Predikce odpovědi metastatického kolorektálního karcinomu na cílenou anti-EGFR léčbu

Moderní kombinovaná chemoterapie s cílenou anti-EGFR léčbou vede u senzitivních pacientů s metastatickým kolorektálním karcinomem k prodloužení života a zlepšení jeho kvality. U rezistentních pacientů však použití monoklonálních anti-EGFR protilátek může naopak vést ke zhoršení parametrů přežití. Identifikace senzitivních a rezistentních pacientů se tak stala klíčovou otázkou při rozhodování o léčebné strategii. Četné klinické studie vedly ke zjištění, že rezistence k anti-EGFR terapii je v naprosté většině případů spojena s trvalou aktivací signálních drah distálně od EGFR. Z mnoha studovaných faktorů se do rutinní praxe dostaly pouze mutace genů KRAS a NRAS. U ostatních markerů (mutace BRAF, PIK3CA, inaktivace PTEN a TP53, amplifikace EGFR a HER-2, zvýšená hladina ligandů epiregulinu a amphiregulinu, microRNA miR-31-3p, miR-31-5p a další) je třeba dalších studií. Přesnost prediktivní diagnostiky je možno zvýšit kombinací vyšetřovaných markerů např. pomocí metod založených na sekvenování nové generace.

Klíčová slova:
kolorektální karcinom – predikce – molekulární markery

Česká republika se v incidenci kolorektálního karcinomu (CRC) trvale pohybuje na předních místech pomyslného žebříčku (1). Zhruba čtvrtina pacientů je diagnostikována již se vzdálenými metastázami, u dalších asi 25 – 40 % pacientů se po iniciální onkologické terapii metastázy objeví. Více než polovina nemocných s CRC tedy v průběhu choroby bude léčena systémovou paliativní terapií. Ta je založena na chemoterapii (5-fluorouracil, oxaliplatina a/nebo irinotekan), obvykle v kombinaci s monoklonálními protilátkami proti VEGF (bevacizumab) nebo EGFR (cetuximab, panitumumab). Tato léčba významně – až o několik let – prodlužuje celkové přežití. Přibližně 35 – 45 % pacientů na anti-EGFR terapii neodpoví, u některých pacientů může dokonce nesprávně indikovaná anti-EGFR terapie vést i ke zhoršení času do progrese onemocnění (PFS) a celkového přežití (OS)(2-6). Již více než dekádu probíhá hledání faktorů, které by dokázaly predikovat odpověď či rezistenci k cílené léčbě CRC. U bevacizumabu takové prediktory nalezeny nebyly. Naopak u anti-EGFR protilátek se podařilo najít silný negativní prediktor v podobě aktivačních mutací v onkogenu KRAS (7,8). Jednalo se o důležitý milník ve vývoji moderní onkologie, neboť do té doby byly známy pouze prediktory pozitivní, jako Her-2 amplifikace u karcinomů prsu či CD 20 exprese u B lymfomů. Ukázalo se, že drtivá většina CRC má aktivované signální dráhy spojené s receptorem EGFR (9).

EGFR

Receptor pro epidermální růstový faktor (EGFR, Egfr, Her1) je členem rodiny receptorů s tyrozinkinázovou aktivitou. Po vazbě ligandu (epidermálního růstového faktoru, epiregulinu, amphiregulinu, aj.) vytváří homo- či heterodimery a aktivuje dvě hlavní intracelulární cesty: signální dráha RAS-RAF-MAPK je zodpovědná zejména za signalizaci proliferační, zatímco dráha PI3K/PTEN-AKT-mTOR zprostředkovává buněčné přežití a podílí se na motilitě a invazivitě nádorových buněk (10,11). Existují i další (méně významné) EGFR aktivované signální dráhy jako JAK/STAT nebo dráha fosfolipázy C gamma (9). Vazba terapeutických monoklonálních protilátek na extracelulární doménu receptoru by měla (v ideálním případě) aktivaci všech těchto drah zablokovat a vést tak k potlačení nádorového růstu. Je však důležité si uvědomit, že nádorová populace každého maligního nádoru je heterogenní a kromě dominantního klonu, který právě vítězí v soutěži o nejagresivnější subpopulaci, jsou přítomny četné minoritní klony nesoucí nejrůznější – aktuálně neužitečné – mutace. Na nádor je v situaci, kdy ho vystavujeme selekčnímu tlaku léčby, nutno nahlížet prizmatem populační biologie. Je zcela očekávatelné, že i úspěšná léčba majoritního klonu vede k selekci jednoho či více rezistentních klonů, jejichž mutace se právě staly výhodnými. Je to i případ CRC, kde léčebné odpovědi na biologickou léčbu jsou většinou dočasné za vzniku sekundární rezistence.

