Zinečnatými ionty modifikovaný nanotransportér antracyklinových antibiotik pro cílenou terapii nádoru prsu

Download PDF English version

Authors: S. Skaličková ¹; M. Gargulák ²; M. Löffelmann ²; B. Ruttkay-Nedecký ²; M. Kepinská ³; T. Parák ¹; Kizek R. ^1–3
Authors‘ workplace: Ústav humánní farmakologie a toxikologie, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno ¹; Centrální laboratoře, Farmaceutická fakulta, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno ²; Ústav biomedicínských a environmentálních analýz, Wroclaw Medical University, Wroclaw, Polsko ³
Published in: Klin Onkol 2017; 30(Supplementum1): 174-176
Category: Article

Overview

Východiska:
V popředí zájmu nanomedicíny je nanotechnologická úprava antracyklinových antibiotik, která se často využívají v protinádorové léčbě hematologických malignit a solidních nádorů. Chitosanové nanočástice získávají více pozornosti v oblasti cíleného transportu léčiv díky své stabilitě, nízké toxicitě a jednoduché přípravě. Cílem práce bylo navrhnout chitosanový nanotransportér antracyklinového antibiotika s modifikací povrchu zinkem, pro specifickou interakci s metalothioneinem (MT).

Materiál a metody:
Chitosanové nanočástice s enkapsulovaným doxorubicinem byly připraveny rozpuštěním 5 g chitosanu v 3% kyselině octové a Trifenylfosfinu (TPP) (0,25 % w/v) a doxorubicinem (0,5 mg/ml). Fe₂O₃-NPs byly připraveny redukcí s borohydridem a amoniakem. Poté byly připraveny Fe₂O₃-AuNPs termální syntézou. Množství doxorubicinu a Zn²⁺ bylo určeno pomocí DPV.

Výsledky:
V experimentu byl navržen a následně studován biofyzikálními metodami chitosanový nanotransportér antracyklinových antibiotik (CHIT-Zn-DOXO-Fe₂O₃-AuNPs). Uvnitř vytvořené nanometrické struktury je elektrostaticky navázán doxorubicin (o koncentraci kolem 10 µm, CHIT-DOXO). Navíc MT je molekula bohatá na cystein a díky svým volným sulfhydrylovým skupinám je schopen vázat ionty zinku. Této vlastnosti jsme se rozhodli využít v konstrukci nanotransportéru pro jeho cílené směřování k nádorové tkáni (CHIT-Zn-DOXO). V řadě našich předchozích experimentů jsme ukázali výrazné vzestupy hladiny MT ve zhoubných nádorech. MT do svých domén váže ionty těžkých kovů (přirozeně ionty zinku), a tak udržuje jejich homeostázu v organizmu. Proto jsme se v další části experimentu rozhodli sledovat schopnost modifikovaných chitosanových nanočástic (100 mg/ml, (CHIT-Zn-DOXO) vázat se k proteinu MT (magnetické zlaté nanočástice byly modifikovány MT, 100 µg/ml, Fe₂O₃-AuNPs). Efektivita vazby chitosanové nanočástice modifikovaná zinečnatými ionty (CHIT-Zn-DOXO) k MT (CHIT-Zn-DOXO-Fe₂O₃-AuNPs-MT) vzrostla o více než 30 % v porovnání s nemodifikovanou nanočásticí (CHIT-DOXO).

Závěr:
Předpokládáme, že nový nanotransportér je specifický svojí biodostupností, zvýšeným vychytáváním léčiva z krevního řečiště v místě nádorové tkáně a nízkou toxicitou pro necílové tkáně.

