Časná diagnostika invazivních mykotických infekcí u hematoonkologických nemocných pomocí sérologických metod

Souhrn

Invazivní mykotické infekce se během posledních dvou dekád staly jedním z důležitých faktorů ovlivňujících morbiditu a mortalitu nemocných s hematologickou malignitou. Přestože se v posledních několika letech setkáváme s nárůstem incidence invazivních mykóz způsobených vzácně se vyskytujícími houbami, absolutní většina oportunních mykotických infekcí je způsobena kmeny kandid a především pak kmeny aspergilů. Časná diagnóza a zahájení účinné antimykotické léčby má zásadní vliv na prognózu nemocných. V poslední době došlo k výraznému pokroku právě na poli časné diagnostiky invazivních mykóz - vedle nových zobrazovacích metod je to především rozvoj nových sérologických metod. V následující souhrnné práci přinášíme základní informace o nejdůležitějších z nich a zejména o jejich využití v rutinní klinické praxi.

Klíčová slova:
hematologické malignity - invazivní mykotické infekce - sérologické metody - galaktomannan - mannan - antimannan - 1,3-β-D-glukan

Důvody pro vývoj a používání sérologických metod v diagnostice invazivních mykotických infekcí

Invazivní mykotické infekce představují závažnou infekční komplikaci imunokompromitovaných nemocných s nádorovým onemocněním. Ve srovnání s bakteriálními infekcemi je jejich výskyt jednoznačně méně častý, na druhou stranu incidence invazivních mykotických infekcí narůstá a morbidita a mortalita s nimi spojená je výrazně vyšší, než je tomu u infekcí bakteriálních. Přestože invazivní mykózy postihují celou skupinu nemocných s nádorovým onemocněním, je jejich výskyt u pacientů se solidními nádory spíše vzácný. Naopak velice časté jsou u nemocných s hematologickými malignitami, a to především, je-li součástí léčebného režimu transplantace krvetvorné tkáně [1,2].

Během posledních dvou dekád došlo k signifikantnímu nárůstu frekvence výskytu těchto infekcí u hematoonkologických nemocných [1]. U této skupiny pacientů se v závislosti na charakteru onemocnění, respektive charakteru a intenzitě protinádorové léčby, pohybuje incidence invazivních mykóz od 2 % (např. autologní transplantace krvetvorné tkáně) až po 15-25 % (např. indukční léčba akutní leukemie nebo alogenní transplantace krvetvorné tkáně) [3]. Vedle zvýšení incidence invazivních mykotických infekcí však dochází i ke změně ve spektru vyvolávajících patogenů. Od začátku 90. let minulého století, kdy se u hematoonkologických nemocných rozšířila masivní profylaxe flukonazolem, trvale klesá incidence invazivních kandidóz, zejména vyvolaných na flukonazol citlivými kmeny kvasinek [4-6]. Naopak ve stejném období dochází k výraznému nárůstu incidence invazivních infekcí vyvolaných vláknitými houbami [4-6]. Absolutní většinu představuje invazivní aspergilóza, která je v současné době nejčastější mykózou u nemocných po alogenní transplantaci krvetvorné tkáně [7,8]. Incidence infekcí vyvolaných ostatními vláknitými houbami, a to především invazivní zygomykóza a invazivní fusarióza, je naštěstí sice stále nízká, ale i tato během posledních několika let zvláště ve velkých transplantačních centrech významně narostla [9].

Vysoká mortalita na tato onemocnění, anebo naopak úspěch léčby jsou ovlivňovány celou řadou faktorů. Nicméně klíčový vliv na zlepšení přežití pacientů s invazivní mykotickou infekcí má časné zahájení účinné antimykotické léčby ještě v době, kdy je nálož mykotického patogenu malá a poškození tkání omezené [10,11]. Bohužel včasné zahájení léčby, které vyžaduje včasnou a co možná nejpřesnější diagnózu, zůstává největší překážkou a nejednou se stává, že je definitivní diagnóza stanovena až ante mortem. Klinické symptomy těchto infekcí jsou totiž velmi variabilní a nespecifické a často se rozvíjejí až velmi pozdě. Konvenční mikrobiologické metody (mikroskopie, kultivace) jsou většinou v časných stadiích nevýtěžné. Histologický průkaz infekce (přestože stále zůstává základním kamenem pro definitivní potvrzení diagnózy), vyžaduje invazivní výkon, který je často u trombocytopenických pacientů neproveditelný. Konvenční radiologické metody jsou málo senzitivní. Výjimku představuje pouze vysoce rozlišovacího CT (HR CT) v časné diagnostice plicních forem invazivních mykóz způsobených vláknitými houbami, nicméně RTG nález nám ani v tomto případě nedokáže přinést informaci o původu, eventuálně změnách v plicním parenchymu [12,13].

