Je možné pomocí časné molekulární odpovědi a její kinetiky předpovědět další osud pacientů s chronickou myeloidní leukemií?

Overview

Management a terapie pacientů s chronickou myeloidní leukemií (CML) doznaly za 20 let velkých změn. Zlatým standardem měření odpovědi na léčbu inhibitory tyrozinkináz (TKI) se stala metoda kvantitativní RT-PCR ke stanovení hladiny transkriptu BCR-ABL1. V zájmu sjednocení metodiky měření a její spolehlivosti došlo k mezinárodní harmonizaci interpretace výsledků vyšetření formou jejich vyjádření na mezinárodní škále a přidělování konverzního faktoru jednotlivým laboratořím na základě srovnání s referenčním pracovištěm. Časná molekulární odpověď na léčbu má významný vliv na průběh onemocnění a selektuje pacienty s dobrou prognózou. Část pacientů, kteří časné odpovědi nedosáhnou, má na další průběh i tak dobré vyhlídky. Pro jejich vyčlenění z rizikové skupiny je možno zohlednit kinetiku časného poklesu hladiny transkriptu. Koncept tzv. „halving time“ naznačuje vysokou míru úspěšnosti predikce citlivosti nemoci vůči nasazené terapii. V éře dlouhodobé terapie TKI je pořád častěji skloňovaným tématem možnost pokusu o remisi bez léčby (treatment-free remission – TFR). Tato strategie přináší možnost přerušit léčbu bez rekurence onemocnění, snížit její nežádoucí účinky a nezanedbatelnou ekonomickou zátěž systému. Identifikovat pacienty, u kterých lze tohoto cíle dlouhodobě dosáhnout, se však dodnes přesně nedaří. Stabilní TFR navíc udrží jen menšina pacientů. Volba léčebné strategie se tak může ubírat i snahou o maximální možnou redukci dávky TKI při trvající léčebné odpovědi. CML není vzorem jen pro cílenou léčbu a její úspěšnost, ale je ideální i pro matematické modelování onkologického onemocnění, mimo jiné i pro jednoduchost vyšetření nádorové nálože z periferní krve a její sledování v čase. Tímto lze do modelů zadávat jednoduše získaná a přesná data. Pomocí modelů jsme schopni simulovat podstatu vzniku CML z leukemické kmenové buňky, vliv TKI na tyto buňky, různé dávkovací režimy, pokus o TFR či odpověď imunitního systému na přítomnost nemoci. Následující text shrnuje přehled principů molekulárního měření léčebné odpovědi, vliv časné odpovědi a její kinetiky na prognózu pacientů a matematické modely CML v organizmu.

Klíčová slova:

chronická myeloidní leukemie – molekulární sledování – časná molekulární odpověď – halving time – matematické modely – remise bez léčby

ÚVOD

Když byl v roce 2001 schválen do klinické praxe imatinib jako první inhibitor tyrozinkináz (TKI), bylo novým a velmi odvážným cílem terapie chronické myeloidní leukemie (CML) zastavit progresi nemoci do blastické fáze, a zvrátit tak do té doby neodvratitelný osud většiny pacientů [1]. Poté byly uvedeny další, potentnější TKI, díky nimž jsme dnes úspěšní i v léčbě pacientů s rezistentním onemocněním. Chronickou terapií TKI dokážeme u majoritní části pacientů držet CML dlouhodobě pod kontrolou a jejich celkové přežití (over­all survival – OS) se blíží OS běžné populace. Novou odvážnou myšlenkou se v tomto prostředí stal cíl terapie zvaný remise bez léčby (treatment-free remis­sion – TFR). TFR je stav, kdy je pacient schopen léčbu TKI přerušit bez následného relapsu onemocnění. V dosud provedených a publikovaných studiích se úspěšnost pokusů o TFR u vybraných pacientů pohybuje kolem 50–60 %. Způsoby, jak identifikovat pacienty s vyšší šancí úspěšnosti TFR, by tak v této oblasti byly poměrně vítaným příspěvkem [2–7]. Viditelná je také snaha o vytvoření prediktivního matematického modelu [8–22]. Vize, že po shromáždění určitých údajů o pacientovi a jeho nemoci budeme schopni určit vhodný TKI a jeho dávku, predikovat odpověď na léčbu a nutnost délky terapie před možností vysazení k dosažení dlouhodobé TFR, je zatím pouze nedosažitelným  abstraktem.

Sledování odpovědi na léčbu je samostatnou kapitolou v „dějinách“ léčby CML. V počátcích jsme úspěšnost léčby mohli sledovat hlavně díky cytogenetickému vyšetření a identifikaci podílu Ph+ buněk v kostní dřeni pacientů [23]. Zavedení kvantitativní real-time polymerázové řetězcové reakce s využitím reverzní transkriptázy (RT-qPCR), v dnešní době zlatého a jediného doporučovaného standardu měření odpovědi na léčbu TKI, s sebou neslo i nutnost standardizace výsledků mezi jednotlivými laboratořemi ve formě zavedení mezinárodní škály (international scale – IS) a konverzního faktoru (conversion factor – CF) [24–28]. Díky RT-qPCR dokážeme kvantifikovat transkripční aktivitu buněk, tedy množství mRNA. Dnes se do popředí dostávají také modernější metody jako např. kvantifikace BCR-ABL1 přímo v DNA buněk [29].

Od zavedení TKI a sledování vývoje odpovědi na léčbu (zpočátku hlavně na cytogenetické úrovni) víme, že snižování počtu Ph+ buněk v krvi pacientů má pozitivní vliv na prognózu pacientů [23]. Postupem času se těžiště sledování léčebné odpovědi posunulo na molekulární úroveň a po ustálení, standardizaci RT-qPCR a průkazu významu dosažení poklesu hladiny transkriptů pod určitou úroveň bylo možné pro další osud pacientů stanovit cílové hodnoty poklesu transkriptu BCR-ABL1 v uzlových bodech terapie. Podle absolutní hodnoty vztažené k mezinárodní škále dosažené v určitém čase od zahájení terapie tedy dnes hodnotíme léčebnou odpověď na optimální, varování a selhání terapie (tab. 1) [3,30]. Víme také, že prognóza pacientů je lepší, pokud je dosaženo časné molekulární odpovědi (early molecular response – EMR) [31–40]. Pravidelné a přesné měření v uzlových bodech je tedy absolutním základem úspěšnosti léčby. Novější data dokazují, že přínos může představovat i měření dynamiky onemocnění v čase [41–46]. Hledání přesnějších parametrů s cílem optimalizace léčby pacientů s CML však pořád pokračuje.

