Probiotiká ďalšej generácie: prehľad najperspektívnejších kandidátov

Souhrn

Výskum v oblasti ľudskej mikrobioty a jej vplyvu na ľudské zdravie otvoril nové možnosti diagnostiky, prevencie alebo liečby niektorých patologických stavov. Negatívna zmena zloženia črevnej mikrobioty, dysbióza, je asociovaná s ochoreniami, ako sú napr. zápalové ochorenia čreva, obezita, diabetes mellitus či infekcie spôsobené baktériou Clostridium difficile. Pre využitie ľudskej mikrobioty, resp. jej biologicky aktívnych produktov v klinickej praxi je potrebná jej dôkladná identifikácia a charakterizácia vlastností, ktoré môžu byť pre človeka prospešné. Použitie najnovších technológií umožňuje realizovať takýto výskum a v súčasnosti už poznáme viacero potenciálnych kandidátov na tzv. probiotiká ďalšej generácie. Cieľom tohto článku je zhrnúť dostupné informácie o baktériách Akkermansia muciniphila, Bacteroides fragilis a Faecalibacterium prausnitzii, ktoré patria z tohto pohľadu k najperspektívnejším a najštudovanejším.

Klíčová slova:

črevná mikrobiota – probiotiká ďalšej generácie – Akkermansia muciniphila – Bacteroides fragilis – Faecalibacterium prausnitzii

ÚVOD

Väčšina v súčasnosti používaných probiotických baktérií, najmä z rodov Lactobacillus a Bifidobacterium, bola prvýkrát objavená a popísaná v súvislosti s fermentovanými mliečnymi produktmi. Tieto produkty sa stali predmetom záujmu najmä preto, že ich pravidelná konzumácia sa dávala do súvislosti s dlhovekosťou a lepším zdravotným stavom starších bulharských pastierov. Za ich prospešné účinky sa ukázali byť zodpovedné už spomínané baktérie [1]. Toto zistenie podnietilo veľké množstvo štúdií a honbu za objavením tých najúčinnejších probiotických kmeňov. V súčasnosti je na trhu dostupná široká škála rôznych výživových doplnkov, ale aj liekov s obsahom zdraviu prospešných mikroorganizmov. Ich úloha v liečbe post-antibiotických gastrointestinálnych ťažkostí je už nezastupiteľná a v takýchto prípadoch sú väčšinou liečbou prvej voľby. Rôzne iné účinky probiotík, napr. antimikróbne alebo imunomodulačné, sa ukazujú byť nápomocné aj pri iných indikáciách, kde však ide najmä o adjuvantnú terapiu [2, 3].

De Vos et al. (2012) popísali vzťah medzi zložením mikrobioty (t. j. spoločenstva mikoorganizmov osídľujúcich rôzne časti ľudského tela, predovšetkým sliznicu gastrointestinálneho traktu) a s ním súvisiacimi ochoreniami naznačujúc, že alterácia črevnej mikrobioty môže byť spojená s nárastom výskytu viacerých ochorení a syndrómov, vrátane zápalových ochorení čreva, potravinových alergií, obezity, diabetes mellitus a celiakie [4]. Častým mechanizmom, ktorým probiotiká sprostredkúvajú pozitívne účinky, býva práve ovplyvnenie zloženia mikrobioty [5]. Mikrobiota je prirodzenou súčasťou ľudského tela a zabezpečuje rôzne dôležité funkcie, ako sú trávenie niektorých zložiek potravy, ochrana pred patogénmi, alebo ovplyvnenie vývoja imunitného systému [6]. Využitie najnovších metód a technológií viedlo v posledných rokoch k nárastu poznatkov o mechanizmoch, akými prirodzená mikrobiota ovplyvňuje ľudské zdravie a stále dostupnejšie a presnejšie technologické možnosti v oblasti celogenómového sekvenovania, transkriptomiky a proteomiky pomohli identifikovať niektoré konkrétne bakteriálne druhy a objasniť ich jedinečnú úlohu pre zdravie človeka. Postupné odhaľovanie zástupcov fyziologickej mikrobioty tak môže byť impulzom pre charakterizáciu nových potenciálnych probiotík, ktoré nazývame probiotiká ďalšej generácie (angl. next generation probiotics) [7].