Z výše uvedeného vyplývá potřeba nových přístupů k časné diagnostice invazivních mykotických infekcí, zvláště pak v souvislosti se skupinou nejvíce ohrožených nemocných pacientů s hematologickou malignitou. Období mezi vznikem infekce a rozvojem klinických příznaků představuje terapeutické okno - pokud je ovšem v tomto období infekce pravidelným screeningem detekována, může být časně zahájena agresivní antimykotická léčba s následným zlepšením prognózy nemocných.

Tento takzvaný preemptivní přístup vyžaduje rychlé, neinvazivní, senzitivní a specifické diagnostické metody.

Tyto požadavky splňují v posledních letech se rozvíjející nekultivační diagnostické metody, které obecně dělíme na molekulárně biologické a sérologické.

Metody molekulárně biologické využívají detekce nukleových kyselin mykotických patogenů pomocí různých variant polymerázové řetězové reakce (PCR). Bohužel přestože se zdá PCR detekce invazivních mykóz velmi perspektivní, doposud nebyla nalezena standardní a optimální metodika, která by byla všeobecněji rozšířena, a tak do dnešního dne nelze výsledky mezilaboratorně srovnávat. PCR metody tedy zatím není možno využít jako diagnostické kritérium pro invazivní mykotické infekce [14,15].

Druhá skupina nekultivačních metod využívá imunologických nebo biochemických postupů k detekci cytoplazmatických antigenů, antigenů buněčné stěny nebo protilátek proti nim v séru nebo jiných tělesných tekutinách. Tyto metody se souhrnně označují jako sérologické. V rámci sérologické diagnostiky invazivních mykóz byla zkoušena celá řada postupů. Nicméně většího uplatnění a klinického významu dosáhlo pouze několik z nich: detekce antigenu galaktomannanu pro invazivní aspergilózu, obdobně detekce mannanu a protilátek proti němu (antimannanu) v diagnostice invazivní kandidózy a nově pak detekce antigenu 1,3-β-D-glukanu, který umožňuje „panfungální“ diagnostiku.

V této souhrnné práci bychom chtěli informovat o možnostech laboratorní diagnostiky pomocí sérologických metodik a o klinickém využití takto získaných výsledků v časné diagnostice invazivních mykotických infekcí u hematoonkologických pacientů.

Galaktomannan - marker invazivní aspergilózy (IA)

Galaktomannan (GM) je polysacharid buněčné stěny aspergilů a některých dalších hub, který se uvolňuje do tělesných tekutin při růstu a invazi aspergilových hyf do tkání [16,17]. Pro detekci tohoto antigenu v séru a ostatních tělesných tekutinách se využívá krysích monoklonálních protilátek EB-A2, které jsou vysoce specifické pro β-1,5- galaktofuranozylové konce aspergilového galaktomannanu. První komerční kit pro detekci GM byl postaven na principu latexové aglutinace a uveden na trh v roce 1990 (Pastorex Aspergillus). Vzhledem k relativně vysokému detekčnímu limitu (15-20 ng/ml) je však jeho používání spojeno s nízkou senzitivitou. V roce 1995 byl proto na trh uveden nový produkt firmy BioRad, který využívá ELISA metodiku (Platelia Aspergillus). Jeho detekční limit je výrazně nižší (0,5-1 ng/ml), což odpovídá výrazně vyšší senzitivitě [18,19]. Reakce je semikvantitativní - výsledek je udáván jako index pozitivity (IP) - poměr mezi naměřenou optickou denzitou a optickou denzitou kontrolního séra obsahujícího přibližně 1 ng GM/ml.

Prospektivní studie sledující detekci galaktomannanu jako markeru invazivní aspergilózy u nemocných s vysokým rizikem vzniku této infekce ukázaly, že Platelia Aspergillus test má vysokou specificitu pohybující se v rozmezí 81 %-100 %. Extrémně vysoká je také negativní prediktivní hodnota testu, která je v absolutní většině studií nad 95 %. Negativní výsledek testu tedy s velmi vysokou pravděpodobností vylučuje invazivní aspergilózu a falešné negativity jsou vzácné [12,19-26]. Na druhou stranu senzitivita a pozitivní prediktivní hodnota jsou bohužel do určité míry slabými místy tohoto testu.