V následujícím textu je ve formě přehledu analyzována problematika principu měření léčebné odpovědi na molekulární úrovni při léčbě TKI a jeho mezinárodní standardizace a téma vlivu časné molekulární odpovědi dosahované v uzlových bodech či vyjádřené formou zhodnocení kinetiky poklesu hladiny transkriptů v úvodu léčby na prognózu. Pozornost je věnovaná i vztahu těchto parametrů vůči úspěšnosti TFR a není opomenuto ani matematické modelování dynamiky CML na základě molekulárního měření.

PRINCIPY MOLEKULÁRNÍHO SLEDOVÁNÍ A STADARDIZACE MĚŘENÍ 

Od zavedení TKI do klinické praxe výrazně vzrostla šance pacientů na dosažení kompletní cytogenetické odpovědi (complete cytogenetic response – CCyR), tedy nepřítomnosti Ph+ buněk ve vzorku kostní dřeně vyšetřeném konvenční cytogenetickou analýzou karyotypu. Při doporučeném počtu 20 vyšetřených mitóz je ale jasné, že reziduální leukemické kmenové buňky unikají citlivosti tohoto vyšetření, a výsledek je tak de facto falešně negativní. Proto vznikla potřeba přesnějšího monitorování zbytkové nemoci. Metoda RT-qPCR, která monitoruje přímo množství transkriptu BCR-ABL1 (Q BCR-ABL1), nabízí vyšší citlivost s možností identifikace 1 leukemické buňky mezi 10⁵ buněk. Vyšetření lze provádět z periferní krve, což také snižuje invazivitu pravidelného monitorování. Naprostá většina pacientů má jeden ze dvou typů transkriptu (e13a2 nebo e14a2), které se navíc liší pouze jedním exonem genu BCR [47]. Při tomto typu vyšetření proto není nutno používat pacient-specifické primery. Výsledkem je poměr hodnot transkriptu BCR-ABL1 ke zvolenému kontrolnímu genu [25]. Volba vhodného kontrolního genu sehrává významnou roli. Jeho výběr je nutno zohlednit při interpretaci výsledků. Ideální kontrolní gen musí mít stejnou či podobnou hladinu stability a exprese jako fúzní gen BCR-ABL1. Dnes používanými jsou např. ABL1, BCR, GUS [48].

V zájmu lepšího porovnávání výsledků mezi jednotlivými pracovními skupinami a laboratořemi byla v roce 2005 navržena standardizace výsledků na mezinárodní škále (international scale – IS) ve smyslu udávání logaritmické redukce ze standardizované hodnoty. Touto hodnotou je medián Q BCR-ABL1 30 vstupních vzorků pacientů s CML v chronické fázi ze studie IRIS [26]. Názvosloví hodnot molekulární odpovědi (molecular response – MR) se vyvíjelo a opakovaně měnilo v čase. Aktuálně jsou odpovědi udávány s číslem odpovídajícím logaritmické redukci standardizované hodnoty (tab. 2). Hodnota MR3 odpovídá hladině transkriptů BCR-ABL1 ≤ 0,1 %^IS. Ve stejném duchu pak popisujeme MR4, MR4.5 a MR5. Velká molekulární odpověď (major molecular response – MMR) odpovídá hodnotě MR3 a hodnoty MR4 a vyšší jsou označovány jako hluboká molekulární odpověď (deep molecular response – DMR). Termín kompletní molekulární odpověď (complete molecular response – CMR) se k označení nedetekovatelné hladiny transkriptu dnes již nepoužívá, nebo se použije výraz molekulárně nedetekovatelná leukemie (molecularly undetectable leukemia). Časná molekulární odpověď (early molecular response – EMR) je definována jako hladina transkriptů BCR-ABL1 ≤ 10 % IS ve 3. měsíci léčby.

Zavedení IS zjednodušilo stanovení míry léčebné odpovědi v rámci jedné laboratoře. Vzhledem k různé technice, metodice provedení a volbě kontrolního genu ale zůstala nedořešena variabilita výsledků mezi jednotlivými laboratořemi. I zde došlo k harmonizaci postupu díky zavedení konverzních faktorů přidělovaných jednotlivým laboratořím na základě porovnávání jejich výsledků se závěry z příslušné referenční laboratoře. Protože původní návrh harmonizace pochází od australské pracovní skupiny, byla první referenční laboratoř ustanovena v Adelaide [24]. Projekt The European Treatment and Outcome Study (EUTOS) dal následně vzniknout síti referenčních laboratoří v Evropě za účelem zjednodušení přidělování CF lokálním laboratořím. Po přidělení CF by měla laboratoř procházet opětovnou re-evaluací v pravidelných časových intervalech nebo kdykoli při změně v procesu laboratorního vyšetření [28]. Velmi aktivně jsou do procesu mezinárodní harmonizace zapojeny i laboratoře v České republice [49].

Výsledkem vyšetření metodou RT-qPCR je množství mRNA, které současně odráží míru aktivity transkripce BCR-ABL1 v poměru ke kontrolnímu genu v buňkách a celkový počet leukemických buněk ve vzorku. Jak bylo uvedeno výše, na konečném výsledku se může podílet velké množství faktorů. I přes standardizaci postupů a harmonizaci výsledků mezi jednotlivými laboratořemi mají tyto faktory potenciál významně ovlivnit výsledek vyšetření. Se zaváděním stále modernějších metod je možné přímo detekovat fúzní gen v DNA. DNA molekula jedné leukemické buňky obsahuje v naprosté většině přesně 1 kopii fúzního genu BCR-ABL1 a 2 kopie kontrolního genu. Tímto způsobem lze určit přesný počet leukemických buněk ve vzorku. Za nevýhodu může být považována vyšší technická náročnost tohoto vyšetření. Ve fúzním genu BCR-ABL1 se totiž nacházejí introny unikátní pro každého pacienta, které jsou z transkriptu vystřiženy. K dosažení výsledku je potřeba nejdříve stanovit pacient-specifické body zlomu (break-points). Pagani et al. porovnávali výsledky RT-qPCR a DNA PCR u pacientů s CML a v prvních 3 měsících terapie pozorovali významně rychlejší pokles BCR-ABL1^IS proti BCR-ABL1 DNA. Po 6 měsících a dále docházelo ke shodě v naměřených hodnotách. Nabízí se vysvětlení, že v prvních 3 měsících nastává deplece leukemických buněk s vysokou aktivitou exprese. Po vymizení buněk s vysokou expresí je poté srovnatelný výsledek poklesu BCR-ABL1^IS proti BCR-ABL1 DNA vysvětlen snižujícím se počtem leukemických buněk [29]. Tento závěr odpovídá také ně­kte­rým matematickým modelům představeným v dalším textu [14,15,21]. Kombinaci měření zbytkové nemoci v DNA a mRNA lze také využít k predikci dosažení stabilní TFR, jak prokázala Machová Poláková et al. [50].

