Markery poškození krevních buněk

Overview

Krevní buňky podléhají během odběru, zpracování a skladování významným morfologickým a biochemickým změnám. Struktura a funkce krevních buněk jsou ovlivněny řadou faktorů, počínaje technikou odběru, složením antikoagulačního roztoku, kontaktem s povrchem odběrového vaku či setu, metodou zpracování, obsahem leukocytů v produktu či způsobem deleukotizace. Metabolické a morfologické alterace erytrocytů i trombocytů v koncentrátech limitují jejich skladovatelnost a pravděpodobně mohou ovlivnit terapeutický efekt transfuze. Sdělení předkládá stručný přehled změn, které v krevních buňkách v průběhu skladování probíhají, možnosti monitorování buněčného poškození a shrnuje význam stanovení markerů buněčného poškození pro výzkum, validaci nových postupů a praxi.

Klíčová slova:
krevní buňky, buněčné poškození, markery, aktivace

Úvod

Krevní buňky podléhají během odběru, zpracování a skladování významným morfologickým a biochemickým změnám. Struktura a funkce krevních buněk jsou ovlivněny řadou faktorů, počínaje technikou odběru, složením antikoagulačního roztoku, kontaktem s povrchem odběrového vaku či setu, metodou zpracování a obsahem leukocytů v produktu, či způsobem deleu-kotizace (1, 2, 3, 4, 5). Metabolické a morfologické alterace u erytrocytů i trombocytů v koncentrátech limitují jejich skladovatelnost a dle některých autorů mohou ovlivnit terapeutický efekt transfuze (6, 7, 8). Některé z těchto změn jsou reversibilní a jiné ne (5). Všechny mechanismy vedoucí k poškození krevních buněk během odběru a skladování nejsou dosud plně objasněny (8).

Morfologické a metabolické změny krevních buněk

Krevní buňky podléhají během skladování apoptóze (9), procesu programované řízené buněčné smrti (10), ke které dochází přirozeně stárnutím krevních buněk během skladování (11), tento proces je doprovázen řadou morfologických a metabolických změn (12). Morfologické změny u trombocytů se projevují změnou diskoidního tvaru ve sférický (4). Erytrocyty následkem zejména deplece adenosintrifosfátu (ATP) mění diskoidní tvar v echinocyt (13). Metabolické alterace krevních buněk se projevují ve změnách pH, zvýšení LDH v supernatantu, v konzumpci glukózy a produkci laktátu (14). Tyto změny odrážejí intenzitu probíhající anaerobní glykolýzy a mají význam pro metabolismus erytrocytů i trombocytů (15, 16). Produkce kyselin a následné snížení pH snižuje viabilitu a funkci krevních buněk.

Markery apoptózy krevních buněk

V průběhu apoptózy dochází k externalizaci phosphatidylserinu na povrch buněčné membrány (5, 7, 8), u trombocytů navíc k expresi markerů aktivace. Phosphatidylserin (PS) je fyziologicky lokalizován na cytoplazmatické straně plazmatické membrány. V buňkách, které podléhají apoptóze, se phosphatidylserin translokuje na extracelulární stranu trombocytu při skladovací teplotě 22 °C (u erytrocytu při 4 °C) a uvolňuje do plazmy (5). Zde může být v solubilní formě detekován technikou ELISA. Membránová exprese může být prokázána po vazbě monoklonálních protilátek průtokovou cytometrií, která využívá vazby PS na annexin V. Přestože proces apoptózy doprovází řada změn, externalizace phosphatidylserinu na povrch buněčné membrány je považována za její časný znak (5).

Za moderní marker jakosti transfuzních přípravků je považován annexin V, globální marker apoptózy (17, 18, 19, 20). Jde o intracelulární glykoprotein, který je v buňkách fyziologicky obsažen v cytosolu a organelách. Jeho zvýšená plazmatická hladina je v přímé relaci se stupněm buněčného poškození a jeho stanovení je dnes používáno jako vysoce senzitivní parametr monitorování kvality trombocytových transfuzních přípravků (17, 18, 20). Při současném stanovení K⁺ a volného hemoglobinu je vhodným markerem buněčného poškození erytrocytových transfuzních přípravků (19).

Specifické změny při skladování erytrocytů („red cell storage lesion“) byly popsány již v roce 1956 Gibsonem (21). Tyto změny progredují během skladování a jsou ovlivněny složením antikoagulačních a skladovacích roztoků (5). Erytrocyty mohou být významně ovlivněny osmotickým šokem při kontaktu odebírané krve s hyperosmolárním antikoagulačním roztokem („red cell collection injury“) (21). Během skladování významně klesá obsah 2,3-difosfoglycerátu (2,3-DPG) a ATP. Po týdnu skladování se hladina 2,3-DPG snižuje až na 10 %, což může vést k redukci schopnosti uvolnit O2 do mikrocirkulace (5, 22). Snížená hladina ATP může ovlivnit přežití erytrocytů tím, že sníží jejich pružnost a zvýší jejich destrukci při průchodu mikrokapilárami. Obsah 2,3-DPG a ATP v erytrocytech se může po transfuzi obnovit (50–70 % za 1 den, plně za týden) (5). Hladina 2,3-DPG a ATP je významně ovlivňována i sníženou hodnotou pH. Hodnota pH reprezentuje metabolické změny, dále je ovlivněna vysokou koncentrací citrátu v antikoagulačním roztoku (pH 5,5–5,8) (15, 23). Moderní modifikované antikoagulační a skladovací roztoky mohou ovlivnit funkci erytrocytů tím, že oddálí snížení obsahu 2,3-DPG a ATP (24).