Senzitivita testu v různých pracích totiž značně kolísá, a to v rozmezí 30 %-100 % [12,19-26]. Příčin kolísající senzitivity, a tedy faktorů, které senzitivitu testu ovlivňují, je několik. Prvním bodem je hodnota tzv. cut-off indexu pozitivity (cut-off IP), tedy hodnoty indexu pozitivity, od které je vzorek označen jako pozitivní. Maertens et al, ale i další autoři prokázali, že snížení cut-off z hodnoty IP = 1,5 na hodnotu IP = 0,5 vede k výraznému zvýšení senzitivity testu při současném jen mírném zhoršení jeho specificity (82,7 % vs 96,5 %) [27]. Toto snížení cut-off indexu pozitivity je důležité především u nemocných, kteří dostávají profylakticky antimykotika s efektem na vláknité houby a u nemocných po transplantaci krvetvorné tkáně s reakcí štěpu proti hostiteli (GvHD). U obou těchto skupin pacientů je mykotická nálož nízká a proto při užití vyšších hodnot cut-off IP by tito nemocní byli falešně označeni za negativní a naopak při cut-off IP = 0,5 je test dokáže správně označit za pozitivní [28,29]. Druhým faktorem ovlivňujícím senzitivitu je frekvence a pravidelnost vyšetřování. Maximální senzitivity je u vysoce rizikových nemocných (pacienti s akutní leukemií podstupující indukční nebo reindukční léčbu, nemocní podstupující alogenní transplantace krvetvorné tkáně, zvláště pak při rozvoji reakce štěpu proti hostiteli) dosaženo, jestliže jsou odběry krve pro detekci GM prováděny pravidelně a to 2 - 3krát týdně a potom minimálně 1krát týdně po propuštění z hospitalizace, jestliže riziko invazivní aspergilózy trvá (např. při přítomnosti chronické reakce štěpu proti hostiteli) [19,30].

Druhým slabým místem je pozitivní prediktivní hodnota (PPV) testu (čili pozitivní výsledek správně označí nemocného s invazivní aspergilózou). PPV kolísá v různých pracích v rozmezí 50 %-100 % [12,19-26]. Opět se setkáváme s celou řadou faktorů, které PPV testu ovlivňují. Prvním z těchto faktorů je incidence IA ve vyšetřované skupině pacientů. Pravděpodobnost, že pozitivní výsledek testu označí skutečně nemocného pacienta, je nejvyšší ve skupinách nemocných s nejvyšší incidencí invazivní aspergilózy a těmi jsou především nemocní s akutní leukemií a pacienti po alogenní transplantaci krvetvorné tkáně (incidence IA je zde 10 % resp. 20 %). U ostatních skupin pacientů, kde je incidence IA nízká (nemocní s lymfomy, mnohočetným myelomem, chronickými leukémiemi a nebo po autologní transplantaci krvetvorné tkáně), je významně nižší i PPV testu [18]. Druhým faktorem ovlivňujícím PPV a specificitu Platelia Aspergillus testu, je kritérium, které označí pacienta jako pozitivního (jednorázová vs opakovaná/konsekutivní pozitivita vzorku). Maertens et al využil test k prospektivnímu sledování nemocných s vysokým rizikem invazivní aspergilózy a prokázal, že jak při použití cut-off indexu pozitivity 1,0, tak 0,5 specificita testu významně narůstá, pokud je nemocný označen za skutečně pozitivního až při pozitivitě 2 vzorků jdoucích za sebou (85,4 % vs 98,8 % a 98,6 % vs 85,1 %) [22,27]. Konečně nejvýznamnějším faktorem ovlivňujícím PPV testu je přítomnost falešných pozitivit. I přes používání konsekutivní pozitivity, je až 20 % pozitivních výsledků falešně pozitivních [18]. Příčin falešných pozitivit Platelia Aspergillus testu je celá řada a mohou být rozděleny do 3 skupin:

• a) kontaminace vzorku při odběru nebo zpracování,
• b) průnik antigenu (pravého nebo zkříženě reagujícího) přes poškozenou nebo nezralou sliznici zažívacího traktu,
• c) reakce s antigenem (pravým nebo zkříženě reagujícím) v cirkulaci [18,31,32].