Mutace RAS

Proteiny RAS rodiny (KRAS, NRAS a HRAS) jsou strukturálně navzájem vysoce homologní a fungují jako přenašeče signálu. Jejich GTP-ázová doména v normální buňce auto-defosforyluje RAS protein a tím jej udržuje v trvale vypnutém stavu; aktivace RAS je standardně pouze krátkodobá a dočasná (12). Mutace postihující tuto doménu znemožní tuto „samozhášecí“ aktivitu a vedou ke konstitutivní aktivaci, nezávislé jak na vazbě ligandu na EGFR receptor, tak na vazbě terapeutické protilátky. Již brzy po uvedení cetuximabu do klinické praxe se ukázalo, že mutace KRAS genu způsobují primární rezistenci. V kodonech 12 a 13 nemutovaný (wt) KRAS gen se tak stal standardní podmínkou nasazení této léčby (7,8,13,14). Na základě retrospektivních analýz velkých studií fáze III (OPUS, Crystal, PRIME)(5,15-17) se v letech 2013/2014 ukázalo, že stejný negativní prediktivní efekt mají i mutace v kodonech dalších (59, 61, 117 a 146). Mutace v jiných kodonech jsou vzácné, nicméně i u některých z nich se předpokládá stejný efekt; jelikož tento efekt nebyl prokázán ve velkých studiích III. fáze, „evidence based medicine“ je jednoduše nebere v potaz. V současnosti se tedy všude ve světě před podáním cetuximabu nebo panitumumabu musí prokázat absence mutací ve shora uvedených kodonech genů KRAS a NRAS (obvykle zkráceně – a poněkud nepřesně, protože se nemá na mysli celý gen, ale jen ony vyjmenované kodony - wtRAS). Tuto analýzu v ČR provádějí z formolem fixovaného parafinového materiálu laboratoře molekulární patologie.

Mutace BRAF

BRAF je protoonkogen, patřící do rodiny RAF genů (ARAF, BRAF, CRAF) a v signální dráze následuje za RAS proteinem. Mutace v genu BRAF (nejčastěji jde o mutaci V600E) vedou ke konstitutivní aktivaci signální dráhy RAS-RAF-MAPK. U CRC se vyskytují v cca 10 - 15 % případů, u metastatického CRC však pouze u cca 5 % tumorů, což je způsobeno velmi silnou koincidencí BRAF mutace a defektního mismatch repair systému (dMMR), který je velmi silným příznivým prognostickým parametrem u lokalizovaného CRC. Mutace BRAF se dále vyskytují u melanomů, papilárního karcinomu štítné žlázy či serózních ovariálních karcinomů (18). Mutace BRAF a RAS jsou vzájemně exkluzivní, tj. v jedné nádorové buňce se nevyskytují společně (19,20). Je prokázáno, že v případě metastatického CRC je mutace BRAF silným negativním prognostickým faktorem (21,22). Prediktivní význam mutovaného BRAF genu zůstává - vzdor biologicky zjevné analogii s mutacemi v RAS genech - zatím nejasný, výsledky různých studií včetně meta-analýz jsou kontroverzní či nedosahují statistické signifikance (22-27). Na druhou stranu v těchto studiích dosahovali pacienti s mBRAF CRC, léčení pouze chemoterapií, výrazně horších výsledku v porovnání s wtBRAF tumory, což znovu prokazuje negativní prognostický význam této genetické změny. Kromě již zmíněného se ukazuje, že mutace BRAF jsou jedním z možných mechanizmů sekundární rezistence při léčbě anti-EGFR protilátkami (28,29). Podobně jako u RAS genů, ani u BRAF není zatím věnována významnější pozornost jiným mutacím než V600E, byť sporadické publikace se věnují např. mutacím v kodonech 594 a 596 (30,31). Jelikož existují selektivní inhibitory mutovaného BRAF proteinu, je nasnadě aplikovat tyto léky již používané u pokročilého melanomu také u CRC. Terapie vemurafenibem v monoterapii u metastatického CRC nepřináší - na rozdíl od melanomu - pozitivní výsledky (32). Studie I/II. fáze s kombinací BRAF inhibitoru dabrafenibu, MEK inhibitoru trametinibu a EGFR inhibitoru panitumumabu ukázala u mBRAF CRC mírně nadějné výsledky (26 % response rate), ale také vysokou toxicitu této kombinace, která často vedla k předčasnému ukončení léčby (33).

