší model lze případně vytvořit i z cirkulujících nádorových buněk pocházejících z krve pacientů s nádorovým onemocněním. Předpokládá se, že cirkulující nádorové buňky se oddělily z primárních nádorových ložisek a volně cirkulují ve vaskulárním systému, dokud se neuhnízdí na příhodném místě a nezačnou nekontrolovaně proliferovat, aby daly vzniknout sekundárnímu ložisku – metastázi. Takto připravené modelové xenogenní systémy pak mohou sloužit nejen k testování chemosenzitivity, ale obecně i ke studiu tumorigenicity a k molekulární charakterizaci cirkulujících nádorových buněk. Zjednodušený postup přípravy xenogenních myších nádorových modelů je schematicky znázorněn na obr. 2.

Závěr

Vzrůstající množství nových, poměrně bezpečných protinádorových léků cílených proti specifickým signálním drahám a procesům i na subcelulární úrovni dává naději, že v drtivé většině případů bude k dispozici vhodný a dostatečně účinný lék pro daného onkologického pacienta. V současné době kurativní onkologická terapie obecně vychází především z tradičních klinicko-patologických parametrů, jako je histologický typ a rozsah (staging) nádorového onemocnění. Toto pak může být dle typu nádoru doplněno dalšími testy zaměřenými na vybrané molekulárně biologické determinanty a genetickým vyšetřením umožňujícím detekci specifických mutací. Značně atraktivní možnost pak nabízí funkční testování, při kterém jsou buňky pocházející z biopsie daného nádoru testovány ex vivo na citlivost k potenciálním léčebným modalitám, přičemž ošetřující lékař pak může na základě výsledku rozhodnout o vhodném a co možná nejúčinnějším léčebném režimu.

Na druhou stranu je však třeba si uvědomit komplexitu nádorových onemocnění, kdy se i v rámci jednoho nádoru můžeme setkat s výraznou heterogenitou a léčba aplikovaná vůči dominantnímu buněčnému klonu nemusí být vždy dostatečně účinná vzhledem k dalším minoritním buněčným populacím, které se nacházejí v rámci jednoho nádoru. Je třeba také vzít v potaz tzv. kmenové nádorové buňky, které se obecně mnohem méně dělí, a jsou tedy i mnohem méně citlivé k chemoterapii a následně mohou být příčinou recidivy onemocnění.

V podstatě nejhorší prognóza je v onkologii spojena s přítomností vzdálených metastáz, které jsou také obvykle hlavní příčinou úmrtí na onkologická onemocnění. Při tvorbě metastáz dochází k transformaci epiteliálních buněk primárního nádoru na mezenchymální buňky, které vykazují mnohem agresivnější fenotyp co do invazivity a schopnosti migrovat. Takto pozměněné buňky se mohou uvolnit do vaskulárního systému a volně cirkulovat v těle, současně se však tyto buňky nacházejí ve stavu dormance, neboť mají transientně pozastavený buněčný cyklus, což způsobuje jejich rezistenci k systémově podávaným cytostatikům. Po ukončení léčby pak může dojít k reaktivaci těchto buněk a vytvoření sekundárního nádorového ložiska.

V kontextu výše uvedeného tedy ani funkční testování prováděné komplementárně s rutinním klinicko-patologickým vyšetřením a dalšími sofistikovanými molekulárně biologickými metodami nemusí být dostatečné a jasně naznačuje potřebu nových dostupných individualizovaných přístupů umožňujících komplexní vyšetření na úrovni jednotlivých pacientů.

Práce byla podpořena projektem MŠMT – NPU I - LO1413 a GAČR 17-05838S.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy. 

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Obdrženo: 21. 9. 2017

Přijato: 20. 12. 2017

doc. Mgr. Roman Hrstka, Ph.D.

RECAMO Masarykův onkologický ústav

Žlutý kopec 7

656 53 Brno

e-mail: hrstka@mou.cz