Nejvýznamnější příčiny falešné pozitivity ukazuje tab. 2. Odlišení falešné pozitivity od pozitivity skutečné je často nesnadné. Kontaminaci vzorku nám pomůže identifikovat jednak retest pozitivního vzorku a jednak již výše zmíněný požadavek na nutnost minimálně 2 pozitivních vzorků pro označení nemocného jako skutečně pozitivního. V ostatních případech je nutná jednak znalost možných příčin falešné pozitivity lékařem, který provádí interpretaci výsledků, ale především přítomnost jiných známek invazivní aspergilózy (klinický stav, zobrazovací metody) a nebo alespoň přítomnost rizika pro její vznik (např. nemocný po alogenní transplantaci krvetvorné tkáně). Klinicky nejvýznamnější příčiny možných falešných pozitivit testu jsou pozitivita při podávání penicilinových antibiotik (piperacilin/tazobactam, ampicilin, některé co-amoxiciliny) a pozitivita při postižení zažívacího traktu [18].

Detekce GM pomocí testu Platelia Aspergillus přináší několik klinicky velmi důležitých výhod.

GM může být při pravidelně prováděném monitoringu zachycen v séru nemocných s invazivní aspergilózou ve velmi časném stádiu infekce, často před rozvojem symptomů nebo podezřelých radiologických abnormalit. V práci Maertense et al předcházela pozitivita GM v séru u 55 % nemocných rozvoj febrilií, a to s mediánem 3,5 dne, u 80 % pacientů abnormalitu na RTG a nebo CT plic s mediánem 8 resp. 6 dnů. Pravděpodobně nejdůležitějším faktem však zůstává, že pozitivita GM předcházela u téměř 90 % pacientů s mediánem 6 dnů zahájení účinné antimykotické léčby. Pravidelně prováděné vyšetřování GM u nemocných s vysokým rizikem IA tedy umožní o řadu dní zkrátit interval do stanovení diagnózy a do zahájení podávání účinného antimykotika a tak výrazně zlepšit prognózu těchto pacientů [11,12].

Další velkou výhodou GM je možnost diferenciální diagnostiky abnormalit na HR CT plic. Obraz invazivní aspergilózy na HR CT, přestože jsou popisované některé charakteristické známky (halo sign, air crescent sign), může být velmi variabilní a při negativitě konvenčních mikrobiologických metod (kultivace, mikroskopie ze sputa nebo tekutiny z bronchoalveolární laváže) je zjištění mykotické etiologie procesu velmi obtížné, ne-li nemožné [33]. Je-li však abnormalita na HR CT doplněna současnou pozitivitou GM ze séra, pak jsou již splněna kritéria pravděpodobné invazivní aspergilózy dle EORTC/MSG (European Organisation for Research and Treament of Cancer/Mycosis Study Group), a mohou tak být ihned podána antimykotika s účinkem na kmeny aspergilů [30,34]. Konečně, na rozdíl od HR CT, může GM detekovaný v séru (resp. vývoj indexu pozitivity) sloužit jako marker léčebné odpovědi a nebo naopak selhávání zvolené antimykotické léčby [30]. Při efektivní antimykotické léčbě hodnota IP v průběhu léčby klesá, a naopak při jejím selhávání hodnota IP intenzivně narůstá, a dojde-li k více než dvojnásobnému nárůstu IP po 1 týdnu antimykotické léčby, je s více než 90% jistotou zvolený léčebný postup neúčinný [35].

Přestože je Platelia Aspergillus test určen primárně k vyšetřování séra, lze pomocí něj detekovat GM i v jiných tělesných tekutinách, eventuálně v tkáních [36]. Protože invazivní aspergilóza je ve většině případů inhalační infekcí a primárně jsou postiženy plíce, není překvapení, že nejčastěji vyšetřovaným materiálem jiným než sérum je tekutina získaná bronchoalveolární laváží (BAL). Detekce GM z tekutiny získané BAL je spojena se senzitivitou pohybující se od 60 - 100 %. Senzitivita je opět vyšší, jestliže je použit jako cut-off dnes doporučovaný IP = 0,5, přičemž specificita testu zůstává stále vysoká (94 %) [37]. Výhodou detekce GM z tekutiny získané BAL je především významně vyšší senzitivita a časnější pozitivita ve srovnání s konvenčními mikrobiologickými metodami používanými k detekci IA z materiálu získaného BAL (kultivace, mikroskopie). Jsou popsány případy, kdy pozitivita GM z tekutiny získané BAL předcházela pozitivitu GM v séru. Tyto nálezy odpovídají patogenezi plicní formy invazivní aspergilózy. V běžné klinické praxi, kdy většinou provádíme BAL v případě nálezu plicních infiltrátů na zobrazovacích metodách, je časový rozdíl mezi pozitivním záchytem GM z krve a z BAL většinou minimální.