MĚŘENÍ MOLEKULÁRNÍ ODPOVĚDI V UZLOVÝCH BODECH A VLIV ČASNÉ ODPOVĚDI NA PROGNÓZU

Ještě před érou standardizace výsledků molekulárního vyšetřování hladiny transkriptů BCR-ABL1 byl pozorován vztah mezi jejím poklesem a cytogenetickou odpovědí. Merx et al. v roce 2002 ve skupině 101 pacientů, kteří trpěli CML v chronické fázi (chronic phase – CP) a byli po selhání interferonu léčeni imatinibem, prokázali, že pokles Q BCR-ABL1 pod 20 % původní hodnoty po 2 měsících terapie koreluje s šancí na dosažení velké cytogenetické odpovědi (major cytogenetic response – MCyR, tj. < 35 % Ph+ buněk) v 6. měsíci léčby [35]. V další studii Wang et al. u 47 pacientů s CML v CP popsali, že u pacientů, u kterých je dosaženo poklesu Q BCR-ABL1 po 1 měsíci terapie pod 50 % a po 3 měsících pod 10 %, je také větší šance na dosažení MCyR po 6 měsících. Vyšlo najevo, že molekulární odpověď nemá vztah jenom k cytogenetické odpovědi, ale byl prokázán také vliv na parametry přežití. Pacienti, kteří dosáhli zmíněných hladin BCR-ABL1, měli lepší výsledky přežití bez progrese (progression free survival – PFS) při mediánu sledování 16,5 měsíce [37]. Výsledky v podobném smyslu publikovali i Cortes et al., kdy ve studii u 280 pacientů zjistili, že ti, kteří po 3 měsících léčby imatinibem dosáhli redukce o méně než 1-log, mají po roce terapie menší šanci (55 %) dosáhnout MMR (v té době definované jako Q BCR-ABL1 ≤ 0,05 %) než ti, kteří dosáhli odpovědi větší než 1-log, resp. 2-log (84, resp. 95 %). Dosažení MMR poté vztáhli k šanci na udržení CCyR a postulovali, že MMR je pro udržení CCyR stěžejní [51]. Další práce zjistila, že snížení Q BCR-ABL1 o více než 2-log původní hodnoty mediánu pacientů během CCyR má vysokou prediktivní hodnotu pro přežití bez progrese onemocnění [36].

Po zavedení měření v IS v australské studii Branford et al. porovnávali molekulární odpověď u 28 pacientů ze studie IRIS. Pacienty rozdělili v různých uzlových bodech do 2 skupin: první skupina dosáhla poklesu Q BCR-ABL1 o víc než 2 log na IS a ve skupině druhé byl pokles menší. Pacienti, kteří dosáhli poklesu > 2 log IS, měli po 24 měsících terapie 100% šanci dosažení MMR – proti 54,2 % pacientů ve druhé skupině. Při stejném měření po 6 měsících terapie mělo šanci na dosažení MMR po 2 letech 86,4 % pacientů s poklesem > 2 log IS a 0 % pacientů s poklesem menším [52]. Tato studie jako první uvažovala o možnosti predikce pozdní odpovědi na základě dosažení EMR v uzlovém bodu 3 měsíců, aby na ni další práce přinášející důkazy o důležitosti EMR pro osud pacientů navázaly.

Marin et al. prokázali, že pacienti léčení imatinibem po 3 měsících terapie s Q BCR-ABL1 vyšším než 9,84 % dosahují po 8 letech signifikantně nižšího OS než ti, kteří mají pokles pod tuto hodnotu (56,9 vs. 93,3 %). Uplatněním této hodnoty prokázali významné rozdíly i v ostatních parametrech: PFS, přežití bez události (event-free survival – EFS), CCyR a CMR. Autoři konstatovali, že hladina Q BCR-ABL1 po 3 měsících terapie je nejpřesnějším způsobem, jak identifikovat pacienty s vysokým rizikem selhání terapie [38]. Hranice 10 % Q BCR-ABL1^IS, tedy redukce o 1 log IS, byla potvrzena jako důležitý prediktivní faktor i dalšími autory [32,33,39]. Ve snaze zlepšit prediktivní hodnotu časné molekulární odpovědi přistoupili někteří autoři ke kombinaci výsledků získaných měřením nejen ve 3., ale i v 6. měsíci léčby. Studie z Hammersmith Hospital prokázala, že inkorporace hodnoty Q BCR-ABL1 v 6. měsíci k odpovědi ve 3. měsíci nemá vliv na klinické rozhodování. Jinými slovy jsou šance na dosažení CCyR, PFS i OS analogické v případě, že se vychází pouze z léčebné odpovědi dosažené ve 3. měsíci či z kombinace údajů z 3. a 6. měsíce od zahájení terapie [53]. Další práce pak přinesla pozorování, že i podskupina pacientů, která nedosáhne EMR ve 3. měsíci, ale dosáhne Q BCR-ABL1 v 6. měsíci ≤ 10 %^IS, má stejně příznivé vyhlídky jako pacienti s EMR. Tak byli identifikováni „méně rizikoví“ pacienti ve skupině, která nedosáhne EMR [34]. Hanfstein et al. publikovali analogické závěry. Skupina, dosahující po 3 měsících hodnoty ≤ 10 % Q BCR-ABL1^IS, měla po 8 letech srovnatelný PFS i OS se skupinou, která této hodnoty dosáhla po 6. měsících. Hodnota ve 3. měsíci však byla o více než polovinu senzitivnější, zatímco hodnota v 6. měsíci zase specifičtější. Zohlednění pouze hodnoty v 6. měsíci by vedlo k identifikaci méně rizikových pacientů a méně případů progrese onemocnění [40]. Zjištěné skutečnosti našly svůj odraz v mezinárodních doporučeních pro léčbu CML, kde je hodnota mezi 1–10 % Q BCR-ABL1^IS v 6. měsíci terapie hodnocena jako varování, avšak ne jako selhání terapie [3].

