Imunohistochemická charakterizácia kolagénu IV v zdravých rohovkách a rohovkách pacientov so zadnou polymorfnou dystrofiou

Overview

Cieľ:
Cieľom tejto práce bolo zistiť výskyt jednotlivých reťazcov kolagénu IV (α1, α2, α3, α4, α5 a α6) v kontrolných rohovkách a v rohovkách pacientov so zadnou polymorfnou dystrofiou rohovky (ZPD).

Metodika:
Pre experimenty bolo použitých 7 kontrolných rohoviek a 7 rohovkových terčov získaných pri keratoplastike pacientov so ZPD. Jednotlivé reťazce kolagénu IV boli detekované v kryorezoch o hrúbke 7 Ķm pomocou nepriamej fluorescenčnej imunohistochémie.

Výsledky:
V kontrolných rohovkách sa v bazálnej membráne epitelu nachádzali reťazce α3, α5 a α6, v strome reťazce α3 a α5. V Descemetovej membráne boli prítomné všetky reťazce kolagénu IV s výnimkou reťazca α1, ktorý bol pozitívny len u jednej kontrolnej rohovky zo siedmych. V bunkách epitelu a endotelu kontrolných rohoviek nebol kolagén IV detekovaný. U rohoviek pacientov so ZPD sa v bazálnej membráne epitelu okrem reťazcov α3, α5 a α6 vyskytoval aj reťazec α2, v strome boli vedľa reťazcov α3 a α5 detekované i reťazce α1, α2 a α4. V Descemetovej membráne rohoviek pacientov so ZPD boli vo zvýšenej (α1, α2, α3), zníženej (α4, α6), alebo nezmenenej (α5) miere oproti kontrolám prítomné všetky reťazce kolagénu IV. V bunkách epitelu a endotelu rohoviek pacientov nebol kolagén IV detekovaný.

Záver:
Ľudská rohovka vykazuje značnú heterogenitu vo výskyte reťazcov α kolagénu IV, a to predovšetkým v bazálnej membráne epitelu a v Descemetovej membráne, pre ktoré je prítomnosť kolagénu IV jednou z charakteristických čŕt. U pacientov so ZPD dochádza k zmenám expresie jednotlivých reťazcov kolagénu IV na úrovni Descemetovej membrány a stromy.

Kľúčové slová:
kolagén IV, rohovka, nepriama fluorescenčná imunohistochémia

ÚVOD

Jedným z charakteristických rysov rohovky je jej transparencia, ktorá je udržiavaná usporiadaním rohovkovej stromy a funkčnosťou endotelu. Základnou extracelulárnou zložkou stromy sú kolagénové vlákna [21, 22].

Kolagén IV sa v rohovke nachádza nielen v strome, ale je predovšetkým základnou stavebnou štruktúrou bazálnych membrán (BM) [8, 10], ktoré hrajúdôležitú úlohu v bunečnej adhézii, diferenciácii a regenerácii [15]. V rohovke sú dve BM: BM epitelu (BME) a Descemetova membrána (DM).

Kolagén IV je proteín tvorený troma reťazcami α zloženými do trojzávitnice. Dodnes bolo identifikovaných 6 rôznych reťazcov α (α1 – α6) kolagénu IV [24]. Triméry [α1]2α2 a [α1]3 sú prítomné vo väčšine BM, zatiaľ čo reťazce α3, α4, α5 a α6 sú minoritnou komponentou BM s obmedzenou tkanivovou distribúciou [8]. Hlavnou funkciou kolagénu IV je tvoriť podpornú sieť. Navyše rôzne domény reťazcov α môžu regulovať bunkové funkcie, akými sú anti-angiogénne a anti-tumorové vlastnosti. Reťazce α1 a α2 podporujú bunečnú migráciu, zatiaľ čo všetky ostatné reťazce majú anti-invazívny charakter [23].

Imunohistochemickou charakterizáciou reťazcov kolagénu IV v normálnej rohovke zistili Ljubimov a kol. [19] vertikálnu a horizontálnu heterogenitu v ich lokalizácii. V BME centrálnej rohovky detekovali reťazce α3 – α5. Intenzita ich signálu klesala smerom k periférii. V strome rohovky detekovali reťazce α3, α4 a α5. V DM sa na stromálnej strane nachádzali reťazce α1 a α2, na strane endotelovej reťazce α3, α4 a α5. Tuori a kol. [26] podobne lokalizovali reťazce α3 a α4 na endotelovej strane DM, ale v BME ich prítomnosť nezistili. Reťazce α5 a α6 detekovali v BME centrálnej rohovky a na endotelovej strane DM. Reťazec α6 pritom vykazoval horizontálnu heterogenitu s poklesom signálu smerom k periférii. Imunoelektrónovou mikroskopiou bol pozorovaný kolagén IV na endotelovej strane DM [20].

