Stanovení nabumetonu a kyseliny 6‑methoxy-2-naftyloctové v plazmě pomocí HPLC s UV a MS detekcí

Cílem práce bylo zavést a validovat analytickou metodu, která by umožnila detekovat koncentrace nabumetonu a kyseliny 6-methoxy-2-naftyloctové (6-MNA) po jednorázovém podání terapeutické dávky léčiva. Byly porovnány dvě metody stanovení pomocí HPLC s UV a hmotnostní detekcí. Při úpravě vzorku bylo optimálních výsledků dosaženo pomocí extrakce na pevné fázi (SPE). Výtěžnost se pohybovala okolo 84 % pro nabumeton a 86–90 % pro 6-MNA. HPLC separace analytů byla prováděna na reverzní C18 koloně. Limit UV detekce pro 6-MNA byl 50 nM, pro nabumeton 0,1 μM. Limit MS detekce pro 6-MNA činil 1 μM, pro nabumeton 0,5 μM. Přesnost metody pro stanovení nabumetonu se pohybovala v rozmezí 4,2–14,4 % při UV detekci a 4,6–8,5 % při MS detekci. Přesnost metody pro 6-MNA byla 2,4–12,5% při UV detekci a 2,1–9,4 % při MS detekci. Správnost metody pro stanovení nabumetonu se pohybovala v rozmezí 93,4–109,6 % při UV detekci a 86,2–107,9 % při MS detekci. Správnost metody pro 6-MNA byla 87,8–107,4 % při UV detekci a 86,3–106,4 % při MS detekci. Vhodnost metody byla ověřená na vzorcích pro stanovení farmakokinetiky léčiva u 24 zdravých dobrovolníků.

Klíčová slova:
nabumeton – farmakokinetika – kyselina 6-methoxy-2-naftyloctová – HPLC – LC/MS

Úvod

Nabumeton (4-(6-methoxy-2-naftyl)-butan-2-on) patří mezi nesteroidní protizánětlivé látky vykazující preferenční inhibici cyklooxygenázy 2 ¹⁾. Je používán v léčbě akutních i chronických symptomů revmatoidní artritidy a osteoartrózy ^{2, 3)}. Nabumeton je proléčivo, které nevykazuje protizánětlivou aktivitu, zatímco jeho hlavní metabolit kyselina 6-methoxy-2-naftyloctová (6-MNA) vykazuje farmakodynamické účinky antiflogistické, antipyretické a analgetické.

Přestože jsou klinické účinky nabumetonu dobře popsány, farmakokinetika nabumetonu dosud podrobněji popsána nebyla kvůli příliš nízkým koncentracím mateřské látky v krvi po podání terapeutických dávek. Z důvodu nízkých hladin nabumetonu v krvi je dosud publikována jen jedna metoda HPLC s fluorimetrickou detekcí nabumetonu pro použití v klinických studiích ⁴⁾. Dobře je naopak popsána farmakokinetika 6-MNA díky dostupnosti dostatečně citlivých analytických technik ^5–9).

Cílem naší práce bylo zavést a validovat analytickou metodu, která by umožnila detekovat koncentrace nabumetonu a 6-MNA po jednorázovém podání terapeutické dávky léčiva.  

Pokusná část 

Chemikálie

Nabumeton p.a. (Sigma-Aldrich), 6-MNA p.a. (MP Biomedicals), naproxen 98% (Sigma-Aldrich), methanol pro HPLC (Lach-Ner), aceton p.a. (Merck), propan-2-ol p.a. (Lach-Ner) kyselina o-fosforečná 85% (Merck), fosforečnan sodný terciární čistý (Lachema), acetonitril pro HPLC (Lach-Ner), kyselina trifluorooctová 99% (Sigma-Aldrich), deionizovaná voda (Millipore), dusík 4.6 (Linde Gas), helium 4.6 (Linde Gas).

Příprava vzorků

Vzorky krve jsme odebírali do zkumavek Vacutainer s přídavkem heparinu. Ihned po odebrání krve jsme oddělili plasmu centrifugací při 3000 g. Plasma byla poté uložena do -70 °C až do doby analýzy.

Pro předúpravu vzorků jsme zvolili techniku extrakce na tuhou fázi (SPE). K 0,5 ml vzorku jsme přidali 50 μl roztoku vnitřního standardu o koncentraci 0,1 mmol/l. Vzorek jsme naředili 0,5 ml fosfátového pufru pH 2 (10 mM), okyselili 50 μl 10% kyseliny fosforečné a řádně promíchali.