TRADIČNÉ PROBIOTIKÁ

Probiotiká sú Svetovou zdravotníckou organizáciou (WHO) definované ako živé mikroorganizmy, ktoré pri podaní v adekvátnom množstve poskytujú hostiteľovi zdravotné benefity [8]. Medzi najčastejšie používané probiotiká patria najmä kmene čeľade Lactobacillaceae (phylum Firmicutes) a rodu Bifidobacterium (phylum Actinobacteria), takisto kvasinky Saccharomyces boulardii, niektoré kmene Escherichia coli, Bacillus spp. a iné. V súčasnosti sa probiotiká používajú predovšetkým na terapiu gastrointestinálnych ťažkostí (akútne infekčné hnačky, post-antibiotické hnačky a pod.), alebo na terapiu vaginálnych infekcií. V posledných rokoch však pribúda veľké množstvo vedeckých štúdií naznačujúcich potenciálny účinok niektorých probiotík aj v terapii, alebo prevencii iných, závažnejších ochorení. Medzi najvýznamnejšie patria: syndróm dráždivého čreva [9], nekrotizujúca enterokolitída [10], ulcerózna kolitída [11], profylaxia hnačiek spôsobených infekciou Clostridium difficile [12], adjuvantná terapia pri eradikácii Helicobacter pylori [13], profylaxia vzniku atopického ekzému u novorodencov a detí [14] alebo profylaxia a liečba ochorení ústnej dutiny [15]. Mechanizmus účinku, akým probiotiká ovplyvňujú priebeh týchto ochorení, je daný predovšetkým ich antimikróbnou aktivitou, posilňovaním funkcie črevnej epitelovej bariéry a moduláciou imunitnej odpovede [16, 17].

PROBIOTIKÁ ĎALŠEJ GENERÁCIE

Probiotiká ďalšej generácie (obr. 1) boli neoficiálne zadefinované ako živé mikroorganizmy identifikované na základe komparatívnych analýz mikrobioty, ktoré pri podaní v adekvátnom množstve poskytujú hostiteľovi zdravotné benefity [18]. Spomedzi identifikovaných druhov je v súčasnosti dostupných najviac štúdií zaoberajúcich sa baktériami Akkermansia muciniphila, Bacteroides fragilis a Faecalibacterium prausnitzii. V nasledujúcej časti tohto prehľadového článku sa budeme venovať podrobnejšiemu popisu práve spomenutých troch baktérií so zameraním sa na štúdie, v ktorých boli tieto baktérie podávané ľudom, alebo experimentálnym zvieratám.

Akkermansia muciniphila

Akkermansia muciniphila (phylum Verrucomicrobia) je komenzálna gramnegatívna, anaeróbna baktéria, reprezentujúca 0,5–5 % celkovej črevnej mikrobioty. Charakteristickou vlastnosťou tejto baktérie je schopnosť utilizovať mucín, principiálnu zložku hlienu vystielajúceho sliznice [19, 20]. A. muciniphila degraduje mucín len mierne, v porovnaní napr. s mukolytickou baktériou Ruminococcus torques, ktorá je výrazne premnožená pri zápalových ochoreniach čreva (IBD) a degraduje hlien patologicky, v oveľa intenzívnejšej miere [21]. Bolo tiež dokázané, že A. muciniphila je schopná dokonca stimulovať produkciu alebo hrúbku hlienu v črevách [22, 23]. Rozkladom hlienu vznikajú oligosacharidy, ktoré slúžia ako substráty pre ďalšie prospešné baktérie, čím prispievajú k celkovej homeostáze v črevách. Tento jav sa označuje ako tzv. subtrátový cross-feeding. Navyše bolo dokázané, že A. muciniphila produkuje acetát a propionát, ktoré dokážu využívať baktérie produkujúce butyrát, základný zdroj energie pre enterocyty [24, 25]. Možno teda zhrnúť, že A. muciniphila degraduje hlien vo fyziologickom vzťahu ako k hostiteľovi, tak aj k prirodzenej mikrobiote.

O význame A. muciniphila môže svedčiť aj fakt, že jej početné zastúpenie býva značne redukované u obéznych ľudí, ako aj u pacientov s diabetes mellitus 2 (DM2), hypertenziou, IBD, či ochoreniami pečene [26, 27, 28, 29, 30]. Naopak, signifikantne zvýšený výskyt tejto baktérie bol zaznamenaný u elitných športovcov a u ľudí s nižším BMI [31]. Na základe týchto pozorovaní sa začal skúmať vplyv A. muciniphila na priebeh spomínaných ochorení.

Everard et al. (2013) sledovali jej vplyv na obezitu myší. U zvierat kŕmených potravou vedúcou k obezite došlo po 4-týždňovom súbežnom podávaní A. muciniphila k normalizácii metabolickej endotoxémie, zníženiu celkovej hmotnosti a úplnému zvráteniu preprandiálnej hyperglykémie [22]. Podobné výsledky boli dosiahnuté aj po dlhodobejšej terapii – pravidelné podávanie A. muciniphila po dobu 10 mesiacov zredukovalo priberanie, upravilo preprandiálnu hyperglykémiu, a navyše zlepšilo pamäť myší pri prechode bludiskom [32].