KINETIKA MOLEKULÁRNÍ ODPOVĚDI A JEJÍ VZTAH K PROGNÓZE ONEMOCNĚNÍ

Z publikovaných výsledků je zřejmé, že pacienti, kteří dosáhnou EMR, mají statisticky lepší prognostické vyhlídky. Skupina pacientů, kteří EMR nedosáhnou, je však značně heterogenní, jak již bylo naznačeno. Jak tedy rozlišit rizikovost těchto pacientů? Diskutovaným tématem je nejen měření Q BCR-ABL1 v uzlových bodech, ale také vývoj kinetiky transkriptu BCR-ABL1 v čase u jednotlivých pacientů a jeho vliv na jejich další osud. Důvodů, kvůli kterým bodové měření nemusí být optimální, je hned několik. Kritérium optimální časné odpovědi (Q BCR-ABL1 ≤ 10 %^IS ve 3. měsíci od nasazení TKI) totiž nezohledňuje vstupní hodnotu pacienta, ale pouze míru redukce ze standardizované hodnoty. IS byla skvělou pomůckou pro sjednocení výsledků, ale nemusí být vhodným řešením pro všechny pacienty. Z klinické praxe také víme, že odběr krve nemusí nastat v přesně definovaných uzlových bodech terapie, ale může se z různých důvodů uskutečnit v rozmezí dokonce několika týdnů.

Analýza vývoje kinetiky molekulární odpovědi přinesla nové pojmy: poločas snížení (halving time – HT), vyjadřující ve dnech dobu do snížení hladiny transkriptu na polovinu původní hodnoty, a čas zdvojení (doubling time – DT), označující dobu, za kterou dojde k dosažení dvojnásobku původní hodnoty. Matematicky je HT vyjádřen následovně:

HT = –ln (2) / k, kde hodnota k vyjadřuje míru poklesu Q BCR-ABL1, tedy:

k = [ln (b) – ln (a) ] / d, kde a je vstupní hodnota Q BCR-ABL1, b je aktuálně měřená hodnota Q BCR-ABL1 a d je počet dní mezi těmito měřeními.

Jako první s konceptem rychlosti časné eliminace transkriptu BCR-ABL1 pracovali Hanfstein et al. v roce 2014. Z německé studie CML IV, v rámci níž byli pacienti s nově zjištěnou CML v CP léčeni čtyřmi režimy založenými na imatinibu, vybrali podskupinu pacientů a porovnávali vstupní hodnoty Q BCR-ABL1 s hodnotami po 3 měsících terapie. Jako kontrolní gen byl využit gen GUS. Medián vstupní hodnoty byl 33 %^IS s výraznou variabilitou hodnot jednotlivých pacientů (0,1–230 %). Pro výpočet individuálního poměru poklesu byly hodnoty BCR-ABL1 ve 3. měsíci léčby vyděleny vstupními hodnotami. Hladiny transkriptu poklesly v mediánu na 0,04× původní hodnoty, což odpovídá redukci o 1,4-log. Jako nejlepší hranice pro poměr rizik (hazard ratio – HR) a OS byla stanovena redukce 0,46-log. Pětileté přežití ve skupině s vyšší mírou redukce bylo 98 % vs. 83 % ve druhé skupině [42]. Použití genu GUS jako kontrolního genu bylo pro autory důležité zejména k přesnějšímu stanovení vstupních hodnot Q BCR-ABL1, protože při použití genů BCR či genu ABL se předpokládala větší nepřesnost měření. Jak ale později vyšlo najevo, tyto obavy z použití jiných kontrolních genů nebyly naplněny [46].

Jak je uvedeno výše, Branford et al. poté publikovali koncept HT. Ve své práci posuzovali výsledky studie u 528 pacientů s de novo dia­gnostikovanou CML v CP léčených imatinibem, ze kterých 95 nedosáhlo EMR. Při porovnání této skupiny s pacienty s úspěšným dosažením EMR byly popsány signifikantně horší výsledky přežití po 4 letech: OS 87 % vs. 97 %, PFS 86 % vs. 99 %, přežití bez selhání (failure-free survival – FFS) 48 % vs. 85 %. I v této skupině se však vyskytlo 34 pacientů, u kterých byl další vývoj onemocnění příznivý a později dosáhli MMR. Rozhodli se tedy otestovat teorii, že na další průběh onemocnění má u pacientů nedosahujících EMR vliv individuální hodnota HT. Výsledkem porovnávání bylo, že pacienti, u kterých došlo ke snížení hodnoty Q BCR-ABL1 na polovinu jejich vstupní hodnoty za 76 dní a méně (n = 74/95), měli lepší parametry přežití a vyšší šanci na dosažení MMR než pacienti (n = 21/95), u kterých byl HT delší (OS 95 % vs. 58 %, PFS 92 % vs. 63 %, FFS 59 % vs. 6 %, MMR 54 vs. 5 %). Pouze u jednoho pacienta s HT delším než 76 dní nedošlo v průběhu sledování k selhání terapie a pouze jeden dosáhl později MMR. Studie také poukázala na problematiku načasování vyšetření vzorku, které může významně variovat kolem 90 dnů od začátku terapie, a tím také ovlivnit interpretaci výsledků. Použitým kontrolním genem byl gen BCR (graf 1) [41].

