Molekulární patologie kolorektálního karcinomu, mikrosatelitová nestabilita – způsob detekce, vztah k patofyziologii a prognóze

Východiska:
Kolorektální karcinom (CRC) je v populaci třetí nejčastější nádorové onemocnění, které má velmi heterogenní charakter. Většina případů se rozvíjí v důsledku sporadických událostí, ale menší část vzniká na základě zárodečných mutací asociovaných s hereditárními nádorovými syndromy. Mechanizmy vedoucí k mutacím onkogenů, nádorových supresorů a genů, které se účastní opravy DNA, zahrnují: 1. chromozomální nestabilitu, 2. mikrosatelitovou nestabilitu a 3. metylační fenotyp CpG ostrůvků. Mikrosatelitová nestabilita (MSI) vzniká nejčastěji v důsledku zárodečné mutace složky systému opravujícího nesprávně spárované báze (MMR) nebo somatické hypermetylace MLH1 promotoru. Diagnostické přístupy zahrnují metody jako je PCR a imunohistochemie pro detekci ztráty složky MMR. Cílem naší práce bylo charakterizovat soubor probíhající studie střevního mikrobiomu u CRC z pohledu MSI.

Materiál a metody:
Pro studii byl vybrán konsekutivní soubor 103 pacientů s diagnózou CRC. Studijní skupina zahrnovala 45 žen (43,7 %) a 58 mužů (56,3 %). Věk pacientů v době diagnózy se pohyboval v rozmezí 31–83 let (medián 66 let). Exprese proteinů MLH1, MSH2, MSH6 a PMS2 byla stanovena imunohistochemicky a případná pozitivita byla korelována se stadiem onemocnění a lokalizací primárního tumoru.

Výsledky:
Z celkového počtu 103 pacientů doposud zahrnutých do studie byl MMR status imunohistochemicky stanoven u 43 pacientů (41,7 %). Z tohoto počtu byla MSI stanovena u 11 případů (25,6 %), zatímco 32 případů (74,4 %) bylo mikrosatelitově stabilní. Vzhledem ke klasifikaci stadia onemocnění bylo nejvíce případů MSI pozorováno u stadia II (8 případů; 22,2 %). Ve vztahu k lokalizaci koreluje MSI spíše s pravostranným výskytem primárního nádoru, zatímco mikrosatelitově stabilní nádory nevykazují stranovou preferenci.

Závěr:
Vzhledem k nízkému počtu stanovení MMR statutu ve studijní skupině je prozatím statistické zhodnocení nepřesné. V našem souboru však lze pozorovat trend ve vztahu k procentuálnímu výskytu MSI v populaci pacientů s CRC i v lokalizaci primárního nádoru souhlasně s literaturou.

Klíčová slova:
kolorektální karcinom – mikrosatelitová nestabilita – Lynchův syndrom

Úvod

Kolorektální karcinom (colorectal cancer – CRC) je velmi heterogenní onemocnění zahrnující sporadickou, hereditární a familiární formu.

Patologie signálních drah u CRC

Vznik CRC podléhá vícestupňovému modelu kancerogenze, který byl poprvé navržen v roce 1990 Fearonem a Vogelsteinem [1]. Většina případů CRC se vyvíjí jako následek sporadické genomické události, která má za příčinu narušení normální funkce epitelových buněk tlustého střeva. Genomická nestabilita může vzniknout jako důsledek tří odlišných situací: 1. chromozomální nestability, 2. mikrosatelitové nestability nebo 3. hypermetylace CpG ostrůvků označované jako metylační fenotyp CpG ostrůvků. U CRC bývají nejčastěji postiženy důležité signální dráhy jako WNT, MAPK/PI3K, TGF-β, TP53 a mutované geny jako c-MYC, KRAS, BRAF, PIK3CA, PTEN, SMAD2 a SMAD4, které slouží jako prediktivní markery [2].

Mikrosatelitová nestabilita

Mikrosatelitová nestabilita (MSI) se vyskytuje přibližně u 15 % případů CRC [3]. Ke genetické nestabilitě dochází při ztrátě funkce MMR proteinů, která vede k akumulaci chyb v oblastech mikrosatelitů. Systém opravy nesprávně párovaných bází má zásadní význam při opravě špatných sekvencí DNA vzniklých v průběhu replikace. Tento reparační mechanizmus zahrnuje funkci proteinů MLH1, MLH3, MSH2, MSH3, MSH6, PMS1 a PMS2, které jako funkční heterodimery spolupracují při detekci a vystřižení nesprávných párů bází [4,5]. Zásadní roli pro funkčnost MMR systému mají komplexy MSH2-MSH6 a MLH1-PMS2. K MSI dochází při defektu jednoho ze čtyř zmíněných proteinů. MSI je u většiny případů vyvolána inaktivací genu kódujícího proteiny MLH1 nebo MSH2 a v menší míře genů kódujících proteiny MSH6 nebo PMS2 [6].