Prospešná sa akkermansia ukázala byť aj u diabetických potkanov, kde po 4 týždňoch terapie došlo k zvýšeniu sérovej hladiny HDL-cholesterolu, zníženiu hepatálneho glykogénu, ako aj zníženiu zápalových markerov podieľajúcich sa na patogenéze DM2 [33].

Vplyv A. muciniphila na metabolické dysregulácie a priberanie bol popísaný aj v ďalších štúdiách [34, 35]. U hyperlipidemických myší jej podávanie znížilo celkové sérové hladiny cholesterolu a triacylglycerolov. Pozorovaný bol tiež vplyv na imunitný systém, v mezenterických lymfatických uzlinách došlo k zvýšeniu početnosti B lymfocytov a redukcii populácie T lymfocytov a neutrofilov, ako aj k zníženiu expresie aktivačných markerov na dendritocytoch a B lymfocytoch [36]. Dyslipidémia a aktivácia imunitného systému stoja za patogenézou aterosklerózy, hypolipidemický a imunomodulačný účinok by tak mohol byť prospešný v liečbe tohto ochorenia, čo čiastočne dokázali Li et al. (2016). V prípade terapie aterosklerotických myší viedlo podanie baktérie k zvráteniu exacerbácií aterosklerotických lézií, čo bolo pozorované zníženou infiltráciou makrofágov, ako aj zníženou expresiou prozápalových markerov. Podľa výsledkov tejto práce A. muciniphila síce neovplyvnila lipidémiu ani glykémiu, došlo však k redukcii hladiny cirkulujúcich endotoxínov, čo autori asociujú so zlepšením bariérovej funkcie čreva, pretože akkermansia zvýšila expresiu proteínov tesného spojenia v bunkách črevného epitelu [37].

Podobný vplyv na črevnú integritu bol dokázaný aj v experimentálnom modeli kolitídy na myšiach [38]. V tejto štúdii došlo po 14-dňovej terapii k zlepšeniu klinických príznakov ochorenia, histopatologickým zmenám, zníženiu sérových a tkanivových hladín zápalových markerov a zlepšeniu bariérovej funkcie čreva. V súvislosti s bariérovou funkciou čreva bolo zhrubnutie hlienovej vrstvy chrániacej črevný epitel po terapii A. muciniphila a pozorované aj v ďalších štúdiách [22, 39]. Tento efekt stál aj za zmiernením zápalového poškodenia črevnej sliznice spôsobenej enteropatogénnou baktériou Salmonella enterica ser. Pullorum u kurčiat. A. muciniphila v tomto prípade zmiernila morfologicko- anatomické zmeny čreva a črevnej sliznice spôsobené patogénom. Konkrétne bola zaznamenaná väčšia dĺžka čreva, hlbšie krypty v črevnom epiteli a došlo k zvýšeniu početnosti pohárikovitých buniek produkujúcich hlien, ako aj k zvýšeniu expresie mucínu [40].

Z uvedeného vyplýva, že ovplyvnenie črevnej integrity môže byť kľúčovým mechanizmom účinku A. muciniphila práve pri spomínaných ochoreniach, na ktorých patogenéze sa narušenie črevnej homeostázy do veľkej miery podieľa. Bolo to tak aj v štúdii, kde akkermansia pravdepodobne zabránila translokácii s patogénmi asociovaných molekulových vzorov (z angl. pathogen associated molecular patterns, PAMPs) do pečene. Normalizácia expresie génov podieľajúcich sa na dyslipidémii a hepatálnom zápale v konečnom dôsledku zabránila rozvoju nealkoholovej tukovej choroby pečene u obéznych myší [41]. V tejto, ako aj vo viacerých vyššie uvedených štúdiách, bol tiež pozorovaný vplyv akkermansie na zloženie črevnej mikrobioty, v zmysle upravenia (v rôznej miere) dysbiotického stavu asociovaného so skúmaným ochorením [33, 34, 38, 41].

Potenciálnym problémom použitia A. muciniphila u ľudí by mohla byť nevhodnosť pôvodného kultivačného média pre človeka a toxicita kyslíka pre prežívanie, a teda uchovávanie baktérie. Zásadná bola preto štúdia, v ktorej autori pripravili syntetické kultivačné médium, ktorého prípadné zvyšky v konečnom produkte sú bezpečné pre ľudskú konzumáciu. Zároveň bol popísaný a izolovaný povrchový bakteriálny proteín Amuc_1100, ktorý sám zlepšuje integritu črevnej bariéry a čiastočne tak môže zodpovedať za prospešné účinky A. muciniphila [42]. Amuc_1100 alebo samotná akkermansia sa ukázali byť prospešné aj v experimentálnom modeli kolitídy [43].