Klíčová slova:
chitosan – magnetické zlaté nanočástice – rakovina prsu – doxorubicin

Úvod

V popředí zájmu nanomedicíny je nanotechnologická úprava antracyklinových antibiotik, která se často využívají v protinádorové léčbě hematologických malignit a solidních nádorů [1,2]. Nanotechnologická modifikace léčiva zlepšuje jeho zacílení primárně k nádorové buňce. Modifikované nanočástice dokáží zvýšit koncentraci protinádorového léčiva v cílovém místě bez navýšení nežádoucích účinků a také chrání léčiva před intracelulární enzymovou degradací nebo endozomální translokací. Z publikovaných prací je zřejmé, že chitosanové nanočástice získávají více pozornosti v oblasti cíleného transportu léčiv díky jejich stabilitě, nízké toxicitě a jednoduché přípravě [3]. Deacetylovaná chitosanová kostra glukosaminových jednotek má vysokou hustotu nabitých aminoskupin, které umožňují silné elektrostatické interakce s biomolekulami, přechodnými kovy (Zn, Se) a peptidy [4,5]. Bylo zjištěno, že významnou molekulou vázající těžké ionty je metalothionein a jeho hladina je u nádoru prsu také významně změněná [6–8]. Cílem práce bylo navrhnout chitosanový nanotransportér antracyklinového antibiotika s modifikací povrchu zinkem, pro specifickou interakci s metalothioneinem.

Materiál a metody

Chitosanové nanočástice s enkapsulovaným doxorubicinem byly připraveny rozpuštěním 5 g chitosanu v 3% kyselině octové a TPP (0,25 % w/v) a doxorubicinem (0,5 mg/ml). Ke stanovení doxorubicinu a Zn²⁺ pomocí diferenční pulzní voltametrie (DPV) byl použit AUTOLAB Analyzer (Metrohm, Švýcarsko). Stanovení probíhalo pomocí adsorptivní přenosové techniky a standardní cely se třemi elektrodami. Elektroda ze skelného uhlíku byla pracovní elektroda, Ag/AgCl/3M KCl elektroda byla referenční a platinová elektroda byla pomocná. Pro zpracování dat byl použit software NOVA (Metrohm, Švýcarsko). Analyzované vzorky byly před měřením zbaveny kyslíku probubláním argonem (99,999 %). Pro analýzu Doxo a Zn²⁺ byl použit acetátový pufr (0,2 M acetát sodný a 0,2 M kyselina octová) při pH 5, který byl použit jako pomocný elektrolyt. Parametry měření Doxo byly následující: počáteční potenciál –0,8 V, konečný potenciál –0,4 V, doba akumulace 120 s, krok potenciální 5 mV, modulační amplituda 25 mV, objem vzorku 10 µl, objem měřicí cely 2 ml. Parametry pro měření Zn²⁺: počáteční potenciál –1,2 V, konečný potenciál –0,7 V, doba akumulace 60 s, krok potenciální 5 mV, modulační amplituda 25 mV, objem vzorku 10 µl, objem měřicí cely 2 ml. Fe₂O₃-NPs byly připraveny redukcí s borohydridem a amoniakem. Poté byly Fe₂O₃-AuNPs připravené termální syntézou. Množství doxorubicinu a Zn²⁺ bylo určeno pomocí DPV.

Výsledky

V experimentu byl navržen a následně studován biofyzikálními metodami chitosanový nanotransportér antracyklinových antibiotik (CHIT-Zn-DOXO-Fe₂O₃-AuNPs) jak je ukázáno na obr. 1. Uvnitř vytvořené nanometrické struktury je elektrostaticky navázán doxorubicin (o koncentraci kolem 10 µM, CHIT-DOXO). Navíc metalothionein je molekula bohatá na cystein a díky svým volným sulfhydrylovým skupinám je schopen vázat ionty zinku. Této vlastnosti jsme se rozhodli využít v konstrukci nanotransportéru pro jeho cílené směřování k nádorové tkáni (CHIT-Zn-DOXO). V řadě našich předchozích experimentů jsme ukázali výrazné vzestupy hladiny MT ve zhoubných nádorech [9–11]. MT do svých domén váže ionty těžkých kovů (přirozeně ionty zinku), a tak udržuje jejich homeostázu v organizmu. Proto jsme se v další části experimentu rozhodli sledovat schopnost modifikovaných chitosanových nanočástic (100 mg/ml, (CHIT-Zn-DOXO) vázat se k proteinu MT (magnetické zlaté nanočástice byly modifikovány MT, 100 µg/ml, Fe₂O₃-AuNPs)). Efektivita vazby chitosanové nanočástice modifikovaná zinečnatými ionty (CHIT-Zn-DOXO) k MT (CHIT-Zn-DOXO-Fe₂O₃-AuNPs-MT) vzrostla o více jak 30 % v porovnání s nemodifikovanou nanočásticí (CHIT-DOXO). Námi navržený koncept nanotransportéru DOXO potencionálně ukazuje na jeho možné zacílení do tkání se zvýšenou hladinou MT.