Vzhledem k tomu, že se mikrosatelitové sekvence nachází i v oblastech promotorů a exonů genů, MSI může vést i k posunu čtecího rámce a tím pádem nefunkčním produktům. Jedná se o geny, které často kódují regulátory proliferace, apoptózy a proteiny účastnící se reparace DNA [3,5–8].

Diagnóza MSI a prognostický význam

Nádorové buňky CRC s MSI se liší od nádorových buněk se stabilními mikrosatelity (MSS). Tyto buňky mají tendenci být diploidní s menší mírou LOH [9]. V nádorových buňkách s MSI bývají zasaženy podobné cíle a signální dráhy jako u nádorů s MSS, avšak ovlivněny jsou odlišné proteiny těchto drah [3].

Pro stanovení diagnózy CRC s MSI se používají vybrané panely pro MSI testování, přičemž konsenzus pro testování stability mikrosatelitů zahrnuje dva mononukleotidové (BAT25/26) a tři dinukleotidové mikrosatelity (D2S123, D5S345 a D17S250) metodou PCR [3]. Alternativně se využívá imunohistochemická detekce MMR proteinů (MLH1, MSH2, MSH6 a PMS2) ve vzorcích nádorové tkáně, přičemž obě metody se mohou doplňovat [10].

Na základě tohoto testování se rozlišuje MSI-high (MSI-H), u kterého je > 30 % markerů mikrosatelitů mutováno (definováno Bethesda kritérii) a MSI-low (MSI-L) mutovaného u alespoň jednoho a současně < 30 % markerů.

Detekce MSI u pacientů s CRC je považováno (obzvlášť u mladších pacientů) za pozitivní prognostický faktor vzhledem k tomu, že tito pacienti mají výrazně delší dobu přežití a nižší úmrtnost než pacienti bez MSI [3]. Současně může tato skupina pacientů odlišně odpovídat na léčbu 5-fluorouracilem [3].

Podstatou testování MSI u CRC pacientů je identifikace pacientů s Lynchovým syndromem.

Fenotyp CRC s MSI

Včasné stanovení MSI fenotypu je významné z hlediska nastavení léčby. Pacienti s MSI pozitivním CRC mají charakteristické klinické i patologické rysy. Pro tuto skupinu pacientů je typická predominance proximální části tlustého střeva v lokalizaci nádoru, nízká diferenciace a histologicky mucinózní charakter nádoru, zvýšený počet infiltrujících lymfocytů a diploidní obsah DNA [3]. Nejčastěji se jedná o stadium II s nízkým výskytem metastatického onemocnění [11].

Materiál

Studijní skupina zahrnuje 103 pacientů s diagnózou CRC (stadium I–IV), kteří podstoupili chirurgický zákrok v Masarykově onkologickém ústavu v letech 2015–2017. Konsekutivní soubor se skládal ze 45 žen (43,7 %) a 58 mužů (56,3 %). Věk pacientů v době diagnózy se pohyboval v rozmezí 31–83 let (medián 66 let). Data byla anonymizována a zpracována podle platné legislativy ČR.

Metody

Stanovení MSI u CRC vzorků

MMR proteiny byly imunohistochemicky stanoveny v řezech nádorové tkáně fixo-vané ve formaldehydu. Detekován byl protein MLH1 pomocí protilátky EF05 (Dako; ředění 1: 200), MSH2 protilátkou FE11 (Dako; 1: 200), MSH6 protilátkou EP49 (Dako; 1: 800) a PMS2 pro-tilátkou EP51 (Dako; 1: 800). Hodno-cení bylo vztaženo k vnitřní pozitivní kontrole (normální epitelie, stromální lymfocyty). Pro hodnocení imunohistochemie bylo stanoveny dvě kategorie – pozitivní/negativní.

Statistické hodnocení kohorty

MSI status byl korelován s lokalizací primárního nádoru a stadiem onemocnění.

Výsledky

Z celkového počtu 103 pacientů doposud zahrnutých do studie byl MMR status imunohistochemicky stanoven u 43 pacientů (41,7 %). Z tohoto počtu byla MSI stanovena u 11 případů (25,6 %) zatímco 32 případů (74,4 %) bylo mikrosatelitově stabilních. Vzhledem ke klasifikaci stadia onemocnění bylo nejvíce případů MSI pozorováno u stadia II (8 případů; 22, 2 %). Ve vztahu k lokalizaci koreluje MSI spíše s pravostranným výskytem primárního nádoru, zatímco u mikrosatelitově stabilní nádory nevykazují stranovou preferenci.

Závěr

Vzhledem k nízkému počtu stanovení MMR statutu ve studijní skupině je prozatím statistické zhodnocení nepřesné. V našem souboru však lze pozorovat trend ve vztahu k procentuálnímu výskytu MSI v populaci pacientů s CRC i v lokalizaci primárního nádoru souhlasně s literaturou.

Práce byla podpořena projektem MŠMT – NPU I – LO1413 a AZV 16-31966A.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Mgr. Veronika Brychtová, Ph.D.

RECAMO

Masarykův onkologický ústav

Žlutý kopec 7

656 53 Brno

e-mail: vebrychtova@mou.cz

Obdrženo: 13. 3. 2017

Přijato: 26. 3. 2017