V pilotnej randomizovanej placebom kontrolovanej klinickej štúdii bola živá alebo pasterizovaná A. muciniphila podávaná 32 obéznym pacientom s inzulínovou rezistenciou. Pravidelné trojmesačné podávanie akkermansie viedlo k zlepšeniu inzulínovej senzitivity, redukcii inzulinémie a miernemu poklesu celkovej hmotnosti, ako aj celkového telesného tuku. Znížili sa aj hladiny krvných markerov poškodenia pečene a zápalu. Dôležitým zistením bol tiež fakt, že podávanie živej aj usmrtenej baktérie je u ľudí bezpečné a dobre tolerované [44].

V článku uvádzame najmä tie účinky potenciálne probiotickej baktérie A. muciniphila, ktoré boli potvrdené vo viacerých štúdiách v podmienkach in vivo. Výskumy zaoberajúce sa týmto mikroorganizmom, a tým, akým spôsobom môže poskytovať zdravotné benefity, predovšetkým u experimentálnych zvierat, sú spomedzi všetkých kandidátov na probiotiká ďalšej generácie najobsiahlejšie. Najširšie preskúmaný je vplyv na črevnú homeostázu, ktorý môže byť prospešný pri niektorých metabolických ochoreniach, ako je napr. obezita, čo bolo potvrdené aj v pilotnej klinickej štúdii [44].

Bacteroides fragilis

Gramnegatívne obligátne anaeróbne baktérie rodu Bacteroides (phylum Bacteroidetes) patria medzi fylogeneticky najstaršie kolonizujúce a najčastejšie sa vyskytujúce zložky črevnej mikrobioty človeka. Sú symbiontmi, dôležitými z hľadiska výživy (napr. B. thetaiotaomicron) a z hľadiska slizničnej a systémovej imunity hostiteľa (B. fragilis) [45, 46]. Záujem o B. fragilis začal narastať v sedemdesiatych rokoch 20. storočia, ako o najpočetnejší druh z anaeróbov vyskytujúcich sa pri infekcii krvi a prispievajúci k tvorbe brušných abscesov. Avšak, B. fragilis je súčasne bežným rezidentom sliznice dolnej časti gastrointestinálneho traktu (GIT) človeka, kde predstavuje menej ako 1–2 % obsahu fekálnej mikrobioty [47, 48]. Kmene B. fragilis môžu teda v ľudskom organizme zohrávať dve protichodné úlohy – symbiontickú alebo patogénnu – v závislosti od prítomných povrchových antigénov a sekretovaných metabolitov [49]. Rozoznávame dva základné podtypy druhu B. fragilis neenterotoxigénny (NTBF) a enterotoxigénny (ETBF). Rozdeľujú sa na základe schopnosti produkovať termolabilný toxín BTF (z angl. Bacteroides fragilis toxin), čo je vlastne metaloproteináza, obsahujúca zinok. ETBF patria k významným etiologickým agens hnačkových ochorení zvierat a človeka, a často sú spájané aj so vznikom IBD a kolorektálneho karcinómu. Na druhej strane, kmene NTBF sú ľudskými symbiontmi, ktoré sa nespájajú s výskytom hnačkových ochorení a boli navrhnuté ako perspektívne probiotiká ďalšej generácie schopné potláčať napr. IBD [50]. Ak sú NTBF lokalizované v prostredí čreva, poskytujú hostiteľovi veľa benefitov, avšak ak dochádza k ich translokácii do brušnej dutiny, napr. pri poškodení črevnej bariéry po chirurgickom zákroku alebo následkom IBD, môžu aj oni vyvolať invazívne ochorenia [47, 49]. B. fragilis je schopný modulovať svoju povrchovú antigenicitu produkciou 8 rôznych puzdrových polysacharidov (PS) a regulovať ich expresiu pomocou tzv. „on/off“ systému reverzibilnou inverziou segmentov DNA, obsahujúcich promótory pre ich expresiu [51]. Najvýznamnejším a najviac študovaným PS je imunomodulačný zwitteriónový polysacharid A (PSA), ktorý je kľúčový pre poskytovanie priaznivých benefitov NTBF v hostiteľskom organizme. PSA preukázal ochrannú funkciu vo viacerých zvieracích experimentálnych modeloch, zameraných na IBD, či neurodegeneratívne ochorenia centrálneho nervového systému [52, 53]. Ako imunomodulačná molekula hrá PSA dôležitú úlohu pri maturácii imunitného systému hostiteľa. V nedávnej štúdii sa potvrdila schopnosť B. fragilis NCTC 9343 a/alebo jeho PSA upraviť nerovnováhu pomeru pomocných T_H1 a T_H2 lymfocytov v modeli gnotobiotických myší a zlepšiť funkciu T^_REG lymfocytov [48]. PSA sprostredkúva imunitnú odpoveď cez CD4⁺ lymfocyty. Tá si vyžaduje prezentáciu internalizovaných molekúl PSA prostredníctvom MHC II (z angl. major histocompatible complex II) lokalizovaných na povrchu APC buniek (z angl. antigen presenting cells). CD4⁺ lymfocyty následne prispievajú k ochrane pred tvorbou abscesov patogénnymi baktériami produkciou viacerých cytokínov [54, 55]. Štúdie na myšiach ukázali, že PSA produkovaný kmeňom B. fragilis NCTC 9343 mal významný vplyv na liečbu experimentálnej kolitídy a mohol by poskytovať ochranu pred stratou hmotnosti a znižovať mieru zápalu. PSA ako užitočná protizápalová molekula ochránila myši pred vznikom kolitídy spôsobenej baktériou Helicobacter hepaticus. PSA tiež moduluje imunitnú odpoveď indukciou produkcie protizápalového cytokínu IL-10 T^_REG lymfocytmi, čím potláča patologický zápal v gastrointestinálnom trakte a významne zvyšuje transkripciu granzýmu B, porfyrínu a CCR6 (chemokínový receptor spojený s migráciou T^_REG lymfocytov) [50, 56, 57]. Produkcia IL-10 T^_REG lymfocytmi indukovaná prostredníctvom PSA si vyžaduje zapojenie signálnej dráhy TLR2 (z angl. Toll-like receptor 2). Jej aktiváciou dokáže PSA pozitívne ovplyvniť vrodenú aj získanú imunitnú odpoveď [52, 53]. Konkrétnejšie, v podmienkach in vivo viedla aktivácia TLR2 signalizácie k navodeniu imunologickej tolerancie sprostredkovanej Foxp3⁺ (z angl. forkhead box protein 3) T^_REG lymfocytmi [58]. Tiež sa zistilo, že indukciou produkcie IL-10 môže PSA dokonca chrániť pred vznikom zápalu pľúc a experimentálne navodenou astmou [59]. V budúcnosti by preto mohol tento polysacharid nájsť uplatnenie v terapii astmy.

