ASCUS v atrofii

Cíl studie:
Vrchol výskytu karcinomu děložního hrdla předchází atrofii dlaždicového epitelu nastávající po menopauze. Část pozitivních nálezů však spadá i do tohoto období. Atrofie, zejména neúplně vyjádřená, vykazuje některé morfologické cytodiagnostické znaky blízké těm, jež jsou užívány v rozpoznání SIL, a to zejména tehdy, kdy v obraze navíc interferují v tomto období časté zánětlivé změny. Proliferační test jako obecně přijatý nástroj k objasnění nejasných nálezů znamená opakované vyšetření; studie je zaměřena na možnosti redukce jeho použití zařazením testu proliferační aktivity na sporných buněčných formacích.

Materiál:
Retrospektivní studie – rutinně hodnocené cytologické nátěry 22 pacientek. Jedenadvacet z nich bylo perimenopauzálních a menopauzálních; jejich nálezy byly 16krát nejisté (ASCUS, popř. ASC-US, ASC-H v některé z obou verzí Bethesda klasifikace, tj. ASCUS různého typu v atrofii), 4krát SIL v atrofii s následnou histologií a 1krát atrofie s negativním cytologickým nálezem. Jedenkrát se jednalo o H SIL u mladší pacientky bez atrofie. Celkově bylo revidováno 60 cytologických vyšetření, protože řada pacientek byla s dg. ASCUS vyšetřena cytologicky opakovaně.

Metoda:
V archivačním systému obrazové analýzy LUCIA Net (Laboratory Imaging, Praha) byly uloženy minimálně tři obrázky s diagnosticky významnými záběry. Následně byly preparáty rozmontovány, odbarveny a podrobeny imunocytochemickému průkazu proliferační aktivity s protilátkou Ki-67, klon MIB 1 (v textu dále MIB 1). Výsledky byly opět archivovány v systému LUCIA Net.

Vyhodnocení pozitivit bylo provedeno ve čtyřstupňové škále:


1. zcela negativní formace – neg.; 2. ojedinělé pozitivity – x; 3. řídce disperzní pozitivity (méně než 1/3 buněk) – xx; 4. hustě disperzní pozitivity (více než 1/3 buněk) – xxx.

Výsledky:
Postup poskytl většinou hodnotitelný výsledek. Archivace před a po imunocytochemickém došetření umožnila porovnání polychromaticky barvených preparátů a MIB l. Pacientky s prokázanou SIL vykazovaly přítomnost MIB 1 pozitivních buněk ve skupinách stupňů 2. až 4. (4/5). Pozitivity řídce disperzní (skupina 3) byly nejčastěji (6krát) zjištěny u kompaktních shluků vzhledu nezralé metaplazie. U těchto pacientek jsme zaznamenali následně ústup cytologického nálezu. U pacientek, které měly pouze ojedinělé MIB 1 pozitivity (skupina 2), docházelo častěji (4/7) k ústupu nálezu . Nicméně tento stupeň pozitivity vykazovaly i dva nálezy s histologicky ověřenou CIN.

Variabilitu průkazu MIB 1 jsme zaznamenali i v histologické úrovni. Cytologická přehlednost suspektních buněčných trsů v terénu zánětlivých změn MOP III se v průkazu MIB 1 po odbarvení zřetelně zlepšila. Vytvořili jsme algoritmus zařazení testu proliferační aktivity u nejistých atrofických obrazů. Soudíme, že se jej vyplatí zařadit u nálezů ASC-H v atrofii. Pokud bude pozitivita suspektních buněčných skupin silná, je to důvodem k bioptickému došetření. Slabé a střední pozitivity jsou kandidáty pro E-test a kontrolu po půl roce.