Dalším materiálem, ve kterém je často GM detekován, je mozkomíšní mok. Postižení centrálního nervového systému je většinou součástí diseminace plicní formy IA, spíše výjimečně jde o izolované postižení. Detekce GM z mozkomíšního moku u nemocných s postižením CNS je spojena, na rozdíl od velmi často negativní kultivace, s velmi vysokou senzitivitou pohybující se mezi 80 - 100 % [38,39]. Pozitivita GM z mozkomíšního moku (samotná nebo spolu s pozitivitou GM v séru) je tak vedle klinického a případně i radiologického nálezu jediný mikrobiologický marker, který může vést k diagnóze postižení CNS invazivní aspergilózou [38]. Je však nutné si uvědomit, že i při plicní formě IA (bez postižení CNS) může část sérového GM pronikat přes hematoencefalickou bariéru stejně tak jako může dojít k „kontaminaci“ mozkomíšního moku GM z krve při hemoragickém odběru vzorku likvoru. IP pozitivity GM v mozkomíšním moku však v těchto případech bývají výrazně nižší [30,38].

Detekce GM z jiných tělesných tekutin eventuelně z tkání byla sice testována, nicméně interpretace výsledků není v současné době jednotná (30).

Mannan a antimannan - diagnostika invazivní kandidózy (IC)

Sérologická diagnostika invazivní kandidózy (IC) je na rozdíl od invazivní aspergilózy (IA) mnohem složitější. Přestože různé metodiky pro sérologickou diagnostiku IC byly testovány již od 80. let minulého století, jsou publikované zkušenosti mnohem sporadičtější, než je tomu u invazivní aspergilózy (IA). Hlavním problémem je složitá interpretace výsledků, která souvisí s patofyziologií IC, která je dynamickým procesem. U hematoonkologických nemocných představuje vznik invazivní kandidózy kontinuum od kolonizace nemocného přes postupný průnik kvasinek různým stupněm poškozenou mukózou až k jednoznačné infekci krevního řečiště a tkání [40]. V průběhu vývoje byla testována řada markerů využitelných pro časnou diagnostiku IC (enoláza, heat shock proteiny, arabinitol a další), nicméně širšího klinického využití dosáhly jen dva testy (komerčně dostupné) - detekce mannanu a protilátek proti němu, tzv. antimannanu.

Polysacharid mannan je spolu s glukany hlavní komponentou buněčné stěny kvasinek. Na rozdíl od glukanů je však vázán kovalentními vazbami na proteiny buněčné stěny a je vysoce imunogenní [40]. V průběhu invazivní kvasinkové infekce dochází k uvolňování mannanu do tělesných tekutin, kde pak může být detekován. Jeho biologický poločas v krvi je však velmi krátký (pohybuje se v hodinách) a pokud tedy má být zachycen, je nutný frekventní odběr vzorků krve (41). Pro detekci mannanu je využívána monoklonální protilátka EB-CA1, rozpoznávající α-oligomanosové zbytky. Iniciálně (podobně jako u galaktomannanu) byla tato protilátka použita v latexové aglutinaci (Pastorex Candida). Ovšem detekční limit této soupravy je opět relativně nízký (1,5 ng/ml) a senzitivita testu tak nedostatečná. V současné době se mannan detekuje pomocí senzitivnější ELISA metodiky (Platelia Candida Ag) s limitem 0,1 - 0,5 ng/ml a za pozitivní je považován vzorek s koncentrací mannanu větší než 0,5 ng/ml. Izolovaná detekce tohoto antigenu pro diagnózu invazivní kandidózy je však i přes použití ELISA metodiky limitována nízkou senzitivitou, která se pohybuje v rozmezí 30 %-70 % (tab. 4).

Existují dvě hlavní příčiny.

Především je to tranzientnost a rychlá eliminace mannanu z cirkulace a tak nejsou-li odběry prováděny dostatečně často, nemusí být mannan vůbec zachycen. Příkladem může být práce Sendida et al, kde byl mannan ve skupině nemocných s IC, u kterých bylo k dispozici několik odběrů, zachycen ve 40 % případů. Ale pokud byl od pacientů k dispozici pouze jeden vzorek krve, byla senzitivita testu pouze 11 % [42].