Podávanie B. fragilis, či už samostatne, alebo ako súčasti fekálneho transplantátu z človeka do myši, má aj protinádorový účinok, a okrem iného prispel k zníženiu expresie chemokínových receptorov CCR5 (spojených s prozápalovým účinkom) [60, 61]. Orálne podávanie B. fragilis významne zvýšilo obsah mastných kyselín s krátkym reťazcom (SCFAs) v čreve potkanov infikovaných salmonelami, v kombinácii s vankomycínom prispelo k zníženiu zápalu vyvolaného salmonelou a čiastočne obnovilo celistvosť črevnej bariéry [62]. Navyše, Ramakrishna et al. (2019) zistili, že PSA svojim účinkom znižuje zápalové poškodenie mozgu, a pozitívne tak ovplyvňuje priebeh encefalitídy vyvolanej herpesvírusom (HHV1) v myších modeloch [63]. Sľubným probiotickým kmeňom je B. fragilis ZY-312, ktorý bol izolovaný zo stolice zdravého dieťaťa. Okrem jeho schopnosti modulovať získanú imunitnú odpoveď, zlepšil fagocytovú aktivitu makrofágov a indukoval ich polarizáciu na M1 fenotyp (prozápalové makrofágy s vysokou mikrobicídnou a tumoricídnou aktivitou). Dokázal tiež zmierniť hnačku a zvýšiť mikrobiálne osídlenie čreva potkanov trpiacich post-antibiotickou hnačkou [48, 64].

Napriek tomu, že v literatúre nachádzame veľa pozitívnych účinkov NTBF a nimi produkovaného polysacharidu PSA pri prevencii, zmierňovaní, či terapii rôznych ochorení, kmene NTBF naďalej ostávajú veľmi kontroverznými kandidátmi na probiotiká ďalšej generácie. Samotný polysacharid PSA je v niektorých prácach popísaný ako agens indukujúci tvorbu abdominálnych abscesov, zatiaľ čo podľa iných prác prispieva k prevencii ich vzniku [49]. Rovnako, aktivácia TLR2 receptorov via PSA môže spúšťať protizápalový aj prozápalový mechanizmus [52, 53, 65]. V neprospech potenciálne probiotických kmeňov B. fragilis svedčí aj fakt, že v rode Bacteroides bola popísaná tzv. druhovo špecifická rezistencia, ktorá môže sťažiť potenciálne osídľovanie probiotickými kmeňmi B. fragilis v miestach, kde sa už nachádza iný kmeň toho istého druhu. Výhodou tejto druhovo špecifickej rezistencie však je, že pomocou T6SSs (sekrečný systém typu VI) dokážu netoxigénne kmene NTBF ochrániť hostiteľský organizmus pred kolonizáciou toxigénnymi ETBF [47, 49, 66]. Je preto veľmi dôležité pokračovať v štúdiu pozitívnych a negatívnych účinkov tohto mikroorganizmu, aby mohli byť objasnené všetky kontroverzie spojené s jeho prípadnou administráciou ako probiotika ďalšej generácie.

