Optimalizácia extrakčnej metódy na stanovenie metadónu a jeho metabolitu EDDP v moči plynovou chromatografiou

Cieľom práce bolo vypracovať extrakčnú metódu na stanovenie metadónu a jeho metabolitu EDDP v moči s použitím plynovej chromatografie (GC) vybavenej špecifickým dusíkovým detektorom (NPD). Extrakčná metóda bola optimalizovaná s cieľom získať čo najlepšiu výťažnosť stanovovaných zlúčenín z moču. Optimálne výsledky boli dosiahnuté alkalickou extrakciou (~ pH 9) s dietyléterom, kde ako vnútorný štandard bol použitý proadifén (PA). Stanovená bola výťažnosť extrakcie pre metadón (MTD) 91 ± 5 % a pre jeho metabolit EDDP 86 ± 5 %. Limit detekcie (LOD) pre MTD je 8 ng/ml moču, pre EDDP 23 ng/ml moču a limit kvantifikácie (LOQ) je pre MTD 27 ng/ml moču a pre metabolit EDDP 77 ng/ml moču. Presnosť metódy v rámci jedného dňa sa pohybovala pre MTD v rozmedzí 1,1–2,32 %, pre EDDP 7,3–9,3 % a presnosť metódy v rámci troch dní pre MTD bola 9,1–13,7 %, pre EDDP 4,7–8,7 %.Vhodnosť metódy pre rutinné monitorovanie metadónu a jeho metabolitu EDDP v moči bola overená na 5 vzorkách pacientov zúčastňujúcich sa metadónového udržiavacieho programu.

Kľúčové slová:
metadón (MTD) – 2-ethylidene-3,3-diphenyl-1,5-dimethylpyrrolidine (EDDP) – moč – GC/NPD

Úvod

Metadón (MTD) ako jedna zo substitučných zlúčenín sa používa pri liečbe závislosti na opiátoch, no najmä na heroíne ¹⁾. Patrí medzi syntetické opiáty pôsobiace na μ a δ opioidné receptory ²⁾.Stanovenie metadónu (4,4-difenyl-6-(N,N-dimetylamino)heptán-3-ónu) a jeho metabolitu 2 etylidén-1,5-dimetyl-3,3-difenylpyrolidínu (EDDP) v moči a ďalších biologických tekutinách je dôležitou súčasťou odvykacieho programu pri liečbe drogových závislostí. Pomáha pri optimalizácii terapeutickej dávky metadónu a pri kontrole liečby drogovo závislých pacientov. Metadónový udržiavací program bol po prvýkrát zahájený v USA v roku 1964 ³⁾. Metadón možno podávať intravenózne, ale aj perorálne v tekutej forme alebo v tabletkách. Má dlhodobý účinok, a preto ho stačí podávať liečeným pacientom 1×denne. Vyznačuje sa pomalým ustálením maximálnej hladiny v krvi (4 hodiny) a dlhým biologickým polčasom (10–18 hodín). Na trhu je známy pod firemnými označeniami Physepton, Polamidon, Macodin. Účinná dávka je determinovaná ako dávka primeraná na prevenciu abstinenčného syndrómu a pohybuje sa v rozmedzí od 60–700 mg/deň ⁴⁾.

Metadón v organizme podlieha intenzívnej metabolizácii, pri ktorej okrem farmakologicky aktívneho metabolitu normetadónu (nachádza sa v krvi) vznikajú i inaktívne metabolity 2-etylidén-1,5-dimetyl-3,3-difenylpyrolidín (EDDP) a 2-etyl-5-metyl-3,3-difenyl-3-H-4,5-dihydropyrol (EMDP) (obr. 1) ⁵⁾. Hlavný metabolit EDDP ako i EMDP sú vylučované močom a ich eliminácia spolu s metadónom je závislá od pH moču.

Stanovenie množstva metadónu ako i jeho metabolitov v biologických vzorkách si vyžaduje citlivú a špecifickú analytickú metódu. V súčasnosti publikované metódy zahŕňajú ako analytické metódy tenkovrstvovú chromatografiu (TLC) ^{6, 7)}, vysokoúčinnú kvapalinovú chromatografiu (HPLC) ^8–10), plynovú chromatografiu (GC) ^{5, 11–17)}, v ktorej najčastejšie používanými detektormi sú plameňovo-ionizačný detektor (FID), detektor elektrónového záchytu (ECD), hmotnostný detektor (MSD), alebo termoionizačný dusíkovo-fosforečný detektor (NPD).