Klíčová slova:
cervikální cytologie – atrofie – ASCUS – ASC-H v atrofii – estrogenní test – proliferační aktivita – Ki-67 MIB1 pozitivita

Detekce přednádorových stavů skvamózních intraepitelových lézí – SIL (viz seznam zkratek na konci článku) v dlaždicovém epitelu děložního hrdla představuje významný prvek v úsilí o snížení výskytu rozvinutých forem karcinomů této lokalizace. I když vrchol výskytu karcinomu děložního hrdla předchází atrofii dlaždicového epitelu nastávající po menopauze, část pozitivních nálezů spadá právě do tohoto období (14, 18, 24). Rozvíjející se atrofie – po delší či kratší dobu v perimenopauzálním období neúplně vyjádřená – přitom vykazuje některé morfologické cytodiagnostické znaky blízké těm, jež jsou užívány v rozpoznání SIL, a to zejména tehdy, kdy v obraze navíc interferují zánětlivé změny, které jsou v tomto období časté (1, 2). Hodnocení gynekologických stěrů pacientek s částečnou atrofií je vnímáno jako obtížné (21) a zatížené falešně pozitivními nálezy, jež odrážejí obavu z podhodnocení nejasného obrazu.

V cytopatologické literatuře se tato problematika objevuje intermitentně. Publikované soubory zdůrazňují vyšší podíl ASCUS nálezů zejména v neúplných atrofiích (14). V obou verzích Bethesda klasifikace (TBS 1991, TBS 2001), se část atrofických stěrů ocitá v kategorii méně závažných typů ASCUS. V TBS 1991 ASCUS vs. reaktivní, ASCUS možná L SIL představují typy změn, jež byly v TBS 2001 početně redukovány. Nicméně projevy nejasných změn s poruchou maturace vlivem nedostatku estrogenů charakteru dříve ASCUS-H a nyní ASC-H jsou změnou klasifikace dotčeny minimálně. Všechny současné učebnice (6, 10, 17, 26) se shodují v užitečnosti vyzrávacího testu – krátkodobé lokální aplikace estrogenů k ozřejmění nejasných cytologických nálezů (13, 15). I tato relativně nenáročná procedura znamená ovšem opakované vyšetření pacientky staršího věku, které je do jisté míry obtěžující, má určité ekonomické náklady a konečně i vlastní metodické limity. Ze všech těchto důvodů se pozornost zaměřuje na možnosti získat více informace z materiálu pořízeného již prvním odběrem. Pomocnou metodou použitelnou již v první době je určení proliferační aktivity atypických hyperchromních trsů, jež jsou častým cytomorfologickým nálezem pro dg. ASC-H. Postup lze bez problémů použít na LBC materiálu. Z ekonomických důvodů však tato metoda není ve většině zemí včetně ČR dostupná v širokém populačním měřítku. Pozornost jsme proto zaměřili na možnost využití základního získaného klasického stěru. Proliferační aktivitu v histopatologickém materiálu hodnotíme rutinně v široké řadě zejména onkologických diagnostických situací; používaná protilátka MIB 1 (DAKO) s vizualizací značenou streptavidin-biotinovou koncovkou (LSAB) s vyvoláním DAB poskytuje v našich laboratořích konstantně dobré výsledky. V souladu s publikovanými zprávami o obdobných průkazech ze skandinávských pracovišť (8, 11) jsme se rozhodli ověřit si použitelnost tohoto postupu. V případě předpokládaného přínosu potom definovat užitečnost vřazení testu proliferační aktivity do diagnostického a sledovacího algoritmu.

Materiál a metoda

Materiál retrospektivní studie představovaly rutinně hodnocené cytologické nátěry 22 pacientek. Jedenadvacet z nich bylo perimenopauzálních a menopauzálních; jejich nálezy byly 16krát nejisté (ASCUS, popř. ASC-US, ASC-H v některé z obou verzí Bethesda klasifikace, tj. ASCUS různého typu v atrofii), 4krát SIL v atrofii s následnou histologií a 1krát atrofie s negativním cytologickým nálezem. Jedenkrát se jednalo H SIL u mladší pacientky bez atrofie. Celkově bylo revidováno 60 cytologických vyšetření, protože řada pacientek byla s dg. ASCUS vyšetřena cytologicky opakovaně. Po doporučeném vyzrávacím testu (ne vždy na následném vyšetření uvedeném) byly další nálezy v kategorii benigních buněčných změn (NILM). Preparáty byly v souladu s přijatými standardy EFCS/QUATE základně barveny polychromem a montovány krycím sklem.