Faecalibacterium prausnitzii

Grampozitívna striktne anaeróbna baktéria Faecalibacterium prausnitzii (čeľaď Ruminocaccaceae, phylum Firmicutes) je jediným zástupcom v tomto rode a zároveň jedným z najpočetnejších členov ľudskej črevnej mikrobioty od približne siedmeho mesiaca života [67, 68, 69, 70]. U dospelých tvorí približne 5 % všetkých baktérií v stolici [71, 72]. Toto relatívne vysoké percento hovorí o dôležitosti a vplyve F. prausnitzii na fyziologické funkcie a zdravie hostiteľa [67]. Viaceré štúdie dokazujú súvislosť výskytu F. prausnitzii s niektorými ochoreniami a jej vplyv nielen na črevné zdravie.

F. prausnitzii dokáže metabolizovať fruktózu, fruktooligosacharidy, jablčný pektín, škrob, niektoré kmene hydrolyzujú inulín [73], a taktiež aj iné sacharidy vyskytujúce sa v lúmene čreva [74]. Dôležitá je schopnosť tejto baktérie fermentovať glukózu na acetát, butyrát, D-laktát a formiát.

Práve F. prausnitzii patrí k hlavným producentom butyrátu, ktorý patrí do skupiny SCFAs. SCFAs majú dôležitú úlohu v signalizácii medzi členmi mikrobioty a hostiteľom, a tiež vo výžive enterocytov. Butyrát je kľúčovým modulátorom črevného zdravia, slúži ako zdroj energie pre enterocyty a ukazuje sa, že má protizápalové účinky a pôsobí aj ako chemopreventant rakoviny [75]. Medzi pleiotropné účinky butyrátu možno zaradiť aj ochranu pred inváziou patogénmi, moduláciu imunitného systému a ovplyvnenie progresu rakoviny [76]. Na dôležitosť butyrátu poukazujú aj ďalšie poznatky získané z klinických dát. Pri nedostatku butyrátu, resp. butyrát-produkujúcich baktérií, sa znižuje epitelová signalizácia cez PPAR-γ [77].

Štúdia Miquelovej et al. (2015) ukázala, že F. prausnitzii popri spomenutých produkuje aj iné molekuly s protizápalovým účinkom. Na modeli experimentálnej kolitídy vyvolanej u gnotobiotických myší preukázali, že podávanie F. prausnitzii znížilo sérové hladiny prozápalových cytokínov na úroveň zodpovedajúcu stavu bez zápalu. Prítomnosť F. prausnitzii v čreve experimentálnych myší priamo korelovala s vysokými hladinami kyselín šikimovej a salicylovej. A hoci F. prausnitzii bola najviac zastúpená v dolnej časti GIT, metabolický vplyv baktérie bol pozorovaný pozdĺž celého traktu [73]. Prekurzor kyseliny salicylovej, kyselina 5-aminosalicylová, sa v klinickej praxi využíva v terapii IBD (liečivo tiež známe ako mesalazín). Preventívny účinok F. prausnitzii dokázali Kawade et al. (2019) pri kolitíde vyvolanej u laboratórnych myší. Podanie F. prausnitzii pred samotným vyvolaním kolitídy zmiernilo jej symptómy (strata hmotnosti, dĺžka čreva, DAI skóre [z angl. disease activity score, používa sa na hodnotenie stavu ulceróznej kolitídy]). Zaujímavé je, že tieto účinky boli pozorované len v prípade živých, a nie inaktivovaných baktérií [78]. IBD, medzi ktoré zaraďujeme najmä ulceróznu kolitídu a Crohnovu chorobu, sú spojené s nízkym výskytom F. prausnitzii, a to aj v obdobiach remisie [79].

Ďalším významným produktom F. prausnitzii je tzv. mikrobiálna protizápalová molekula (z angl. microbial antimicrobial molecule, MAM, 15 kDa), ktorá inhibuje zápalovú dráhu NF-κB v črevných bunkách in vitro v závislosti od dávky [80]. MAM reguluje proteíny pevného spojenia, ktoré prispievajú k udržaniu črevnej bariéry v podmienkach in vivo [81]. Lactococcus lactis s rekombinantným plazmidom kódujúcim MAM pôsobil preventívne v myšom modeli kolitídy. MAM by v budúcnosti mohol byť používaný ako protizápalové liečivo v terapii IBD, resp. slúžiť ako biomarker pre predikciu relapsu u týchto pacientov [80].