Druhým faktorem, ovlivňujícím senzitivitu, je rozdílná schopnost testu rozpoznávat různé druhy kvasinek. Monoklonální protilátka EB-CA1 se váže α-oligomanózové zbytky složené z více jak 4 manóz. Tyto jsou prezentovány ve velkém počtu na povrchu Candida albicans, Candida glabrata a Candida tropicalis, ale v daleko menším množství na povrchu Candida parapsilosis, Candida krusei a Candida kefyr. Z těchto důvodů je senzitivita testu pro detekci IC způsobené posledními třemi jmenovanými druhy velmi malá a pohybuje se pouze kolem 30 % [40]. Specificita testu pro detekci mannanu kolísá, ale ve většině prací se pohybuje nad 90 %. Přestože falešná pozitivita nebývá častá, může existovat u neutropenických nemocných s mukozitidou v důsledku průniku antigenů kolonizujících kvasinek přes poškozenou bariéru zažívacího traktu [43].

Podobně jako galaktomannan lze i mannan detekovat pomocí Platelia Candida Ag testu také v jiných tělesných tekutinách než v séru. Dosavadní zkušenosti jsou však jen omezené. Nejvíce je využívána detekce z mozkomíšního moku pro diagnózu kandidové meningitidy, kdy je test pozitivní až ve 100 % případů [44].

Mannan je vysoce imunogenní molekulou a v organizmu vede k rychlé tvorbě protilátek všech tříd - tzv. antimannanů. Antimannan pak opět může být využit v diagnostice invazivní kandidózy. K detekci antimannanu slouží nejčastěji ELISA metodika. Přestože jsou komerčně dostupné testy pro stanovení protilátek jednotlivých tříd (IgG, IgA, IgM), větší senzitivitu přináší a tak i rozšířenější je test detekující celkové protilátky proti mannanu (Platelia Candida Ab) [45]. Výsledek je označován za pozitivní, jestliže koncentrace protilátek přesáhne 10 AU/ml (Arbitrary Units). Senzitivita i specificita samostatně použitého Platelia Candida Ab pro diagnostiku invazivní kandidózy však v různých pracích značně kolísá (od 50 do 90 %) [42]. Nízká senzitivita testu je dána především omezenou schopností tvorby protilátek u imunokompromitovaných hematoonkologických nemocných [40]. Druhým faktorem snižujícím senzitivitu je opět (podobně jako u detekce mannanu) omezená schopnost detekovat infekci vyvolanou kmeny Candida parapsilosis, Candida krusei a Candida kefyr (test používá jako antigen mannan z kmenů Candida albicans, který má jen omezenou reaktivitu s protilátkami vznikajícím při infekci těmito kmeny kvasinek) [40]. Hlavním problémem je však nízká specificita testu. Velká část nemocných i přes svou imunosupresi reaguje na zvýšenou kolonizaci kvasinkami (především v oblasti GIT) právě tvorbou antimannanu, a to i ve vysokém titru, a to bez klinických známek invazivní kandidózy. Jednoznačné označení těchto výsledků za striktně falešně pozitivní je však spornou otázkou. Vznik invazivní kandidózy je, jak výše zmíněno, dynamický proces a kolonizace nemocného kvasinkami je nezávislým rizikovým faktorem pro vznik infekce. Je tedy spíše otázkou, zda od metody očekáváme časnou a nebo jistou diagnózu invazivní kvasinkové infekce a dle toho to bude cut-off hodnoty výsledku testu, které bude dělící čarou mezi dobrou senzitivitou nebo dobrou specificitou testu [40].

S cílem zvýšit senzitivitu obou testů publikovali v roce 1999 Sendid et al práci, ve které vycházejí z biologického výskytu mannanu a antimannanu v krvi během infekce a pro časnou diagnostiku použili současnou kombinovanou detekci těchto markerů [42]. Zatímco senzitivita při detekci izolovaného mannanu nebo antimannanu byla velmi nízká (40 % resp. 53 %), pokud byl pacient monitorován současně oběma testy a za pozitivního byl označen nemocný s pozitivitou buď mannanu, nebo antimannanu, případně obou, pak senzitivita narostla až na 80 % při stále uspokojivé specificitě (94 %) [42]. Podobných výsledků pak později dosáhly i další autoři (tab. 4). I přes nesporné výhody tohoto přístupu se zde stále setkáváme s již zmiňovanými slabými místy obou testů:

• a) falešnou negativitou mannanu i antimannanu při infekci vyvolané některými nonalbicans kmeny kvasinek,
• b) falešnou pozitivitou antimannanu u kolonizovaných nemocných.