POKUSNA ČASŤ

Chemikálie

Metadónium chlorid bol od UNODC (Viedeň, Rakúsko) 2-etylidén-1,5-dimetyl-3,3-difenylpyrolidín (EDDP), proadifénium chlorid (vnútorný štandard 1 – IS 1) ako aj imipramínium chlorid (vnútorný štandard 2 – IS 2) boli od firmy Sigma (Steinheim, Germany), ich príslušné bázy boli pripravené v laboratóriu. Všetky ďalšie použité chemikálie a rozpúšťadlá boli analyticky čisté od firmy Merck (Darmstadt, Germany) a dietyléter od firmy Slavus (Bratislava, Slovensko), bol predestilovaný pred použitím.

Predúprava vzoriek

Na predúpravu vzoriek sa použili tri extrakčné metódy, označené A, B a C.

Metóda A

K 1 ml moču v zábrusových skúmavkách sa pridalo vypočítané množstvo metadónu (5 μg, 15 μg a 30 μg/ml), EDDP (15 μg, 25 μg a 50 μg/ml) a konštantné množstvo vnútorného štandardu (proadifénu, 15 μg/ml – IS 1 a imipramínu, 25 μg/ml – IS 2).

Do každej skúmavky sa pridalo 50 μl (5 mol/dm) vodného roztoku HCl, 0,5 ml (1 mol/dm) vodného roztoku K₂CO₃ a 5 ml zmesi hexán : izobutylalkohol (99 : 1, v/v). Obsah skúmaviek sa miešal 20 min na mechanickej trepačke a následne sa centrifugoval 10 minút pri 2500 ot/min. Vrchná organická vrstva sa odpipetovala do ďalšej skúmavky a odparila sa pod prúdom dusíka do sucha. Odparok sa kvantitatívne preniesol do vialky v 2× 500 μl metanolu.

Metóda B

K 1 ml moču v zábrusových skúmavkách sa pridalo vypočítané množstvo metadónu (5 μg, 15 μg a 30 μg/ml), EDDP (15 μg, 25 μg a 50 μg/ml), konštantné množstvo vnútorného štandardu (proadifénu, 15 μg ×ml – IS 1 a imipramínu, 25 μg/ml – IS 2), 1 ml 26% amoniaku a 5 ml chloroformu. Obsah skúmaviek sa následne premiešal 20 min na mechanickej trepačke a následne sa centrifugoval 10 minút pri 2500 ot/min. Po odpipetovaní hornej organickej vrstvy sa vodná vrstva opätovne extrahovala 5 ml chloroformu vyššie uvedeným postupom. Organické vrstvy sa spojili a vysušili bezvodým Na₂SO₄. Po odstránení sušidla sa z organickej vrstvy odparilo rozpúšťadlo pod prúdom dusíka a odparok sa preniesol do vialky v 2× 500 μl metanolu.

Metóda C

K 1 ml moču v zábrusových skúmavkách sa pridalo vypočítané množstvo metadónu (5 μg, 15 μg a 30 μg/ml), EDDP (15 μg, 25 μg a 50 μg/ml) a konštantné množstvo vnútorného štandardu (proadifénu, 15 μg/ml – IS 1 a imipramínu, 25 μg/ml – IS 2). Vzorka moču sa upravila 1 ml boraxového tlmivého roztoku na pH 9 a následne sa extrahovala 5 ml dietyléteru. Obsah skúmaviek sa miešal na mechanickej trepačke 20 min a centrifugoval 10 minút pri 2500 ot/min. Éterická vrstva sa premyla 0,5 ml destilovanej vody, vysušila sa bezvodým Na₂SO₄ a odparila sa do sucha pod prúdom dusíka. Odparok sa preniesol do vialky v 2× 500 μl metanolu.

Plynová chromatografia

Chromatografické analýzy boli uskutočnené na plynovom chromatografe HP 5890 Series II s NP detektorom v splitless režime.

Nosný plyn: hélium (tlak: 9,8 psi, prietok: 0,3 ml/min a rýchlosť: 30,0 cm/sec).

Zažíhacie plyny pre NPD: vodík, hélium a vzduch (prietoky: 20,0; 150,0 a 3,5 ml/min). Teplota injektora a NP detektora: 220 °C.

Kolóna: ULTRA 2 (12 m/0,2 mm/0,33 μm) so stacionárnou fázou tvorenou s 95 % dimetylsiloxánu a 5 % difenylsiloxánu.

Teplotný program GC: 100 °C – 1 min – 20 °C min – 300 °C – 2 min.

Celkový čas analýzy bol 13 minút. Vzorka sa dávkovala v objeme 1 μl.