U pacientov trpiacich DM2 môže dôjsť tiež k zmenám vo výskyte F. prausnitzii. Pri DM2 sa pozoruje mierna črevná dysbióza u ľudí aj zvierat [82, 83]. V experimentálnom modeli DM2 na myšiach boli pozorované extrémne znížené počty F. prausnitzii v črevnej mikrobiote oproti kontrolným zvieratám. U diabetických myší bola tiež narušená štruktúra a funkcia črevnej bariéry, ktorá sa prejavila najmä down-reguláciou kľúčového proteínu pevného spojenia ZO-1 (zonula occludens 1). U týchto myší bola tiež znížená expresia MAM oproti kontrolným myšiam. Naopak, podaním rekombinantného proteínu MAM sa bariérová funkcia čreva signifikantne obnovila, a to najmä up-reguláciou ZO-1. Autori došli k záveru, že u diabetických myší je početnosť F. prausnitzii znížená a mohla by slúžiť ako biomarker diabetes mellitus. MAM podľa všetkého reguluje rôzne biologické procesy a signálne dráhy v črevnom epiteli [81].

Zaujímavý extraintestinálny vplyv F. prausnitzii bol pozorovaný na potkanoch, ktoré boli vystavené chronickému nepredvídateľnému miernemu stresu (z angl. chronic unpredictable mild stress, CUMS). CUMS vyvolaný potkanom sa považuje v dnešnej dobe za jeden z najlepších experimentálnych modelov depresie. Ukázalo sa, že podávanie F. prausnitzii malo preventívny a terapeutický účinok na zvieratá, a tiež anxiolytické a antidepresívne účinky, čo sa prejavilo na ich správaní. Po administrácii baktérie sa zvýšili hladiny SCFAs v čreve a v plazme boli pozorované vyššie hladiny IL-10. Na druhej strane, F. prausnitzii znížila v dôsledku CUMS zvýšené hladiny prozápalového IL-6, C reaktívneho proteínu a kortikosterónu [84]. Autori takto dokázali, že črevná mikrobiota má vplyv na nervový systém. V ostatných rokoch bola zavedená definícia pre psychobiotiká ako živé organizmy, ktoré ak sú požívané v dostatočnom množstve prinášajú zdravotný benefit pacientom s psychiatrickým ochorením [85]. Vyššie uvedené robí z F. prausnitzii potenciálne psychobiotikum.

Popísané priaznivé účinky F. prausnitzii poukazujú na jej široký rozsah pôsobenia a poskytujú podklad pre jej využitie ako probiotika ďalšej generácie nielen pri ochoreniach priamo súvisiacich s GIT.

ÚSKALIA PREVENCIE A TERAPIE PROBIOTIKAMI ĎALŠEJ GENERÁCIE

Množstvo štúdií, potvrdzujúcich súvislosť niektorých ochorení s črevnou mikrobiotou, ako aj jej moduláciu za účelom prevencie a/alebo liečby, jednoznačne dokazuje, že probiotiká ďalšej generácie môžu nájsť svoje uplatnenie v klinickej praxi. Na to, aby popredné farmaceutické spoločnosti prejavili záujem a investovali potrebné financie na prípravu nových preparátov s ich obsahom, však zrejme ešte nie je k dispozícii dostatok štúdií. Prísne kritéria zdravotníckych autorít, ako je Európska lieková agentúra (EMA), alebo Americký úrad pre kontrolu potravín a liekov (FDA), zahŕňajú viacero požiadaviek na finálny probiotický prípravok, týkajúcich sa podrobnej charakterizácie mikroorganizmov (ich pôvod, spôsob kultivácie), bezpečnostných rizík (možná patogenita a toxicita, vznik alergií, prenos génov rezistencie voči antibiotikám), či ich dávkovania pre človeka [7].