Huet et al. se kromě ověření dopadu nízkého HT na další osud pacientů zaměřili také na jeho stanovení pomocí 2 různých kontrolních genů GUS a ABL1. Zjistili, že při použití GUS je proti ABL1 nutné stanovení jiného konverzního faktoru, který je navíc potřeba stanovit vždy nově pro různá období v průběhu léčby. Dále potvrdili, že GUS je u pacientů s CML zvýšeně exprimován. Tato zvýšená exprese má potom vliv i na výslednou hodnotu Q BCR-ABL1. Autoři zkonstatovali, že použití GUS coby kontrolního genu nemá proti ABL1 vyšší přínos. Studie přinesla další pozorování: vstupní hodnota Q BCR-ABL1 při použití obou kontrolních genů neměla vliv na prognózu pacientů, ale podobně jako ve výše uvedených pracích byl prokázán vztah dosažení EMR s lepší prognózou. Při měření HT ve vztahu s dosažením MMR po 12 měsících terapie vyšla jako prognosticky významná cut off hodnota 19 dnů při použití ABL1 a 21 dnů při použití GUS jako kontrolních genů [46]. Tato hodnota, značně nižší než v předchozích studiích, byla odůvodněna použitím nejen imatinibu, ale i TKI 2. generace, které do té doby v souvislosti s HT studovány nebyly. Kratší HT při použití TKI 2. generace popsali také Iriyama et al. v japonské studii D-First u pacientů léčených dasatinibem v 1. linii. Ve skupině 52 pacientů byl HT kratší než 14 dnů citlivým prediktorem nejen MMR ve 12. měsíci léčby (100 vs. 50 %), ale také dosažení DMR po 18. měsících (89 vs. 29 %) [43]. Podobný výsledek uvádějí Steegmann et al. v subanalýze studie ENEST1st u pacientů s dalším TKI 2. generace, nilotinibem, v 1. linii. Celkem 72 % pacientů s HT ≤ 13 dnů dosáhlo DMR po 18 měsících léčby.

Protože lze pomocí stanovení HT poměrně spolehlivě určit skupinu pacientů s vysokou šancí na dosažení optimální odpovědi na léčbu, pokusili se Pennisi et al. odpovědět na otázku, zda naopak parametr DT dokáže identifikovat pacienty s rizikem selhání terapie. Sledovali léčebnou odpověď u 305 pacientů léčených imatinibem v 1. linii, kteří v průběhu léčby dosáhli odpovědi MR3 nebo hlubší a u nichž byl následně zaznamenán nárůst hodnoty transkriptu. Tyto pacienty rozdělili do dvou skupin: v první skupině bylo 187 pacientů, kteří navzdory přechodnému nárůstu Q BCR-ABL^IS udrželi MR3 a pokračovali v další léčbě, zatímco druhá skupina zahrnovala 118 pacientů, kteří po nárůstu hladiny transkriptu postupně ztratili MR3, a tak dospěli k selhání terapie. Analýza potvrdila, že pacienti v první skupině měli signifikantně delší DT než ti, u kterých terapie selhala (57,8 vs. 41,45 dnů). Po selhání 1. linie bylo 98 pacientů léčeno TKI 2. generace, z nichž 21 bylo rezistentních i vůči této léčbě. DT pacientů byl při 2. selhání významně kratší než při selhání 1. linie (27,2 vs. 41,45 dnů). Je tedy zřejmé, že DT je nositelem prediktivní hodnoty selhání terapie [44].

Z výše zmíněných poznatků vyplývá, že halving time i doubling time mají schopnost předpovědět pozdní molekulární odpověď a její další vývoj. Protože je v moderní éře léčby CML novým léčebným cílem u ně­kte­rých pacientů také remise bez léčby TKI, vzniká tak potřeba odpovědět na související otázku: Je možné využít vývoje časné kinetiky poklesu transkriptu BCR-ABL1 i v rámci predikce dosažení a udržení TFR?

REMISE BEZ NUTNOSTI LÉČBY A JEJÍ VZTAH K ČASNÉ MOLEKULÁRNÍ ODPOVĚDI

Problematika TFR a její široké review byly v českém publikačním prostředí zpracovány v minulém roce [7]. Autoři této práce si tedy dovolí stručně zrekapitulovat stěžejní fakta a následně se zaměří na vztah TFR a molekulární odpovědi na léčbu a její kinetiky.

Remise bez léčby je definována jako udržení MMR u pacientů s CML bez medikace TKI. Důvodů pro zavedení TFR jako terapeutického cíle u pacientů s CML je několik: nežádoucí účinky TKI omezující kvalitu života a někdy i život ohrožující, plánovaní rodičovství, ekonomická zátěž zdravotního systému a v neposlední řadě přání pacientů. Z četných výsledků vysazovacích studií víme, že pokus o TFR je úspěšný globálně v přibližně 50 % případů. Pouze u jedné vysazovací studie bylo dosaženo vyšší úspěšnosti stabilní TFR. Britská studie DESTINY, ve které byla po splnění podmínek pokusu o TFR pacientům nejdříve na rok snížena dávka TKI na polovinu běžné dávky, vykázala úspěšnost kolem 70 % [54]. V absolutní většině případů selhání TFR k tomuto dochází v prvním roce po vysazení TKI. Zdá se, že neúspěšný pokus, tedy ztráta MMR, nevede k většímu riziku pro pacienty a po opětovném nasazení přerušené léčby dochází k obnově léčebné odpovědi. Existují už i zmínky o druhém pokusu o TFR po předchozím selhání. Je však nutno zmínit i fakt, že pokus o TFR je vhodný jen u pacientů naplňujících kritéria k vysazení, kterých je méně než 50 % z celkového počtu vstupně zaléčených pacientů. Tato kritéria navíc zatím nejsou globálně jednotná. Celkový počet pacientů, který dosáhne stabilní a udržitelné TFR, se tak pohybuje kolem 20 %. Jak ale tyto pacienty identifikovat? Z dosud provedených studií vyplývají následující předpoklady pro pokus o TFR: typický typ transkriptu, dosavadní terapie bez výskytu selhání, celková délka terapie TKI, celková délka trvání DMR, předchozí terapie interferonem alfa, počet NK buněk, CD4+ a gd+ lymfocytů, motivace pacienta, přístup pečujícího zdravotnického zařízení k pravidelnému a standardizovanému měření. Ně­kte­ré z těchto parametrů se promítají i do aktuálních doporučení panelu expertů The European LeukemiaNet (ELN) pro vysazování TKI u pacientů s CML (tab. 3) [3].

Při pohledu na souvislost TFR a molekulární odpovědi jsou pro možnost pokusit se o TFR a následně setrvat v dlouhodobé TFR dle ELN důležité tyto 2 parametry: délka terapie TKI minimálně 5 let (4 roky u TKI 2. generace) bez předchozího selhání a DMR v trvání 2 roky a více. Je známo, že TKI vyšších generací navozují v porovnání s imatinibem rychlejší a hlubší molekulární odpověď [55]. Léčba TKI vyšších generací s sebou ale nese i vyšší riziko závažných nežádoucích účinků; zároveň se dosud nepotvrdil vliv na zlepšení OS v porovnání s imatinibem. Proto se imatinib po dlouhá léta udržel po jejich boku jako standard v 1. linii léčby. Je však čas tento trend změnit? Když se na délku a hloubku molekulární odpovědi pohlíží při posuzování vhodnosti k pokusu o TFR, nejsou TKI vyšších generací lepší volbou léčby v 1. linii? Na tyto otázky prozatím odpověď neznáme. Z ELN doporučení však vychází, že pokud není dosaženo dostatečné hloubky odpovědi na imatinibu, je možné zvážit změnu na jiné TKI, pokud je TFR u daného pacienta žádaným cílem [3].