Je tedy zřejmé, že jednoznačné postavení (byť kombinované) detekce mannanu a antimannanu v diagnostice invazivní kandidózy není možné v dnešní době bez dalších rozsáhlejší prací pevně stanovit.

Detekce 1,3-β-D-glukanu - „panfungální“ diagnostika

1,3-β-D-glukan (BG) je jedním z hlavních polysacharidů, který obsahuje buněčná stěna prakticky všech mykotických patogenů. Je specifickým antigenem hub a nevyskytuje se v buňkách baktérií, virů ani buňkách lidských. Jako integrální součást skeletu buněčné stěny hub je zde daleko pevněji vázán, než např. galaktomannan nebo mannan a do tělesných tekutin se proto uvolňuje jen ve fázi růstu mykotického agens, a to navíc ve velmi malém množství [46]. BG může být detekován v tělesných tekutinách při invazivní infekci způsobené jak kmeny kandid a aspergilů, tak také při infekci způsobené vzácnými patogeny, jako je Fusarium sp., Acremonium sp., Trichosporon sp., Sacharomyces sp., ale také například Pneumocystis jiroveci. Bohužel vzhledem k malému množství BG v stěně a především k minimálnímu uvolňování z ní není BG v tělesných tekutinách detekovatelný při infekci vyvolané kryptokoky a zygomycetami (Mucor sp., Rhizopus sp., Rhizomucor sp.) [47-49]. K záchytu antigenu v tělesných tekutinách se používá kolorometrického testu založeného na vlastnosti BG aktivovat tzv. faktor G, který je součástí amébocytů získaných z klepítkatců Ostrorepa amerického (Limulus polyphemus) nebo Ostrorepa východoasijského (Tachypleus tridentatus). Faktor G se v přítomnosti BG aktivuje a krátká kaskádová reakce je vizualizovaná pomocí chromogenního substrátu. Následně je měřena změna optické denzity v čase (kinetická reakce) a nebo koncová optická denzita (endpoint reakce) [19]. Existuje několik komerčně dostupných testů k detekci BG, které se mírně technicky liší, nicméně v Evropě a USA je nejrozšířenější Fungitell^TM (Cape Code). Vzhledem ke své „panfungalitě“ se Fungitell^TM test jeví jako velice zajímavý pro časnou diagnostiku invazivních mykóz. Na druhou stranu nejsou zatím zkušenosti s testem takové, aby mohl být jednoznačným kritériem pro stanovení diagnózy invazivní mykotické infekce v běžné klinické praxi.

Senzitivita Fungitell^TM testu kolísá od 64 % do 100 % [50-53], a to zejména v závislosti na hodnotě cut-off, od které je vzorek označen jako pozitivní (tab. 5). V současné době se doporučuje jako pozitivní označit vzorek s naměřenou hodnotou vyšší než 80 pg/ml a naopak za negativní vzorek s hodnotou pod 60 pg/ml. Přestože detailní kinetika BG při invazivní mykóze není známa, jsou popsány případy, kdy k významnému nárůstu BG došlo během 5 dnů. Z těchto důvodů je pro časný záchyt invazivní mykotické infekce doporučován odběr krve minimálně 2krát týdně [19]. Pravidelný monitoring vysoce rizikových nemocných ve výše zmíněném intervalu může významně zkrátit dobu do stanovení diagnózy. V práci Pazose et al pozitivita BG předcházela rozvoj febrilií s mediánem 5 dnů, první klinické příznaky mykózy s mediánem 11 dnů, nález na HR CT s mediánem 9 dnů a zahájení antimykotické léčby dokonce s mediánem 14 dnů [52].

Uspokojivá je specificita a především NPV testu, které se pohybují kolem 90 % resp. 95 % (50-53). Při negativním výsledku tedy můžeme s velkou pravděpodobností invazivní mykózu (s výjimkou zygomykózy a kryptokokové infekce) vyloučit.