Takto připravený vzorek jsme aplikovali na kolonku Discovery^® DSC-18 (1 ml, 100 mg), Supelco, USA předem promytou 2 ml methanolu a 2 ml fosfátového pufru pH 2 (10 mM). Všechny roztoky protekly rychlostí 1 ml.min^-1.

Následně jsme kolonku prosávali vzduchem po dobu 5 minut. Zachycené látky byly vymyty 2 ml methanolu. Získaný extrakt jsme odpařili dosucha při 45 °C pod mírným proudem dusíku. Reziduum jsme poté rozpustili ve 250 μl mobilní fáze a 30 μl nastříkli do HPLC.

HPLC/UV/MS analýza

Pro analýzu extraktu jsme použili kapalinový chromatograf HP 1100 s UV DAD, Hewlett Packard, USA. Jako hmotnostní detektor jsme použili přístroj Esquire 3000, Bruker Daltonics, Německo.

Separace probíhala na koloně Supelcosil LC-18 15 cm × 4,6 mm 5 μm, Supelco, USA a jako mobilní fázi jsme použili směs acetonitrilu a 0,1% TFA v poměru 50 : 50 (v/v) o průtokové rychlosti 0,3 ml.min^-1.

UV detekce proběhla při vlnové délce absorpčního maxima sledovaných látek λ = 230 nm. Současně jsme sledovali i hmotnostní detekci s chemickou ionizací za atmosférického tlaku v pozitivním módu. Podmínky APCI detekce byly následující: rozsah skenu 50–800 u, teplota sušícího plynu 250 °C, teplota iontového zdroje 400 °C, tlak plynu v zamlžovači 30 psi, průtok sušícího plynu (N2) 5 l.min^-1, napětí na kapiláře 4 kV.

Vyhodnocení jsme provedli podle chromatogramu náležejícího nejintenzivnějšímu iontu ve spektru příslušné látky. Pro 6-MNA a nabumeton to byl ion m/z 171 a pro vnitřní standard – naproxen ion m/z 185.

Validace metody

Validaci metody jsme provedli na základě požadavků pro validaci bioanalytických metod ¹⁰⁾. V souladu s těmito požadavky jsme stanovili mez stanovitelnosti (LLOQ), správnost, přesnost, výtěžnost, linearitu a selektivitu detekce.

Pro nabumeton i 6-MNA byly sestrojeny kalibrační křivky. Vzorky o známé koncentraci s přídavkem vnitřního standardu byly zpracovány SPE a dále analyzovány pomocí HPLC s UV a MS detekcí. Pro 6-MNA byly připraveny roztoky o těchto koncentracích: 0,2; 0,5; 1; 2; 5; 10; 20; 50 a 100 μmol/l pro nabumeton 0,2; 0,5; 1; 2; 5; 10 a 20 μmol/l.

Mez stanovitelnosti jsme určili jako nejnižší bod kalibrační křivky, kde pík analytu je indentifikovatelný, oddělený a reprodukovatelný s přesností 20 % a správností 80–120 %.

Součástí validace metody bylo také studium stability zásobních roztoků a vzorků. V případě zásobních roztoků analytů a vnitřního standardu jsme měřili koncentrace látek přítomných ve vzorku v závislosti na čase u skladovaných roztoků po nástřiku 5 μl zásobního roztoku. Detekční podmínky byly shodné s podmínkymi při měření extraktů z plazmy. První měření proběhlo ihned po jejich přípravě.

Dále jsme sledovali vliv zmrazení a roztátí vzorků v několika cyklech na koncentraci analytů ve vzorku. Vzorky o vysoké a nízké koncentraci analytů (množství dostatečné pro tři analýzy na koncentraci, pro 6-MNA 1 a 50 μM; pro nabumeton 0,5 a 10 μM) jsme skladovali při teplotě -70 °C po dobu 24 hodin. Poté roztály při laboratorní teplotě a následně byly znovu zmraženy. Tento postup jsme opakovali a po čtvrtém cyklu roztátí vzorků jsme provedli analýzu.

Pro studium krátkodobé teplotní stability jsme připravili vzorky o vysoké a nízké koncentraci (pro 6-MNA 1 a 50 μM; pro nabumeton 0,5 a 10 μM, tři alikvoty od každé). Vzorky byly ponechány při laboratorní teplotě 6 hodin a následně zpracovány.