Pokud se jedná o vztah TFR a časné molekulární odpovědi, ať již v absolutní hodnotě (EMR) či její kinetice (HT), byla v době přípravy tohoto review publikována pouze jedna práce zabývající se tímto tématem. Australská pracovní skupina popsala kohortu 115 pacientů, kteří přerušili léčbu TKI se sledováním delším než 12 měsíců. Kritériem pro vysazení byla celková délka TKI terapie alespoň 3 roky a délka trvání MR 4.5 minimálně 2 roky. Z této skupiny bylo 63 (55 %) pacientů po jednom roce ve stabilní TFR. Ve snaze najít spolehlivý prediktor stabilní TFR analyzovali následující proměnné: pohlaví, věk v čase pokusu o TFR, Sokalovo skóre a EUTOS skóre dlouhodobého přežití (EUTOS long term survival, ELTS), typ transkriptu, čas do navození MR 4.5, trvání MR 4.5 před pokusem o TFR, celkovou délku terapie TKI, typ TKI před pokusem o TFR, TKI 1. linie, TKI 1. vs. 2. linie, EMR, Q BCR-ABL1 v čase dia­gnózy a v 3. měsíci léčby, poměr poklesu Q BCR-ABL1 v době dia­gnózy a v 3. měsíci, HT v prvních 3 měsících léčby a MMR dosaženou po 12 měsících terapie TKI. Jako jasné prediktory úspěšnosti stabilní TFR byly potvrzeny: HT, typ transkriptu a celková délka terapie TKI, zatímco dosažení EMR se jako prediktor nepotvrdilo (graf 2). U pacientů se stabilní TFR byl medián HT signifikantně kratší než u pacientů se ztrátou MMR (10,1 vs. 21,7 dní). Naopak pacienti s HT kratším než 9,35 dnů měli 80% šanci na dosažení stabilní TFR naproti 4% s HT delším než 21,85 dní. Shan­muganathan et al. ve své analýze dále potvrdili, že HT je nejenom prediktor stabilní TFR, ale i naplnění kritérií k pokusu o vysazení. Pacienti s HT kratším než 9,35 dní splnili kritéria k vysazení v 71 % případů proti 8,9 % případů s poločasem delším než 21,85 dní. Zde se potvrdila i prediktivní hodnota poměru poklesu Q BCR-ABL1 po 3 měsících a EMR. EMR je tedy prediktorem splnění kritérií pro pokus o TFR, ale stabilní TFR predikovat nedokáže (graf 3) [45].

MATEMATICKÉ MODELOVÁNÍ, VYTVÁŘENÍ PREDIKTIVNÍCH MODELŮ

Po zavedení imatinibu, léku představujícího revoluci v terapii CML, do klinické praxe byla očekávání od jeho účinku vysoká. Pomocí měření zbytkové nemoci, ať už cytogenetickými či molekulárními metodami, bylo možné pozorovat jasný trend poklesu počtu leukemických buněk u většiny pacientů. Po přerušení léčby však došlo poměrně záhy ke ztrátě léčebné odpovědi a obnovení proliferace maligního klonu. Jak je to ale možné? Pokud je leukemická kmenová buňka – prvopočátek a původce onemocnění – nositelem fúzního genu BCR-ABL1, jak to, že TKI na ni nepůsobí? Hledání vysvětlení přivedlo vědeckou obec k vytváření matematických modelů odpovědi CML na léčbu TKI.

Jedním z prvních je deterministický ordinary differential equations (ODE) model navržený Michor et al. V roce 2005 autoři predikovali matematický model se 4 stupni diferenciace buněk: kmenové buňky, které dávají za vznik progenitorům, z těch vznikají diferencované buňky a ty pak generují terminálně diferencované buňky. Zmíněné vývojové stupně platí jak pro zdravou, tak i leukemickou populaci, u které je fúzní gen BCR-ABL1 obsažen ve všech stadiích vývoje. Po nasazení imatinibu dochází během léčby k bifázickému poklesu množství leukemických buněk. V 1. fázi, která probíhá od začátku do 3. měsíce terapie, dochází k exponenciálnímu poklesu přibližně o 5 % za den. Ve druhé fázi, tj. mezi 6. a 12. měsícem, je tento pokles pomalejší a představuje asi 0,8 % za den. Při aplikaci ODE modelu na tato data autoři nabídli vysvětlení, že první pokles odpovídá zvýšenému obratu diferencovaných leukemických buněk, jejichž průměrná doba přežití je 20 dnů. Poté dochází k depleci progenitorů, jejichž průměrné přežití je 125 dnů. Závěrem autoři zkonstatovali nemožnost eradikace nemoci z důvodu rezistence leukemické kmenové buňky vůči imatinibu [19]. Na práci navázali později Tang et al., kteří při využití stejného modelu popsali u pacientů s delším sledováním také 3. fázi poklesu, o které se domnívali, že odráží pokles množství leukemických kmenových buněk [22].

Záhy po publikaci práce s využitím ODE modelu Roeder et al. navrhli možnost použití tzv. agent-based (ABM) modelu, který zohledňuje efekt imatinibu na leukemickou kmenovou buňku. Jejich matematický model uvažuje heterogenní populaci hematopoetických kmenových buněk závislých na různých signálech, podnětech a organizaci v rámci mikroprostředí kostní dřeně. Imatinib zde působí i na leukemické kmenové buňky, ale pouze na ty, které jsou v aktivním buněčném cyklu. Významná část leukemických buněk je však v klidovém (dormantním) stavu. Tyto nedělící se buňky unikají účinku imatinibu, v době jeho vysazení však mají potenciál se reaktivovat a způsobit relaps onemocnění. Autoři uvažovali také o možnosti použití filgrastimu či cyklické léčby TKI ve snaze o probuzení a následnou eradikaci tohoto dormantního klonu. Připustili možnost eradikace onemocnění za podmínky, že se u pacienta při dlouhodobé terapii nerozvine rezistence (obr. 1) [21].