Podobně jako u detekce GM i v tomto testu se setkáváme s velmi kolísavou PPV (od 40 % do 90 %) a opět je hlavní příčinou možnost falešných pozitivit [50-53]. Jako možné příčiny falešné pozitivity byly popsány: hemodialýza s celulózovou kapslí [19], Gram-pozitivní bakteriemie [54], transfuzní přípravky a krevní deriváty (především intravenózní globuliny, albumin, koagulační faktory a přípravky s použitím filtrace při výrobě) [54], kontaminace gázou [54] a podávání některých antibiotik (amoxicilin/klavulenát, ev. imipenem, gentamicin) [53,55]. Nutno však připomenout, že jen v některých z výše uvedených případů byla jednoznačně prokázána přítomnost kontaminujícího glukanu. Naopak nelze (vzhledem k panfungalitě a vysokému detekčnímu limitu testu) s jistotou vyloučit, že mohlo jít v řadě případů o pacienty se subklinickou invazivní mykotickou infekcí. Test je obecně velmi náchylný na kvalitu laboratorního zpracování. Vyšetření se provádí z minimálního množství séra (přibližně 5 μl) a doporučuje se používat speciální odběrové sety a laboratorní materiál neobsahující glukan. Pickering et al také popsal postupně narůstající pozitivitu vzorku způsobenou pouze opakovaným přenášením vzorku séra do transportních zkumavek [54]. Všechny zmíněné faktory pak mohou relativně snadno ovlivnit výsledek testu a vyšetření je tedy vhodné provádět v laboratoři se zkušenostmi s touto metodikou.

BG v diagnostice invazivních mykotických infekcí přináší několik významných výhod. Podobně jako u galaktomannanu i zde lze pomocí vývoje hodnot BG sledovat léčebnou odpověď na podaná antimykotika. Navíc však tato korelace byla vedle invazivní aspergilózy popsána i u invazivní kandidózy [54-56]. Dále je nespornou výhodou testu jeho panfungalita. Teoreticky by nám jediný test dokázal zachytit jak invazivní aspergilózu, kandidózu a fuzariózu, tak i některé další vzácné invazivní mykotické infekce včetně pneumocystové pneumonie [19]. Na druhou stranu je nutno opět připomenout, že test nezachytí nemocné s invazivní zygomykózou a kryptokokovou infekcí. Při pozitivitě je navíc nutné provést další laboratorní (kultivace, mikroskopie, vyšetření galaktomannanu, mannanu, ev. PCR), RTG a klinické vyšetření s cílem maximálně zpřesnit etiologii infekce a tak maximálně zacílit antimykotickou léčbu. Pozitivita by tedy měla být signálem k zahájení cíleného pátrání po invazivní mykóze. Naopak negativita testu nám s vysokou pravděpodobností (s výjimkou výše zmíněných případů) systémovou mykotickou infekci vyloučí [19]. Konečně se zdá být velice zajímavé použít detekce BG ke konfirmaci pozitivního výsledku Platelia Aspergillus (tzn. galaktomannanu) a tak vyloučit nebo naopak potvrdit falešnou pozitivitu galaktomannanu. V práci Pazose et al měli pacienti s invazivní aspergilózou pozitivitu v obou testech. Naopak pozitivita pouze BG nebo pouze GM svědčila pro falešnou pozitivitu jednoho z testů [52].

Závěr

Časná diagnostika invazivních mykotických infekcí u hematoonkologických nemocných pomocí sérologických metod zaznamenala v posledních letech velký pokrok. Sérologickými metodami jsme schopni detekovat nejen invazivní kandidózu a aspergilózu, ale i celou řadu dalších vzácných invazivních mykóz. Bohužel stále není k dispozici sérologická metoda, která by umožňovala diagnostiku systémových zygomykóz - infekcí, jejichž incidence v posledních letech zvláště pak na hematoonkologických pracovištích postupně narůstá.

Zcela jednoznačné místo v časné diagnostice invazivní aspergilózy si vybudovala detekce galaktomannanu pomocí Platelia Aspergillus testu. Umožňuje zkrácení doby do stanovení diagnózy, diferenciální diagnostiku plicních infiltrátů a především časné zahájení účinné antimykotické léčby, jejíž efekt napomáhá monitorovat. Hlavním problémem však zůstává relativně velký počet falešných pozitivit. Kombinace s 1,3-β-D-glukanem nebo s PCR však tyto falešné pozitivity pravděpodobně dokáže odlišit.

Detekce mannanu a antimannanu v diagnostice invazivní kandidózy má bohužel celou řadu limitů a podobně jako „panfungální“ diagnostika pomocí 1,3-β-D-glukanu bude pro určení jednoznačného místa v klinické praxi vyžadovat většího počtu velkých prospektivních studií.

Práce byla podpořena IGA MZ ČR NR8452-3/2005.

MUDr. Zdeněk Ráčil

www.fnbrno.cz

e-mail: zracil@fnbrno.cz

Doručeno do redakce: 26. 2. 2006

Přijato po recenzi: 28. 3. 2007