PIK3CA mutace

Fosfatidyl-inositol-3-kináza (PI3K) fosforyluje AKT a aktivuje AKT/mTOR dráhu (34). Aktivační mutace v katalytické subjednotce PI3CA se vyskytují u CRC asi v 10-20 % případů, a to zejména v exonu 9 (60-65 % mutací) a exonu 20 (20-25 % mutací). Prediktivní vliv na anti-EGFR terapii CRC není průkazný, publikované výsledky jsou rozporuplné, zdá se, že významné jsou v tomto smyslu pouze mutace v exonu 20 (26,35-37).

Ztráta funkce PTEN

PTEN (phosphatase and tensin homolog) je protein, který defosforylací PI3P inhibuje AKT dráhu. Ztráta funkce PTEN (geneticky či epigeneticky podmíněná a obvykle spojená s imunohistochemicky detekovatelnou ztrátou celého proteinu) aktivuje tuto signální cestu a je detekovatelná u 10 – 20 % CRC (26,34,38). Prediktivní význam pro terapii CRC je stále neprůkazný, je ale pravděpodobné, že ztráta PTEN je jedním z možných mechanizmů vzniku sekundární rezistence k anti-EGFR terapii (24,27,38).

Exprese EGFR ligandů

Vysoká exprese ligandů EGFR receptoru (zejména epiregulinu a amphiregulinu) nádorovými buňkami svědčí pro autokrinní stimulaci EGFR signální dráhy. Nádory s overexpresí uvedených EGFR ligandů mají významný benefit z léčby cetuximabem či panitumumabem ve srovnání s pacienty bez této overexprese (39,40).

Her-2 amplifikace

Amplifikace genu Her-2 se vyskytuje u 4 - 5 % CRC, typicky je exkluzivní s mutacemi RAS, BRAF a PIK3CA a je provázena overexpresí proteinu, analogicky s Her-2 pozitivními mammárními karcinomy. Tyto nádory velmi špatně odpovídají na anti-EGFR terapii, recentně ale byla prokázána velmi dobrá odpověď na duální blokádu Her-2 receptoru (trastuzumab + lapatinib). Šlo zatím o „proof of concept“ studii II. fáze, nicméně s velmi slibnými výsledky (41-44).

EGFR amplifikace

Zvýšený počet kopií genu EGFR v buňkách CRC byl opakovaně demonstrován jako mírně pozitivní prediktor odpovědi na anti-EGFR terapii, zejména u nádorů s wtKRAS. Problémem je, že každá práce stanovila jinou hranici nadlimitního počtu kopií genu (od 2,5 až po více než 6 kopií genu na jedno jádro). Jisté je to, že počet kopií nad 2,5 může znamenat buď vyšší proliferaci dané populace (více buněk prošlo S fází buněčného cyklu) nebo polysomii chromosomu 7 (či obecně aneuploidii) a nemusí tedy nutně souviset s EGFR signalizací a podílet se na nádorové transformaci. Procentní zastoupení skutečných amplifikací genu, hodnocených analogicky k Her-2 genu u karcinomu prsu, je nízké – uvádí se pod 10 %, spíše však půjde o jednotky procent. Na druhou stranu je nutno připustit, že někteří pacienti s EGFR amplifikovaným nádorem z malých publikovaných sestav dosáhli dlouhodobé či dokonce kompletní odpovědi. Otázka prediktivního významu zvýšeného počtu kopií či skutečné amplifikace genu EGFR ve vztahu k cílené léčbě je zatím stále nevyřešená (7,45,46).