Dalším typem modelu je stochastický model použitý Lenaerts et al. Výhodou tohoto modelu je dle autorů zachycení stochastické podstaty hematopoézy při menší populaci leukemických buněk. Tvrdí, že fúzní gen BCR-ABL1 nezvýhodňuje leukemickou kmenovou buňku při proliferaci proti ostatním kmenovým buňkám. Jako cíl léčby tedy nestanovují eradikaci leukemických kmenových buněk, ze kterých nemoc vzniká, ale odstranění progenitorových buněk, které jsou zodpovědné za její udržení. Tento model také připouští možnost eradikace nemoci při dostatečně dlouhodobé terapii TKI [18]. Dalšími modely jsou např. delay differential equation (DDE), který jako faktor zohledňuje také čas [8], stochastický model, navržený Komarovou a Wodarzem [17], a jiné.

Tyto modely a jejich variace byly použity i ve vztahu k dosažení TFR. Předpokladem úspěšné TFR je totiž buď úplná předchozí eradikace onemocnění, nebo alespoň dostatečná redukce počtu leukemických buněk pod určitou hodnotu. Horn et al. aplikovali už zmíněný ABM model na 69 pacientů léčených imatinibem ve studii IRIS s dostupným 7letým sledováním. Jako validační skupinu použili 31 pacientů ze studie CML IV. Nejprve dospěli k závěru, že není možné předpovědět dlouhodobý výsledek pouze z 1. fáze poklesu Q BCR-ABL1, ale je potřeba dostatečného počtu měření také z 2. fáze poklesu, celkově v počtu minimálně 14 měření. Data z měření hladiny transkriptu u skutečných pacientů poté využili na in silico interpretaci reziduálního množství leukemických buněk u těchto pacientů. U 14 % pacientů se dle modelu očekává eradikace CML během 15 let, u 31 % během 30 let. U 67 % pacientů při očekávaném věku dožití 80 let pak model počítá s přetrvávající existencí leukemických buněk v průběhu celého života. Autoři studie dále tvrdí, že při znalosti parametrů první a druhé fáze poklesu u konkrétního pacienta může být na základě modelu stanoven čas, po který musí pacient setrvat v MR5, aby mohlo dojít k úspěšnému přerušení léčby bez následného relapsu [15].

Cílem modelování bylo také odpovědět na otázku, zda mají TKI 2. generace větší vliv na redukci počtu leukemických kmenových buněk vzhledem k rychlejším a hlubším léčebným odpovědím dosaženým v klinických studiích a praxi. Glauche et al. ve své práci a modelování konstatují, že i když je při terapii TKI 2. generace dosaženo signifikantně rychlejší odpovědi v 1. fázi poklesu, je dlouhodobá odpověď, tedy 2. fáze poklesu, téměř totožná v porovnání s odpovědí při léčbě imatinibem. Autoři zdůrazňují interindividuální rozdíly v dynamice onemocnění bez ohledu na použité TKI či časnou odpověď. Uvažují také nad vlivem imunitní odpovědi organizmu na přítomnost leukemických buněk, kterou jejich model nebere v potaz [14].

Studie DESTINY, která již byla zmíněna díky výjimečně vysokému procentu dosažení stabilní TFR po předchozí de-eskalaci dávky TKI, rovněž inspirovala k simulačním studiím. S ohledem na jinak malé procento pacientů, které nehledě na výsledek reportovaný ve studii DESTINY opravdu dosáhne na stabilní TFR, vyvstává otázka: je možné u ostatních pacientů alespoň snížit dávku, a tak redukovat nežádoucí účinky a zároveň ekonomickou zátěž? Tomuto tématu se v nedávné přehledové práci věnují Žáčková et al. [56]. Fassoni et al. využili simplifikovaného ABM modelu k simulaci snížení dávky TKI o minimálně 50 a více procent na databázi pacientů ze studie IRIS a CML IV. Pro lepší porovnání se studií DESTINY byla vybrána pouze data od pacientů, kteří splňovali kritéria této studie (léčeni TKI alespoň po dobu 3 let, z toho alespoň poslední 1 rok v MMR). Dle jejich modelu by snížení dávky na 24,7 % standardní dávky mělo efektivitu 98,4 % v porovnání se standardní dávkou. Model předpokládá, že po snížení dávky může přechodně dojít ke zvýšení Q BCR-ABL1 v periferní krvi, které ale po krátkém čase opět klesá. Autoři také navrhují schéma postupného snižování dávky, kdy po přesné identifikaci 2. fáze poklesu (cca 18 měsíců od začátku terapie) dojde k redukci na 50 % standardní dávky, a poté následuje observace fáze poklesu při redukci (dalších 18 měsíců) a určení optimální dávky na základě porovnání těchto dvou křivek. Ani u tohoto modelu však není brána v úvahu imunitní odpověď organizmu [11].

Vztah imunitního systému a CML simuluje Fassoni et al. v další práci. Využitím modelu ODE autoři popisují 2 základní interakce: cílení imunitního systému na buňky CML a stimulaci či inhibici imunitních buněk v přítomnosti nemoci. Výsledkem je 20 submodelů, z nichž 9 splňuje kvalitativní podmínky pro další použití. Společným znakem všech 9 modelů je, že kromě jiných interakcí předpovídají aktivní supresi imunitního systému při vysokém počtu leukemických buněk (obr. 2) [12]. V recentní publikaci stejný kolektiv autorů používá analogický model s využitím dat 21 pacientů po přerušení léčby TKI. Pokud se v modelech jednotlivých pacientů nebrala v úvahu imunitní odpověď, byl u všech pacientů výsledkem simulace relaps onemocnění. To je ale v rozporu s reálným výsledkem u ně­kte­rých pacientů. Na základě této skutečnosti je konstatováno, že k objasnění dalšího vývoje nemoci před a po přerušení TKI je nutný také individuální imunologický komponent nebo jiný tzv. TKI nezávislý protileukemický efekt. Autoři předpokládají existenci tzv. „imunitního okna“ (immune window). Ve stadiu, kdy je leukemie nekontrolovaná, vede nadbytek leukemických buněk k supresi imunitní reakce. Pokud dojde k druhému extrému a počet leukemických buněk klesne pod jistou pacient-specifickou hranici, imunitní systém není stimulován jejich přítomností, a proto stoupá riziko rekurence nemoci. Mezi těmito hodnotami vzniká zmíněné imunitní okno. Protože zmíněný model nedokáže předpovědět efekt vysazení na celkový stav nemoci pouze z údajů měření během standardní léčby TKI, je zde navržena observace vývoje nemoci nejdříve po redukci dávky. Na základě vývoje po de-eskalaci dávky dokáže model určit pacienty, u kterých je vysoké riziko ztráty léčebné odpovědi po vysazení léčby [16]. Simulace vztahu imunitního systému a CML byla popsána také dalšími autory [9,10,20].