Vzhledem k okolnosti, že standard gynekologického cytologického vyšetření převzatý oběma zainteresovanými odbornými společnostmi (Společností českých patologů ČLS JEP a Společností klinické cytologie ČLS JEP) ze standardů evropských (UICC) ukládá archivaci tohoto unikátního materiálu (EFCS/QUATE), pořídili jsme v archivačním systému obrazové analýzy LUCIA Net (Laboratory Imaging, Praha) minimálně tři obrázky s diagnosticky významnými záběry dále zpracovávaných nátěrů. Následně byly dokumentované preparáty rozmontovány, odbarveny a podrobeny imunocytochemickému průkazu proliferační aktivity s protilátkou Ki- 67, klon MIB 1 firmy DAKO. Primární protilátka byla použita v ředění 1 : 50, inkubace 70 minut při pokojové teplotě. Detekce provedena systémem  DAKO Cytomation  LSAB^TM + HRP. Vizualizace diaminobenzidinem (DAB – 5 minut). Jádra dobarvena Harrisovým hematoxylinem – 30 sekund. Výsledky byly opět archivovány v systému LUCIA Net.

Vyhodnocení pozitivit jsme prováděli ve čtyřstupňové škále:

• zcela negativní formace – neg.
• ojedinělé pozitivity – x
• řídce disperzní pozitivity (méně než 1/3 buněk) – xx
• hustě disperzní pozitivity (více než 1/3 buněk) – xxx

Výsledky

Jak při archivaci obrazů z preparátů barevných polychromem, tak následně při hodnocení a dokumentaci proliferační aktivity jsme se soustředili na diagnostické buněčné formace, které byly podkladem pro dg. ASCUS. V naprosté většině se jednalo o kompaktní buněčné formace s vyšším nukleoplazmovým poměrem, hyperchromazií či anizokaryózou. Méně často se jednalo o izolované atypické buňky se zvětšenými jádry, popř. vzhledu dyskeratocytů. Přehled pacientek dle věku, vstupní cytologické diagnózy a semikvantitativního zhodnocení pozitivity MIB 1 podává tabulka 1; bioptické došetření je k dispozici pouze u 7 z nich.

V technologické úrovni jsme si ověřili proveditelnost postupu na preparátech, které byly montovány krycími skly. Sejmutí krycího skla, odbarvení a provedení imunocytochemické reakce na předtím vymezeném úseku bylo proveditelné i na déle (v naší studii maximálně 2 roky) montovaných preparátech.

Vyhodnocení nebylo možné v jediném případě, kdy po reakci byl nátěr velmi málo buněčný.

Pořízená obrazová databáze umožňovala porovnání nálezů v polychromatickém barvení s následným průkazem MIB.

Naše pacientky s prokázanou SIL vykazovaly přítomnost MIB 1 pozitivních buněk ve skupinách stupňů 2–4 (4/5). Zjištěná histologická pozitivita byla zpravidla o stupeň vyšší (obr. 1 a-d, pac. č. 1).

Vysoká pozitivita MIB 1 (xxx – obr. 2 a-b ) byla nalezena u dvou pacientek s ASC-H ze základní cytologie; u jedné následovala negativní biopsie z endocervixu s minimem materiálu, u další zatím není biopsie provedena. Došetření jejich nálezu jsme doporučili.

Pozitivity řídce disperzní (skupina 3 – xx) byly častěji (6krát) zjištěny u kompaktních shluků vzhledu nezralé metaplazie (obr. 3). U těchto pacientek jsme zaznamenali následně ústup cytologického nálezu. Ojediněle byla taková pozitivita zjištěna i u negativní kontrolní pacientky s dg. prosté atrofie (bez ASCUS nálezu). Histologicky (hysterektomie pro ca endometria) byl zachycen okrsek nezralé metaplazie v transformační zóně.

U pacientek, které měly pouze ojedinělé MIB 1 pozitivity, docházelo častěji (4/7) k ústupu nálezu. Nicméně tento stupeň pozitivity doprovázel i dva nálezy s histologicky ověřenou CIN.

Průkaz MIB1 vykazoval v histologickém preparátu pacientky s lézí CIN II, CIN III ložiskovou variabilitu (obr. 4).