Zásadné je tiež prekonať viaceré technologické výzvy spojené s kultiváciou, formuláciou a uchovávaním prípravkov, nakoľko tieto aspekty môžu ovplyvňovať viabilitu baktérií, stabilitu prípravku, a tým pádom aj ich finálnu účinnosť. Všetky vyššie popísané baktérie sú anaeróbne, niektoré dokonca striktne, čo znamená, že prítomnosť kyslíka je pre ne toxická. Celý proces od výroby, skladovania až po prechod GIT preto musí minimalizovať riziko vplyvu kyslíka na tieto baktérie. Na to, aby bolo v procesoch formulácie a lyofilizácie anaeróbnych mikroorganizmov zabezpečené prostredie bez prítomností kyslíka, boli prezentované rôzne stratégie, ako použitie antioxidantov (zníženie redoxného potenciálu), alebo enkapsulácia (fyzikálna ochrana kmeňa), poskytujúce zodpovedajúcu viabilitu a funkčnú stabilitu mikroorganizmov [86]. V GIT zase treba zohľadniť riziko vplyvu žalúdočnej kyseliny, tráviacich enzýmov a žlčových kyselín. Vývoj nových liekových foriem je preto kľúčový nielen pre probiotiká ďalšej generácie, ale pre probiotiká celkovo. Dobrým príkladom je štúdia Van der Arka et al. (2017), ktorí demonštrovali, že enkapsulácia A. muciniphila v dvojitej emulzii voda/olej/voda zvýšila prežívanie baktérie v simulovaných podmienkach žalúdka [87]. F. prausnitzii bol zase schopný tolerovať nízke množstvo kyslíka pri formulácii s antioxidantmi, ako je cysteín alebo flavíny [88]. Iným prístupom, ako vyriešiť tieto technologické problémy sa núka použitie prebiotík. Prebiotiká sú v súčasnosti definované ako substráty, ktoré sú selektívne využívané hostiteľskými mikroorganizmami, ktoré poskytujú zdravotný benefit [89]. Preto sa javí ako výhodné podávať prebiotiká, či iné zložky stravy, ktoré by selektívne zlepšili rast a prežívanie probiotík ďalšej generácie in situ [25].

Ďalším dôležitým míľnikom, ktorý je nutné prekonať pred produkciou prípravkov s obsahom nových probiotík, je optimalizácia zloženia kultivačných médií tak, aby boli bezpečné pre človeka. V procese výroby nie je totiž možné zabezpečiť úplnú elimináciu rezíduí média vo finálnom produkte. Ako upozornili Plovier et al. (2017), v prípade akkermansie by pre ľudskú konzumáciu mohli byť potenciálne nevhodné animálne zložky média, ako je napr. mucín. V ich prípade sa, ako už bolo uvedené vyššie, podarilo pôvodné médium nahradiť syntetickým, ktoré bolo vhodné pre ľudskú konzumáciu [42].

Vďaka pokrokom v metódach metagenomiky a aplikácii „multiomics“ technológií sa podarilo odhaliť asociáciu medzi chýbaním vybraných taxónov a metabolických funkcií, ktoré zabezpečujú, a rozvojom konkrétnych patologických stavov. Personalizovaný prístup v suplementácii užitočnými mikroorganizmami sa ukazuje ako perspektívna cesta prevencie a/alebo terapie vybraných ochorení. Toto umožňujú aj metódy sekvenovania ďalšej generácie (angl. next generation sequencing), ktoré sú stále dostupnejšie, a je možné ich využiť napr. na mapovanie mikrobiómov.

ZÁVER

Rastúce množstvo poznatkov o mikroorganizmoch kolonizujúcich ľudské telo poskytuje stále viac dôkazov o význame črevnej mikrobioty pre zdravie človeka. Tradičné probiotické mikroorganizmy, ktoré sú už v dnešnej dobe pomerne dobre preskúmané, majú väčšinou pôvod vo fermentovaných potravinách, či GIT teplokrvných živočíchov. Výskum v ostatných rokoch ukazuje, že nové potenciálne probiotické kmene by mali byť izolované práve z miest, kde majú účinkovať, a kde sa prirodzene vyskytujú, teda z GIT zdravých jedincov. Preto kmene potenciálnych probiotík ďalšej generácie sú najmä mikroorganizmy, ktoré sú asociované s mikrobiotou zdravých ľudí a majú v nej aj hojné zastúpenie. Nedávne štúdie preukázali, že A. muciniphila má potenciál zvrátiť inzulínovú rezistenciu a obezitu, F. prausnitzii môže ochraňovať pred zápalovými ochoreniami čreva a B. fragilis redukuje zápal a preukázal protirakovinový účinok. V dnešnej dobe sa síce s výskumom a formuláciou takýchto probiotických preparátov spájajú viaceré problémy, je však isté, že tieto budú v budúcnosti vďaka neustále sa zdokonaľujúcim technológiám odstránené. Nové technológie nám nepochybne umožnia odhaliť aj ďalších vhodných probiotických kandidátov s unikátnymi vlastnosťami.

Do redakce došlo dne 15. 1. 2021.

Adresa pro korespondenci:

PharmDr. Hana Kiňová Sepová, PhD.

Farmaceutická fakulta

Kalinčiakova 8

832 32 Bratislava

Slovenská republika

e-mail: kinovasepova@fpharm.uniba.sk