DISKUZE A ZÁVĚR

V posledních 2 dekádách se možnosti léčby pacientů s CML dramaticky změnily. Po výrazném zlepšení prognózy a celkového přežití se tak pozornost zaměřila na 2 problematické oblasti: identifikaci a management rizikových pacientů v co nejkratším čase a na druhé straně na možnosti dlouhodobého postupu u tzv. „good responders“, tedy pacientů s trvající optimální léčebnou odpovědí. Ve snaze odlišit tyto dvě skupiny pacientů se dnes již standardně využívají riziková skóre, např. Sokal, Hasford, EUTOS a nově také ELTS, dle doporučení ELN 2020. Nevýhodou využití těchto skórovacích systému je, že většina z nich byla představena ještě před zavedením TKI pro pacienty léčené hydroxyureou či konvenční chemoterapií (Sokal, Hasford). Nová skóre (EUTOS, ELTS) jsou sice odvozena od výsledků léčby pacientů pomocí TKI, ale vzhledem k tomu, že se jedná o vstupní hodnoty, není zohledněna odpověď pacientů na léčbu. Ta se však jeví být stěžejním prognostickým faktorem, schopným zmírnit či eliminovat vliv případných vysokých hodnot zmíněných rizikových skóre. V kontextu odpovědi na léčbu získává čím dál větší význam zhodnocení časné odpovědi na léčbu TKI, kdy dosažení hladiny BCR-ABL1 transkriptů ≤ 10 % po 3 měsících od zahájení terapie přináší benefit v přežití bez události i OS jak pro pacienty léčené imatinibem, tak TKI 2. generace. I ve skupině pacientů, kteří optimální časné odpovědi nedosáhnou, se pořád nacházejí pacienti s dobrou prognózou, které pouze zhodnocením selhání EMR nedokážeme identifikovat. U těchto pacientů lze s výhodou použít měření kinetiky poklesu hladiny transkriptu BCR-ABL1 v prvních několika měsících od nasazení léčby a stanovení parametru HT. Problémem při stanovení HT v klinické praxi je fakt, že dle doporučení ELN není v čase dia­gnózy vyžadováno vstupní kvantitativní vyšetření Q BCR-ABL1 a že vstupní hodnota tak může chybět. Navíc je známo, že vzhledem k velké vstupní náloži je tato hodnota i pro limitace laboratorní metody často velmi nepřesná. Tento fakt lze obejít výpočtem HT až po úvodním poklesu hladiny transkriptu, např. mezi 1. a 3 měsícem.

Kromě možnosti predikovat dosažení optimální léčebné odpovědi se HT ukázal být důležitým i pro predikci úspěšnosti TFR. V poslední době také pozorujeme iniciativu snížení dávky užívaného TKI za účelem snížení nežádoucích účinků a ekonomické zátěže, protože podíl pacientů ve stabilní TFR je malý v porovnání s celkovým počtem pacientů i v porovnání s pacienty s dlouhodobou léčebnou odpovědí. Při dobré toleranci snížené dávky je později možný i pokus o TFR, jak již bylo provedeno ve vysazovací studii DESTINY. Tato studie se vzhledem k výjimečným výsledkům stala inspirací i pro aktuálně probíhající českou celonárodní akademickou studii HALF (registrována na clinicaltrials.gov, NCT04147533). Pokusu o TFR v této studii předchází snížení na polovinu standardní dávky TKI na dobu 6 měsíců a další redukce v podobě podávání této dávky obden během dalšího půl roku. Péče o pacienty s CML je v ČR soustředěna do hematologických center. Z toho plyne jasný benefit studie HALF mimo jiné i v rámci sběru solidních dat z kontinuální péče již před začátkem studie.

CML se pro svojí patogenezí stala také excelentním vzorem pro matematické modelování onkologického onemocnění. Všechny buňky CML jsou standardně nositeli fúzního genu BCR-ABL1 a nádorová nálož se dá měřit z jednoduchého odběru periferní krve. Tato data jsou navíc pravidelně doplňována během terapie nemoci. Na tomto základě vzniklo množství matematických modelů. Zpočátku se různými koncepty modelovala podstata nemoci, chování leukemických buněk v kostní dřeni a vliv TKI na tyto buňky nebo také možnost jejich totální eradikace. Dnes je pomocí matematických modelů s využitím dat z reálné praxe simulováno snižování dávek TKI, pokusy o TFR a jejich udržitelnost. Vliv imunitního systému a jeho interakce s CML má pravděpodobně zásadní vliv na další vývoj onemocnění, což mnohé modely zohledňují. Obě skutečnosti – jak snaha o matematické modelování v kontextu redukce dávek a TFR, tak téma vlivu imunitního systému na udržitelnost léčebné odpovědi ve fázi redukce dávek TKI i jejich následného vysazování – jsou rovněž součástí ambiciózního plánu studie HALF rozkrýt dosud neobjasněné aspekty optimalizace dlouhodobé léčby pacientů s CML.

PODÍL AUTORŮ NA RUKOPISU

TH – napsání rukopisu

DŽ, JM – revize a připomínkování rukopisu

ČESTNÉ PROHLÁŠENÍ

TH poskytl konzultační služby společnosti Angelini. DŽ poskytla konzultační služby společnosti Angelini, přednášela na edukačním sympoziu společnosti Angelini a satelitním sympoziu společnosti Bristol Myers Squibb a zúčastnila se odborné akce s podporou společnosti Novartis a Bristol Myers Squibb. JM obdržel výzkumné granty od společnosti Novartis, Bristol Myers Squibb a Angelini a přednášel na sympoziích společností Novartis a Bristol Myers Squibb.

Do redakce doručeno dne: 19. 5. 2021.

Přijato po recenzi dne: 1. 6. 2021.

doc. MUDr. Daniela Žáčková, Ph.D.

Interní, hematologická a onkologická klinika

LF MU a FN Brno

Jihlavská 20, 625 00 Brno

e-mail: zackova.daniela@fnbrno.cz