Nátěr 65leté pacientky limitovaný pro hodnocení v polychromatickém barvení nepřehledností danou nečistým pozadím v terénu zánětlivých změn MOP III, který vykazoval přítomnost suspektních buněčných trsů, byl v průkazu MIB 1 po odbarvení zřetelně přehlednější. Mohl být vyhodnocen v kategorii NILM s větší jistotou nejen pro nízkou pozitivitu MIB 1, ale i pro lépe hodnotitelnou cytomorfologii buněk (obr. 5a-d).

Diskuse

Vstupní předpoklad, že by došetření proliferační aktivity v cytologických stěrech s různým stupněm atrofie mohlo pomoci v řešení nejasných obrazů, nás vedl v prvé řadě k podrobnějšímu studiu literatury o atrofických stěrech a jejich diagnostických úskalích studovaných ve velkých sestavách.

Okolnost, že atrofické stěry jsou zatíženy větším počtem nejasných nálezů ověřili na sestavě 11323 pacientek Keating a Wang (14). Poměr ASCUS k následným SIL byl v jejich souboru 2,2 pro premenopauzální pacientky, 7,5 pro perimenopauzální (v této skupině je nejvyšší zastoupení částečných atrofií) a 4,1 pro postmenopauzální. Z uvedených koeficientů vyvozují nízkou výpovědní hodnotu nálezu ASCUS pro peri- a postmenopauzální období. Úlohu kolposkopického a opakovaného cytologického vyšetření při nálezu atypických buněk v postmenopauze hodnotili Kaminski et al. (12). Dospěli ke stejnému závěru nižší incidence skutečných lézí. V naší realitě je kolposkopie (i když většinou nikoli „expertní“) součástí vyšetření při odběru gynekologické cytologie. Transformační zóna však u postmenopauzální ženy je většinou mimo její dosah. Saminathan et al. (20) revizí 60 nátěrů pacientek přeřadili 15 (25 %) do benigní kategorie cervicitis. Poukazují rovněž na interferenci artefaktů, jimiž jsou atrofické stěry zatíženy větší měrou. Acs et al. (4) naopak v sestavě 228 postmenopauzálních pacientek s atypickými nálezy jak na žlázových (AGS), tak na dlaždicových buňkách (ASCUS, SIL) a vysokým procentem histologických došetření ověřili u došetřených pacientek poměrně vysokou incidenci lézí (celkem 45 % AGS nálezů bylo sledováno histologicky potvrzenou žlázovou nebo dlaždicovou dysplazií; u atypických nálezů ASCUS a SIL šlo o více než 30 %) – s pozorovatelnou tendencí k nadhodnocení L SIL za H SIL. Z toho vyvozují nutnost věnovat zvýšenou pozornost těmto obtížně hodnotitelným obrazům – po vyloučení artefaktů (často s pomocí vyzrávacího testu). Otázce diagnóz ASCUS podmíněných artefakty (zejména z vysýchání) a atrofiemi se ve své studii zabývají i Cenci a Vecchione (9). Povahu velkých modravých kulovitých útvarů volně ležících v pozadí atrofických stěrů a imitujících atypická holá jádra (tzv. „blue blobs“) jakožto regresivně změněných buněčných zbytků parabazálních a dolních intermediárních buněk objasnili imunocytochemickými studiemi a elektronovou mikroskopií Abdulla et al. (3). Valente et al. (25) porovnávali cytologické obrazy pacientek užívajících medroxyprogesteronacetát. V následném útlumu maturace se sníženým vyzrávacím indexem pozorovali u pětiny pacientek abnormální obrazy (ASCUS, ale i falešné pozitivity H SIL následně nepotvrzené dalšími stěry a biopsií). Podklad pro tato nadhodnocení identifikovali ve vyšším relativním zastoupení hyperchromních parabazálních buněk, obdobně jako je tomu v postpartuálních a atrofických stěrech (5). Kir et al. (16) se nověji zabývají rizikem HG léze u pacientek s dg. L SIL. V sestavě více než 20 000 vyšetření nalezli 3 z 27 pacientek se závěrem L SIL s následnou histologickou diagnózou CIN2-3, a dokonce osm ze 13 pacientek s dg. CIN2-3, která následovala po cytologickém závěru LASC-H (= LSIL +ASC-H buňky). Prosazují uznání této nově pojmenované kategorie, která je (i v postmenopauzálních stěrech) v praxi někdy bez zřetelného vymezení v TBS systému používána. Revizí 100 histologicky ověřených nálezů pacientek s dg. různých typů ASCUS při úplném vyřazení této dg. nebo její restrikci prokázali Pitman et al. (19) nezbytnost zachování kategorie ASCUS pro udržení citlivosti PAP – testu. Užitečnost této kategorie potvrzuje i studie Selvaggiho (21) v LBC materiálu. Z více než 9000 testů tato dg. stanovená u 25 pacientek vedla v následné bioptické verifikaci 2krát k ekvivalentu L SIL a 15krát H SIL.