Pro stanovení dlouhodobé teplotní stability vzorků jsme připravili vzorky o vysoké a nízké koncentraci analytů (pro 6-MNA 1 a 50 μM; pro nabumeton 0,5 a 10 μM). Vzorky jsme uchovávali při teplotě -70 °C a v časových intervalech je analyzovali ve třech stanoveních v každé koncentraci.

Reprodukovatelnost metody jsme zhodnotili na základě výsledků analýz kontrolních vzorků, které jsme provedli v průběhu pěti týdnů. Celkem jsme analyzovali deset sérií po třech koncentracích (nízké, střední a vysoké) pro oba analyty. 6-MNA byla sledována na koncentračních úrovních 1; 10 a 50 μM, nabumeton pak v koncentracích 0,5; 2 a 10 μM.

Aplikace metody

Metodu jsme následně použili na stanovení farmakokinetických parametrů nabumetonu a 6-MNA u 24 zdravých dobrovolníků po podání 500 mg nabumetonu (Relifex, MEDA AB Švédsko). Zdraví dobrovolníci byli po vstupním fyzikálním, biochemickém a hematologickém vyšetření krátkodobě hospitalizováni na našem oddělení. Během hospitalizace dostal každý dobrovolník jednorázovou dávku přípravku Relifex s 250 ml vody na zapití. Podání léčiva probíhalo vždy v ranních hodinách pod dohledem zdravotní sestry. Po dobu studie měli dobrovolníci volný přístup k pitné vodě ad libitum. První lehké standardizované jídlo bylo podáváno za 4 hodiny od podání nabumetonu. Odběry jsme prováděli v čase před podáním léčiva a 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 48, 72 a 96 hodin po podání léku. Tato studie byla schválena Etickou komisí VFN a všichni dobrovolníci podepsali informovaný souhlas před zařazením do studie.  

Výsledky a diskuze 

Optimalizace metody

HPLC separace analytů proběhla na reverzní C18 koloně. Testovali jsme mobilní fáze o složení acetonitril/voda a acetonitril/0,1% TFA. Chromatografická separace byla ve všech případech provedena isokratickou eluční technikou.

Jako výchozí bod jsme zvolili mobilní fázi acetonitril : voda 50 : 50 (v/v), kdy jsme pozorovali dobrou separaci analytů a vnitřního standardu. Zjistili jsme, že rostoucí průtoková rychlost měla negativní vliv na symetrii píků a odezva MS detekce (výška píku) při překročení průtoku 0,3 ml.min^-1 klesala.

Při použití mobilní fáze acetonitril: 0,1% TFA v poměru 50 : 50 (v/v) došlo k očekávanému vylepšení symetrie píků a k navýšení signálu MS, nicméně při překročení průtokové rychlosti 0,3 ml.min^-1 i za těchto podmínek účinnost ionizace MS klesala.

Vyšší obsah acetonitrilu vedl ke snížení retence a zhoršení symetrie píků. Odezva MS při obsahu acetonitrilu 50 % a více setrvávala na přibližně konstantní úrovni. Pro další práci jsme zvolili poměr acetonitril : 0,1% TFA 50 : 50 (v/v).

MS detekce

Současné požadavky na validaci bioanalytických metod vyžadují průkaz nepřítomnosti matričních efektů. V naší práci jsme tento průkaz nezjišťovali, protože jsme použili metodu chemické ionizace za atmosferického tlaku (APCI), která je podstatně robustnější vzhledem ke složení matrice a riziko matričních efektů je významně nižší ve srovnání s metodou elektrosprejové ionizace (ESI). Pro použití v rámci TDM, ke kterému jsme naší metodu vyvinuli, lze proto popisovanou metodu považovat za dostatečně robustní s ohledem na matriční efekty.

Při použití chemické ionizace za atmosferického tlaku všechny tři sledované látky poskytovaly signál pouze při záznamu kladných iontů.

Na obrázku 1 je zobrazeno spektrum 6-MNA, kde lze vidět ion m/z 217, který je tvořen protonovanou molekulou (M+H)+ a fragmentový ion m/z 171, vzniklý dekarboxylací molekuly. Ion m/z 282 nepatří sledované látce, jedná se o ion z pozadí. Na obrázku 2 je APCI spektrum naproxenu. Opět je zde pozorovatelná protonovaná molekula (M+H)+ o hmotě m/z 231 a intenzivní fragmentový ion m/z 185 vzniklý dekarboxylací.