V průběhu skladování dochází ke změnám tvaru erytrocytu a změně integrity buněčné membrány, proces je spojen se zvýšením hladiny intracelulárního Ca²⁺ a poklesem pH a ATP. Následná buněčná dehydratace a vznik mikrovesikulací ovlivňují rheologické vlastnosti erytrocytů. Současně vlivem snížení činnosti Na⁺/K⁺ pumpy klesá obsah intracelulárního K⁺ (6), k jehož normalizaci dochází během několika hodin po transfuzi (15, 25).

Relativně novým markerem stavu erytrocytů je stanovení CD47. Jde o transmembránový glykoprotein, který je přítomen na většině tělesných buněk. V případě erytrocytů se jedná o tzv. „ self-recognition marker“. Jeho přítomnost na povrchu erytrocytu představuje ochranu cirkulujích erytrocytů před fagocytózou (26), která je důležitá pro jejich přežití in vivo po transfuzi (27). Hladina CD47 v supernatantu přípravku odpovídá úrovni lýzy erytrocytů (26).

Specifickou změnou pro trombocyt je aktivace, odezva klidové destičky na specifické stimuly zprostředkovaná receptory různých typů (28). Aktivace trombocytu je spojena se snížením metabolické aktivity trombocytu a s morfologickými a funkčními změnami, které progredují od 3. dne skladování přípravku. Změna tvaru trombocytu z diskoidního na sférický se projevuje snížením až vymizením tzv. „swirling fenoménu“, který je v praxi známkou viability trombocytu. Tento proces je ovlivněn hodnotou pH. Za kritický pro viabilitu a funkci trombocytů je považován pokles pH pod hodnotu 6,2 (16, 29, 30). Současně dochází k degranulaci vnitřních granulárních struktur trombocytu, která vede k povrchové expresi makromolekul lokalizovaných původně intracelulárně v granulích destiček. Jednou z nich je P-selektin (CD62P), integrální membránový glykoprotein alfa-granulí, který se na povrchu klidové destičky nenalézá a jeho povrchová detekce je průkazem degradace alfa-granulí (27). Exprese P-selektinu na povrchu destičky umožňuje prostřednictvím specifické membránové molekuly PSGL-1 (CD162) její adhezi na granulocyty a monocyty a následné odstranění z cirkulace tkáňovými makrofágy (31). Stanovení exprese CD62P na povrchu trombocytů nebo jeho solubilní formy v supernatantu přípravku je používáno k posouzení aktivace trombocytů v přípravku (7, 8). Zvýšení hladiny/exprese CD62P koreluje se vzestupem anexinu V a poklesem pH. Při hodnotách pH 6,2–6,8 dochází k expresi CD62P, která je po inkubaci trombocytu v plazmě reverzibilní. Při hodnotě pH < 6,2 již dochází k ireverzibilnímu poškození trombocytu s ireverzibilní expresí CD62P, která je spojena s uvolněním cytokinů z trombocytů (32).

Cytokiny, zejména IL-1β, IL-6, IL-8, či RANTES, byly zkoumány v erytrocytových i trombocytových přípravcích. Byla prokázána souvislost mezi hladinou cytokinů v přípravcích a následnými nehemolytickými febrilními potransfuzními reakcemi (33). Zejména obsah IL-8 závisí na stupni kontaminace přípravku leukocyty a trombocyty (34). Obsah cytokinů v přípravcích může být ovlivněn i způsobem odběru krve, technologií jejího zpracování a dodatečnými procesy, jako filtrace produktu, které mohou mít vliv na aktivaci trombocytů a způsobit generaci cytokinů z trombocytů (32, 35). Stanovení cytokinů ve vhodných kombinacích tak může být vhodným indikátorem jakosti transfuzních přípravků (36, 37).

Praktický význam stanovení markerů poškození krevních buněk

V běžné praxi se pro kontrolu jakosti transfuzních přípravků používají jednoduché testy in vitro, jako stanovení stupně hemolýzy u koncentrátů erytrocytů, pH a swirling fenomén u koncentrátů trombocytů (38). Klinický význam stanovení markerů poškození krevních buněk je stále zkoumán (5). Hodnocení markerů metabolického stavu krevních buněk, tj. stanovení hladiny glukózy, laktátu a LDH (7, 38), markerů apoptózy a aktivace buněk, např. annexinu V a exprese P-selektinu (4, 17), se používá zejména in vitro při zkoumání vlivu použitých materiálů a technologií na krevní buňky. V literatuře nalezneme řadu prací porovnávajících kvalitu trombocytových transfuzních přípravků získaných různými technologiemi – např. porovnání přípravků z buffy-coatů, z aferézy (39), trombocytů vyrobených manuálně či přístrojově (40). Zkoumání metabolického stavu trombocytů v různých aditivních roztocích pro jejich skladování přineslo jasný průkaz vyšší kvality trombocytů skladovaných v roztocích III. generace, zejména objasněním pozitivního vlivu K⁺ a Mg⁺⁺ na metabolismus trombocytů (41, 42). V současné době je tímto způsobem zkoumáno možné prodloužení skladování trombocytových transfuzních přípravků na více než 7 dnů (43, 44), vliv působení patogenní inaktivace na krevní buňky (45, 46, 47), či ozařování, resp. promývání transfuzních přípravků. Značná pozornost je věnována objasnění mechanismu potransfuzních reakcí, zejména vlivu působení mikrolipidových partikulí a možné souvislosti s TRALI (48). Aktuální je studium vlivu „stáří“ transfundovaných erytrocytů a jejich vlivu na lidský organismus (49).

Doručeno do redakce: 2. 9. 2013

Přijato po recenzi: 2. 12. 2013

MUDr. Renata Procházková, Ph.D.

Transfuzní oddělení

Krajská nemocnice Liberec, a.s.

Baarova 15

460 63 Liberec

renata.prochazkova@nemlib.cz