**Image 1. Předpokládané schéma chitosanového nanotransportéru doxorubicinu.**

Závěr

Předpokládáme, že nový nanotransportér je specifický svojí biodostupností, zvýšeným vychytáváním léčiva z krevního řečiště v místě nádorové tkáně a nízkou toxicitou pro necílové tkáně. Z výsledků je patrné, že je nanočástice formována a ve své struktuře uzavírá doxorubicin a na povrchu jsou vázány ionty Zn²⁺. Získané výsledky vypovídají o formaci chitosanových nanočástic a jejich schopnosti vázat se na protein MT, který hraje důležitou roli u nádoru prsu.

Práce byla realizována za podpory projektu NANODRUGS 328/2017/FaF a The European Technology Platform for Nanomedicine.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Ing. Sylvie Skaličková, Ph.D.

Ústav humánní farmakologie a toxikologie

Farmaceutická fakulta

Veterinární a farmaceutická univerzita Brno

Palackého třída 1946/1

612 42 Brno

e-mail: sylvie.skalickova@gmail.com

Obdrženo: 6. 3. 2017

Přijato: 26. 3. 2017

Sources

1. Shi JJ, Kantoff PW, Wooster R et al. Cancer nanomedicine: progress, challenges and opportunities. Nat Rev Cancer 2017; 17 (1): 20–37. doi: 10.1038/nrc.2016.108.

2. Yaari Z, da Silva D, Zinger A et al. Theranostic barcoded nanoparticles for personalized cancer medicine. Nat Commun 2016; 7: 13325. doi: 10.1038/ncomms13325.

3. Kamaly N, He JC, Ausiello DA et al. Nanomedicines for renal disease: current status and future applications. Nat Rev Nephrol 2016; 12 (12): 738–753. doi: 10.1038/ nrneph.2016.156.

4. Zhao HY, Lv P, Huo D et al. Doxorubicin loaded chitosan-ZnO hybrid nanospheres combining cell imaging and cancer therapy. RSC Adv 2015; 5 (74): 60549–60551.

5. Esmaeili A, Hadad NA. Preparation of ZnFe2O4-chitosan-doxorubicin hydrochloride nanoparticles and investigation of their hyperthermic heat-generating characteristics. Ceram Int 2015; 41 (6): 7529–7535.

6. Gomulkiewicz A, Jablonska K, Pula B et al. Expression of metallothionein 3 in ductal breast cancer. Int J Oncol 2016; 49 (6): 2487–2497. doi: 10.3892/ijo.2016.3759.

7. Burton C, Dan YB, Donovan A et al. Urinary metallomics as a novel biomarker discovery platform: breast cancer as a case study. Clin Chim Acta 2016; 452: 142–148. doi: 10.1016/j.cca.2015.11.014.

8. Chandler P, Kochupurakkal BS, Alam S et al. Subtype-specific accumulation of intracellular zinc pools is associated with the malignant phenotype in breast cancer. Mol Cancer 2016; 15: 2. doi: 10.1186/s12943-015-0486-y.

9. Gumulec J, Masarik M, Adam V et al. Serum and tissue zinc in epithelial malignancies: a meta-analysis. PLoS One 2014; 9 (6): e99790. doi: 10.1371/journal.pone.0099790.

10. Gumulec J, Raudenska M, Adam V et al. Metallothionein – immunohistochemical cancer biomarker: a meta-analysis. PLoS One 2014; 9 (1): e85346. doi: 10.1371/journal.pone.0085346.

11. Adam V, Petrlova J, Wang J et al. Zeptomole electrochemical detection of metallothioneins. PLoS One 2010; 5 (7): e11441. doi: 10.1371/journal.pone.0011441.