Na obrázku 3 je zobrazeno spektrum nabumetonu. Ion m/z 229 patří protonované molekule (M+H)+ a intenzivní m/z 171 je fragment vzniklý odštěpením části postranního řetězce (M–CH3COCH2)+. Ion m/z 211 pak odpovídá ztrátě 17 u. Ostatní přítomné ionty patří k signálu pozadí.

Validace

Metoda stanovení 6-MNA a nabumetonu splňuje požadavky na přesnost a správnost. Selektivita metody byla testována analýzou deseti „slepých“ vzorků, přičemž jsme nepozorovali žádné interference.

Zároveň jsme určili detekční limity pro obě stanovované látky. Limit UV detekce pro 6-MNA byl 50 nM, pro nabumeton 0,1 μM. Limit MS detekce pro 6-MNA činil 1 μM, pro nabumeton 0,5 μM.

V přítomnosti naproxenu jako vnitřního standardu (10 μM) byla v koncentračním rozmezí 0,2–200 μM na deseti koncentračních úrovních proměřena odezva standardních roztoků 6-MNA a nabumetonu s využitím UV detekce. Rozmezí pro MS detekci bylo 0,5–200 μM, devět koncentračních úrovní.

Odezva byla pro oba analyty v uváděném rozsahu lineární při použití UV i MS detekce (obr. 4 až 7).

Validace byla provedena pro UV a pro MS detekci zvlášť. Parametry validace pro stanovení 6-MNA jsou uvedeny v tabulce 1. Validace metody stanovení nabumetonu je shrnuta v tabulce 2. Výtěžnost se pohybovala okolo 84 % pro nabumeton a 86–90 % pro 6-MNA (tab. 3).

Stabilita zásobních roztoků

Stabilitu zásobních roztoků jsme sledovali v intervalech 14, 30, 60 a 120 dní. V žádném z intervalů se plochy píku pro 6-MNA, nabumeton nebo vnitřní standard neodchylovaly o více než 2 % od bazálních hodnot.

Stabilita vzorků krevní plazmy

Čtyři cykly zmrazení a opětovného roztátí nevedly k významnému poklesu obsahu analytů ve vzorku.

Krátkodobou teplotní stabilitu jsme sledovali u vzorků krevní plazmy, kdy jsme roztoky ponechali při laboratorní teplotě po dobu 6 hodin. Po této době opět nedošlo k významnému poklesu obsahu analytů ve vzorku podobně jako při testech dlouhodobé stability po 60 a 120 dnech skladování při -70 °C. Všechny výsledky stabilit testů krevní plazmy jsou sumarizovány v tabulce 4.

Reprodukovatelnost metody

Relativní směrodatná odchylka stanovení 6-MNA v kontrolních vzorcích na třech různých koncentračních hladinách se pohybovala v rozmezí 2,9–6,1 %. Obdobně nabývala i v případě nabumetonu relativní směrodatná odchylka hodnot 1,6–3,6 %.

Aplikace metody

Průměrné hladiny (95% CI) nabumetonu a 6-MNA získané UV detekcí jsou uvedeny na obrázcích 8 a 9. Základní farmakokinetické parametry nabumetonu a 6‑MNA jsou uvedeny v tabulce 5. 

Závěr 

Při srovnání obou detekčních technik, lze říci, že UV detekce, jak dokládají směrnice z rovnic kalibračních přímek, je stejně citlivá pro 6-MNA i pro nabumeton. Pokud stejným způsobem zhodnotíme hmotnostní detekci, je citlivější pro nabumeton (směrnice kalibrační přímky nabumetonu je přibližně 2× než směrnice kalibrační přímky 6-MNA). Při použití UV detekce jsme u obou analytů dosáhli nižší meze stanovitelnosti než v případě detekce hmotnostní. Lze předpokládat, že použitím techniky SIM u kvadrupólového hmotnostního spektrometru, případně techniky MRM u tandemových přístrojů by bylo možné zvýšit citlivost o několik řádů a dostat se minimálně na úroveň UV detekce. Tyto módy detekce však námi použité přístrojové vybavení neumožnilo.

Zavedené metody UV i hmotnostní detekce umožňují stanovit koncentrace nabumetonu a 6-MNA po jednorázovém podání terapeutické dávky léčiva. 

Práce vznikla za podpory grantu GA UK 52707.

Došlo 26. listopadu 2010

Přijato 20. prosince 2010

Adresa pro korespondenci:

doc. MUDr. Ondřej Slanař, Ph.D.

Farmakologický ústav 1. LF UK

Albertov 4, 128 00 Praha 2

e-mail: oslan@lf1.cuni.cz