Abati et al. (1, 2) ve své sestavě 90 pacientek vyšetřených před a po aplikaci vyzrávacího testu zdůrazňují, že pouhé relativní zvětšení jádra není dostatečným cytodiagnostickým znakem dysplazie v atrofii. Spolehlivějšími ukazateli byly v jejich sestavě hyperchromazie jader spolu s nepravidelnými konturami jádra. Ty však mohou v estrogen-deficitních situacích být i odrazem regresivních buněčných změn.

Studii jsme podnikli k ověření proveditelnosti, výpovědní hodnoty a v případě pozitivního vyznění pilotní studie k vypracování indikačního a vyhodnocovacího algoritmu testu proliferační aktivity.

Pracovní hypotéza vycházela z poměrně častého zpětně ověřeného nadhodnocení nálezu před použitím vyzrávacího testu, s předpokládaným výsledkem snížení častosti jeho indikace, popř. v řešení nejasných nálezů (zejména ASC-H).

I když na klasicky montovaných nátěrech se v naprosté většině případů podaří pečlivou laboratorní prací hodnotitelný průkaz získat, uvedený výčet nálezů potvrzuje vstupní předpoklad, že průkaz proliferační aktivity na odbarvených preparátech rozhodně není jednoduchým řešením problému ASCUS v atrofii.

Tak jako u všech imunohistochemických a imunocytochemických testů je nutno v interpretaci uvažovat o možnosti falešné negativity (ztráty některých buněčných formací v průběhu imunocytochemické procedury) a věnovat pozornost odpovídající interpretaci zjištěných pozitivit. V praxi to v případě protilátky MIB znamená v materiálu gynekologického cytologického stěru z peri- nebo postmenopauzálního období věnovat pozornost regresivně změněným buňkám, jež mohou pyknózou a následnou hyperchromazií jaderného chromatinu napodobovat buňky atypické. Již samotný instrukční list dodávaný s protilátkou MIB 1 firmou DAKO upozorňuje na riziko falešných pozitivit na narušených buňkách. Okolnost, že regresivně změněné buňky s alarmujícími cytomorfologickými znaky zpravidla vymizí z cytologického obrazu po lokálním podání estrogenů, je podkladem praktické užitečnosti vyzrávacího testu. Zčásti se tento efekt týká i nezralé metaplazie. Vyšetření proliferační aktivity zde napomůže zjistit, zda jde o proliferaci pravidelnou, s tendencí k vyzrávání, či atypickou, s přítomností pozitivit ve všech vrstvách skvamózních epitelových formací (i cytologických, nejen histologických), případně s doprovodnými morfologickými znaky atypické nezralé metaplazie. Ojedinělá publikovaná sdělení dokládají vysokou užitečnost ověření proliferační aktivity pro redukci falešně pozitivních nálezů a indikací vyzrávacího estrogenního testu (8, 9). Jeho využití v diagnostice glandulárních lézí testovali Boon et al. (7).

V naší úvodní zkušenosti jsme si ověřili, že vyhodnocení musí striktně respektovat pravidlo zachovalých buněk a vylučovat jednotlivé buňky s projevy možných regresivních změn. To je možná důvodem, proč jsou sdělení o použití tohoto testu zatím v literatuře ojedinělá. Při převaze PAP testů klasickou cytologií (oproti nověji prosazované LBC) může hrát roli i otázka montování preparátů – umělé médium je levnější, avšak jeho sejmutí a odbarvení není snadno proveditelné.