DALŠÍ POTENCIÁLNÍ PREDIKTIVNÍ FAKTORY

V souvislosti s efektivitou anti-EGFR terapie jsou uváděny některé další faktory, např. mutace nádorového supresoru TP53 nebo alterace dalšího z tumor supresorových genů FBXW7 (F-box/WD repeat-containing protein 7), který kóduje protein uplatňující se v procesu ubikvitinace Cyclinu E, Notch a řady proteinových produktů významných protoonkogenů (MYC, JUN)(47,48). Rovněž zde hrají důležitou roli epigenetické mechanismy. MikroRNA (miRNA) jsou krátké, 18–25 nukleotidů dlouhé nekódující jednořetězcové RNA, které regulují expresi cílového genu na post-transkripční úrovni. Většinou tlumí translaci nebo zvyšují degradaci cílové mRNA, mohou však fungovat i jako aktivátory translace. Každá miRNA může regulovat řádově stovky cílových mRNA a v závislosti na buněčném kontextu může jedna miRNA vykonávat jak funkci onkogenu, tak nádorového supresoru. Bylo zjištěno, že EGFR signalizace je přímo regulována prostřednictvím miRNA a recentní práce dokonce ukazují na vztah mezi miRNA a senzitivitou k anti-EGFR terapii (49,50).U pacientů s wtRAS mCRC léčených cetuximabem byla prokázána signifikantní korelace mezi PFS a hladinou miR-31-3p a miR-31-5p. V práci na retrospektivním souboru 69 pacientů s wild type RAS mCRC léčených cetuximabem bylo prokázáno až 3,2násobně delší PFS u skupiny pacientů s nízkou hladinou miR-31-3p a miR-31-5p oproti skupině pacientů s vysokou hladinou miR-31-3p a miR-31-5p (51).

MOLEKULÁRNÍ KLASIFIKACE CRC

Dle výsledků celogenomových analýz 3 083 párových vzorků nádorových a normálních tkání realizovaných v rámci projektu TCGA (The Cancer Genome Atlas) napříč 27 rozdílnými druhy nádorů byl CRC v pořadí sedmou malignitou co do počtu detekovaných somatických mutací na jeden nádor (52). Vyšší počet mutací byl (vzestupně) detekován pouze u karcinomů jícnu, žaludku, močového měchýře, plicních nádorů (adenokarcinomu a spinocelulárního karcinomu) a ve vzorcích maligního melanomu. Komplexní TCGA molekulární analýza zaměřená konkrétně na CRC byla publikována o rok dříve (53). Na souboru 224 párových vzorků (nádorová + normální tkáň) bylo provedeno cílené exomové sekvenování, metylační analýza, analýza exprese mRNA a miRNA a u části pacientů (n = 97) dokonce i celogenomové sekvenování. Mutační analýza odhalila dvě zcela odlišné skupiny nádorů co do četnosti mutací na 1 případ CRC. Skupina tzv. „hypermutovaných nádorů“ (s mediánem 728 mutací na 1 nádor) tvořila cca 16 % celého souboru a zahrnovala především nádory s dMMR (v 63 % na podkladě hypermetylace promotoru genu MLH1 a ve 20 % na podkladě mutace některého MMR genu). Převažovaly tedy MSI-H nádory s klasickou fenotypovou charakteristikou (nízce diferencované, pravostranné, mucinózní nádory s typickou nádorovou infiltrací lymfocyty /TIL/). Druhá skupina tzv. „nehypermutovaných nádorů“ (s mediánem 58 mutací na 1 nádor) tvořila cca 84 % celého souboru a převažovaly v ní nádory s charakteristikami chromosomálně instabilních nádorů (CIN) s převažujícími mutacemi APC, TP53, KRAS atd. Fenotypově se jednalo zejména o konvenční kolorektální karcinomy pocházející z tubulárních a tubulovilózních adenomů, lokalizované predilekčně vlevo. Zajímavým zjištěním bylo, že u obou skupin nádorů byly mutovány stejné či velmi podobné komponenty centrálních signálních drah, pouze s odlišnou frekvencí. Byla vyslovena hypotéza, dle které v hypermutovaných nádorech dochází díky defektu opravného MMR systému k vysokému počtu mutací, které vedou k produkci aberantních proteinů. Tyto proteiny nádorová buňka následně prezentuje na svém povrchu jako neoantigeny, které jsou příčinou atrakce imunitních buněk, typické infiltrace nádoru lymfocyty a lokální aktivace imunitního systému. Tato aktivace imunity je následně zodpovědná za příznivou prognózu nádorů s MSI-H v lokalizovaném stadiu. Dalším pokrokem ve snaze o molekulární subklasifikaci CRC na jednotlivé podtypy dle genové exprese byla práce konsorcia CRCSC (Colorectal Cancer Subtyping Consortium) s názvem: „The consensus molecular subtypes of colorectal cancer“, jejíž pilotní data byla poprvé prezentována na konferenci ASCO v roce 2014, výsledky studie byly publikovány in extenso až v roce 2015 v časopisu Nature (54). Konsorcium sestávalo z 18 výzkumných skupin z celého světa, které v minulosti publikovaly originální práce definující na základě rozdílných genových profilů odlišné molekulární subtypy CRC (např. GEO, PETACC-3, TCGA a další). Podařilo se dát dohromady více než 4150 vzorků čerstvě zmražených nebo formalinem fixovaných nádorových tkání pocházejících od pacientů s CRC většinou II. (39 %) nebo III. (43 %) klinického stadia. Medián sledování byl 72 měsíců. Tyto práce definovaly celkem 6 klasifikačních systémů CRC, z nichž každý rozděloval CRC do 3–6 specifických subtypů. Problematické však bylo rozdílné zpracování dat, odlišné metody přípravy vzorků, nejednotné genové platformy atd. Výsledky byly diskrepantní, nalezené podobnosti spíše výjimečné (např. téměř vždy byla definována skupina nádorů s MSI-H). Každý z vyšetřovaných vzorků byl tedy v rámci výzkumu CRCSC podroben šesti různým analýzám podle šesti výše popsaných klasifikačních systémů. Následně byla provedena souhrnná integrativní analýza. Na základě podobných molekulárních znaků byly identifikovány 4 molekulární subtypy CRC (Consensus molecular subtype /CMS/ 1-4) plus skupina tzv. „nekonsenzuálních“ vzorků.