VÝSLEDKY A DISKUSIA

Príprava vzoriek na analýzu tvorí často problémovú a kritickú časť analýzy liečiv a ich metabolitov. Najčastejšie používaným postupom na odstránenie nežiadúcich prímesí a látok zo vzorky nachádzajúcej sa v biologickom či inom materiály je extrakcia. Počas práce sa odskúšali tri metódy extrakcie kvapalina-kvapalina, tzv. liquid-liquid extrakcia (LLE) na stanovenie metadónu a jeho metabolitu EDDP v moči, označené ako metóda A, B a C. Na základe nameraných hodnôt štandardov a vzoriek moču boli vypočítané účinnosti extrakcie pre jednotlivé koncentrácie MTD a EDDP pre všetky tri extrakčné metódy. Pre lepšiu detegovateľnosť a citlivosť na GC/NPD sa pri validácii najlepšej extrakčnej metódy (metóda C) použil ako vnútorný štandard proadifén. Výsledky sú v tabuľke 1.

Z uvedených údajov (tab. 1) vyplýva, že najlepšie výsledky extrakčnej účinnosti pri daných koncentráciách MTD a EDDP za použitia proadifénu ako vnútorného štandardu sú pri extrakčnej metóde C, kde ako extrakčné činidlo sa použil dietyléter a na vysolenie analytu z moču chlorid sodný. U tejto metódy sa hodnotila následne presnosť a správnosť metódy pre stanovenie MTD a EDDP v moči pomocou GC/NPD v rámci jedného dňa a troch dní (tab. 2). Limitom detekcie pre MTD je 8 ng/ml moču a limitom kvantifikácie pre MTD je 27 ng/ml moču. Limitom detekcie pre EDDP je 23 ng/ml moču a limitom kvantifikácie pre MTD je 77 ng/ml moču. Relatívna štandardná odchýlka pre jednotlivé koncentrácie MTD je v rozsahu 1,10–2,32 % v rámci jedného dňa a 9,14–13,72 % troch dní. Relatívna štandardná odchýlka pre jednotlivé koncentrácie EDDP je v rozsahu 7,26 až 9,29 % v rámci jedného dňa a 4,72–8,73 % troch dní.

Podľa validačných parametrov vykazuje táto nami zvolená metóda na stanovenie metadónu a jeho metabolitu EDDP v moči pomocou GC/NPD správne a reprodukovateľné výsledky.

Pre stanovenie MTD a EDDP v moči pomocou GC/NPD bola získaná z použitého koncentračného rozsahu pre MTD 0,5–50,0 μg/ml moču a pre EDDP 1,0–50,0 μg/ml moču kalibračná krivka. Korelačné koeficienty získané pre MTD a pre EDDP sú:

MTD : y = 0,0966x + 0,0032 (R² = 0,9994)

EDDP : y = 0,0331x + 0,0722 (R² = 0,9925)

Metóda bola následne použitá na 5 náhodne vybraných reálnych vzoriek moču pacientov z Centra pre liečbu drogovej závislosti v Bratislave a na základe kalibračnej krivky boli stanovené koncentrácie MTD a EDDP liečených pacientov pri odvykacej kúre z drogovej závislosti na heroíne. Výsledky hladín MTD a EDDP v reálnych vzorkách moču pacientov sú uvedené v tabuľke 3.

Ako môžeme vidieť z výsledkov reálnych vzoriek moču pacientov liečených z drogovej závislosti v Centre pre liečbu drogovej závislosti v Bratislave, extrakčná metóda C ako i následné stanovenie hladín MTD a EDDP v moči metódou GC/NPD je vhodné pre terapeutické stanovovanie vzoriek moču pacientov liečiacich sa z drogovej závislosti. Napriek veľkému rozptylu stanovených koncentrácii metadónu a jeho metabolitu EDDP v pacientských vzorkách moču je ešte stále stanovený obsah metadónu ako i EDDP v rozsahu stanovenia vytvorenej metódy na GC/NPD. Chromatografický záznam z GC/NPD vzorky moču pacienta 5 liečiaceho sa z drogovej závislosti pomocou substitučnej liečby metadónom je na obrázku 2.

Táto práca bola riešená za podpory grantov VEGA č. 1/3416/06, 1/4300/07 a grantu APVV č. 20-030804.

Došlo 25. září 2008

Přijato 29. října 2008

Adresa pro korespondenci:

ing. Renáta Horáková

Katedra chemickej teórie liečiv FaF UK

Kalinčiakova 8, 832 32 Bratislava, Slovenská republika

e-mail: horakova@fpharm.uniba.sk