Na otázku, zda a za jakých okolností má toto technicky vcelku proveditelné vyšetření smysl, jsme zhodnocením prvních zkušeností dospěli k závěru, že jeho praktické využití je v oblasti atypických atrofických obrazů omezené. Nepovažujeme je za indikované při nálezu ASC US, při němž je v případě negativního kolposkopického nálezu riziko existence prekancerózy velmi malé. Zde je nepochybně postačující kratší kontrolní interval 6–12 měsíců.

Může však mít určitou výpovědní hodnotu pro modifikaci klinicko-morfologického vyšetřovacího algoritmu pacientek s atrofickým obrazem vykazujícím znaky ASC-H popř. H SIL v atrofii v polychromatickém preparátu. V takovém případě doporučujeme archivaci obrazu suspektních diagnostických buněčných shluků a MIB 1 test na odbarveném preparátu. Pokud bude pozitivita suspektních buněčných skupin silná, je to důvodem k bioptickému došetření. Slabé a střední pozitivity jsou kandidáty pro E-test a kontrolu po půl roce.

Vzhledem k nízkému výskytu lézí v perimenopauzálním a postmenopauzálním období není jednoduché propojení hledisek etických (maximální bezpečí pacientky s atypickým cytologickým obrazem v částečné nebo úplné atrofii; narušení psychologického komfortu doplňujícími vyšetřeními a častějšími kontrolami) a ekonomických. Nicméně jak naše rozsahem limitovaná studie, tak kritické oponentní práce většího rozsahu prokázaly možnost falešné negativity MIB 1 jak v cytologickém, tak histologickém obraze těžké dysplazie (23). Vykládají ji vlivem buď nedostatečné fixace, nebo existencí nízce proliferujících buněčných klonů s výraznými dysplastickými cytologickými rysy, jejichž existence vysvětlí známou skutečnost mírného klinického průběhu části těžkých dysplazií.

Na druhé straně i v atrofickém terénu dochází k (zpočátku nezralé a někdy atypické) metaplazii a regeneraci epitelu s vystupňovanou proliferační aktivitou.

Závěrem lze tedy říci, že naše limitovaná studie a kritické zhodnocení dostupné literatury ohledně významu doplňujícího vyšetření proliferační aktivity s protilátkou MIB 1 na odbarvených polychromatických nátěrech nás řadí do skupiny spíše rezervovaných autorů. V této aplikaci se jedná o pomocnou reakci s omezeným potenciálem, nikoli o nástroj pravidelně usnadňující rozhodnutí v případě možné závažné diagnózy ASC-H v atrofii.

Seznam zkratek

AGS – Atypical Glandular Cells

ASCUS – Atypical Squamous Cells not otherwise specified

ASCUS H – Atypical Squamous Cells of Uncertain Significance, can not exclude high-grade squamous intraepithelial lesion

ASC-H – Atypical Squamous Cells, can not exclude a high-grade squamous intraepithelial lesion

ASCUS L – Atypical Squamous Cells of Uncertain Significance suggestive of L SIL

ASC US – Atypical Squamous Cells of Uncertain Significance

H SIL – High Grade Squamous Intraepithelial Lesion

LSAB – Labelled StreptAvidin-Biotin

LBC – Liquid Based Cytology

L SIL – Low Grade Squamous Intraepithelial Lesion

LUCIA – Laboratory Universal Computer Image Analysis

EFCS/QUATE  – European Federation of Cytology Societies, Committee for Quality Assurance, Training and Education

NILM – Negative for Intraepithelial Lesion or Malignancy (Bethesda 2001)

TBS – The Bethesda System 1991, 2001 …. verze klasifikací nálezů v cytologii cervixu 

Doc. MUDr. J. Dušková, CSc., FIAC

Ústav patologie 1.LF UK

Studničkova 2

128 00 Praha 2

e-mail: jaroslava.duskova@lf1.cuni.cz