Podtyp CMS1 (14 %) zahrnuje převážně hypermutované nádory s MSI-H, mutací BRAF a známkami hypermetylace (CIMP-H). Typická je infiltrace nádorové tkáně lymfocyty a lokální aktivace imunitního systému. Tento podtyp se vyskytuje častěji u žen a starších pacientů a je obvykle lokalizován v pravostranném tračníku. Souhrnně se tedy jedná o skupinu CRC téměř identickou s hypermutovanými nádory dle TCGA, respektive s nádory MSI-H, vzniklými na podkladě „serrated“ cesty kancerogeneze.

Podtyp CMS2 (37 %) sdružuje epiteliální tumory především levostranného tračníku s charakteristikami mikrosatelitně stabilních (MSS), zato chromosomálně instabilních nádorů, typicky s mutací TP53 a s aktivací dráhy WNT/MYC. Jedná se tedy o skupinu v podstatě identickou s konvenčními CRC vzniklými cestou CIN.

Podtyp CMS3 (13 %) je tvořen epiteliálními nádory s mutací onkogenu KRAS a s heterogenním zastoupením CIN/MSI, charakteristická byla zvýšená exprese IGFBP2.

Podtyp CMS4 (23 %) tvoří nádory s mezenchymálními znaky a aktivací genů epiteliálně-mesenchymální tranzice (EMT). Vyskytuje se zejména u mladších pacientů, typická je aktivace drah TGFβ a VEGF, angiogeneze a stromální invaze.

Zbývajících 13 % tvoří dosud nezařazené nádory s variabilní epiteliálně-mezenchymální aktivací.

Uvedené molekulárně-biologické a morfologické charakteristiky byly následně korelovány s klinickými parametry. Při hodnocení přežití bez relapsu onemocnění (RFS) jednoznačně nejlepších výsledků dosahovali pacienti skupiny CMS1 (nádory MSI-H s mutací BRAF), nejhorší RFS měli pacienti s nádory skupiny CMS4 (s aktivací genů EMT, angiogenezí a stromální invazí). Oproti tomu však přežití po relapsu onemocnění bylo u pacientů s nádory skupiny CMS1 nejhorší (medián OS méně než 1 rok), nejlepší přežití vykazovali pacienti s nádory typu CMS2 (konvenční CRC) s mediánem OS více než 3 roky. Tyto výsledky potvrzují již známá fakta, že nádory MSI-H s mutací BRAF mají relativně dobrou prognózu ve stadiu II a III (způsobenou pravděpodobně lokální aktivací imunitního systému), jakmile však dojde k relapsu nebo diseminaci onemocnění, jejich prognóza se rapidně zhorší (55,56). Práce CRCSC popisuje dosud největší soubor vzorků CRC s molekulární anotací. Na základě podrobných sofistikovaných bioanalýz definuje 4 robustní molekulární subtypy CRC a tím dává základ pro novou molekulární taxonomii CRC. Nabízí se využití této klasifikace při přípravě nových klinických studií, případně při vývoji inovativních cílených léků.

KOMBINACE BIOMARKERŮ

Současná praxe indikace anti-EGFR protilátek v léčbě metastatického CRC striktně zohledňuje pouze markery, jejichž prediktivní hodnota byla prokázána ve velkých randomizovaných studiích III. fáze. To je v souladu s paradigmatem „evidence based medicine“ v onkologii, jež je však v poslední době, zejména ve vztahu k biologické cílené léčbě, stále více zpochybňováno a namísto toho je prosazována myšlenka „biomarker navigated“ terapie, lépe odrážející současné poznání biologie nádorů. Shora uvedené poznatky ukazují s větší či menší signifikancí, že k léčbě anti-EGFR protilátkami jsou nejcitlivější kolorektální karcinomy s přímou aktivací EGFR (amplifikací / overexpresí receptoru nebo autokrinní smyčkou s overexpresí ligandu) a současně s absencí jiné aktivační změny v EGFR signální dráze (RAS, BRAF, PIK3CA mutace, ztráta funkce PTEN, v širším smyslu i Her-2 amplifikace). Tento pohled potvrzují některé starší studie (27,57), které ukazují, že nádory bez mutací RAS, BRAF, PIK3CA a se zachovanou funkcí PTEN nejlépe odpovídají na biologickou léčbu. Metodika sekvenování nové generace umožňuje většinu popsaných změn snadno identifikovat v rámci jednoho vyšetření (multigenového panelu), a to bez znatelného navýšení nákladů. Otázkou je pak „pouze“ etický rozměr interpretace takového testu: je správné podat nebo nepodat léčbu při přítomnosti PIK3CA mutace? Sice se domníváme, že nádor bude rezistentní, ale protože to dosud nebylo prokázáno se statistickou signifikancí v „trojkové studii“, musíme považovat nádor za citlivý? Je to správný přístup? I když víme, že takovou „trojkovou studii“ už asi nikdo neprovede, protože studie, která by prokázala signifikanci u tak řídce se vyskytujících mutací by musela nabrat až desítky tisíc pacientů? Kromě toho motivace k provedení dalších klinických zkoušení je nízká, lék už byl schválen a „funguje!“... Na druhou stranu – kdo z nás v pozici pacienta by se právě s takovou argumentací nedožadoval podání léčby? Snad bude řešením vysoce individuální přístup, kdy budeme moci téměř v reálném čase monitorovat odezvu léčby vyšetřením cirkulující volné nádorové DNA a rychle měnit přístupy a střídat všemožné inhibitory podle mutací, aktuálně převládajících v léčené nádorové populaci. To zatím zní jako hudba budoucnosti, ale právě tento přístup se dnešním pohledem jeví jako nejefektivnější a snad také jako nejekonomičtější.

PODĚKOVÁNÍ

Podpořeno: MZ ČR – RVO (MOÚ, 00209-805), MŠMT – LM 2015089, MŠMT – LO 1413).

PROHLÁŠENÍ

Autor práce prohlašuje, že v souvislosti s tématem, vznikem a publikací tohoto článku není ve střetu zájmů a vznik ani publikace článku nebyly podpořeny žádnou farmaceutickou firmou. Toto prohlášení se týká i všech spoluautorů.

Adresa pro korespondenci:

MUDr. Pavel Fabian, Ph.D.

Masarykův onkologický ústav

656 53, Brno

tel: 543133400

email: fabian@mou.cz