Mutácie v génoch pre reťazce α3, α4, α5 a α6 kolagénu IV podmieňujú vznik Alportovho syndrómu, dedičného ochorenia charakterizovaného hematúriou, senzorineurálnou hluchotou a očným postihnutím [16].

Zadná polymorfná dystrofia rohovky (ZPD, posterior polymorphous corneal dystrophy) je bilaterálne ochorenie rohovky s autozomálne dominantnou dedičnosťou, ktoré postihuje primárne endotel a DM [3, 4, 7].

Zmeny na úrovni endotelu pacientov so ZPD (epitelizácia a proliferácia abnormálneho endotelu) boli detailne charakterizované svetelnou a elektrónovou mikroskopiou [2, 7, 13]. Epitelizácia endotelu pacientov so ZPD bola ďalej potvrdená detekciou výskytu širokého spektra cytokeratínov, typických epiteliálnych proteínov, ktoré sa v zdravom endoteli nevyskytujú [9, 25].

Jedným z troch zatiaľ známych mutovaných génov, ktoré asociujú so ZPD, je gén pre reťazec α2 kolagénu VIII (COL8A2) lokalizovaný na 1. chromozóme [1]. U jedného pacienta so ZPD bol popísaný ektopický výskyt reťazca α3 kolagénu IV v bunkách endotelu rohovky v dôsledku mutácie v transkripčnom faktore 8 (TCF8, novšie nazývaný ZEB1), lokalizovanom na 10. chromozóme [12].

V rohovkách pacientov so ZPD môže dochádzať k formovaniu patologickej vrstvy na úrovni DM – zadnej kolagénovej vrstvy (posterior collagenous layer, PCL). Táto vrstva formuje ďalšiu vrstvu medzi zadnou amorfnou vrstvou (posterior non-banded layer) a endotelom. U pacientov so ZPD boli detekované všetky tri typy PCL: prúžkovaná, fibrilárna aj fibrocelulárna. Zadná kolagénová vrstva vzniká aj v rohovkách pacientov, ktorí trpia chorobami s podobnými zmenami na úrovni zadnej časti rohovky ako sa vyskytujú u ZPD, napríklad u kongenitálnej hereditárnej endotelovej dystrofie, Fuchsovej dystrofie alebo iridokorneálneho endotelového syndrómu [27]. Pomocou imunoelektrónovej mikroskopie boli v tejto patologickej vrstve detekované kolagény I, III, V, VI a VIII [17].

Detailná lokalizácia a charakterizácia jednotlivých kolagénov u pacientov so ZPD však doteraz nebola prevedená. Cieľom tejto práce je zmapovať výskyt jednotlivých reťazcov kolagénu IV v normálnych rohovkách a rohovkách získaných od pacientov so ZPD.

PACIENTI A METODIKA

Sedem kontrolných rohovkových terčov (K1 – K7) vylúčených z transplantačného programu (nevyhovujúce kvalitatívne a kvantitatívne parametre endotelu, pozitívne výsledky sérologického vyšetrenia darcu) poskytla Oční tkáňová banka Všeobecné fakultní nemocnice a 1. LF UK. U darcov týchto rohoviek nebolo zaznamenané žiadne ochorenie očí a ich priemerný vek bol 63 rokov.

Sedem rohovkových terčov bolo získaných pri parciálnej perforujúcej keratoplastike pacientov so ZPD (tab. 1).

Jedna z týchto rohoviek bola získaná od pacienta pochádzajúceho z rodiny, v ktorej bolo ochorenie mapované na krátke ramienko 20. chromozómu (viď tab. 1; P1), [6]. Ďalších päť rohoviek bolo získaných od piatich pacientov, ktorí pochádzajú z rovnakej geografickej oblasti v juhozápadnej časti Českej republiky a predpokladá sa u nich rovnaká mutácia (viď tab. 1; P2, P4 – P7). Jedna rohovka bola získaná od pacienta s detekovanou mutáciou v ZEB1 géne [18] (viď tab. 1; P3). Jeden z pacientov so ZPD vykazoval na rohovkovej topografii pre keratokonus charakteristické vyvýšenie v inferotemporálnej časti rohovky (viď tab. 1; P5).

Získané rohovky boli rozdelené na tri časti, zaliate do média pre zamrazovanie tkanív (Optimal cutting temperature medium) a uchované pri teplote -70 °C. Pre experimenty boli použité kryorezy o hrúbke 7 Ķm, montované po štyroch na podložné sklíčka. Jeden rez na každom sklíčku bol použitý pre negatívnu kontrolu (vynechaná inkubácia s primárnou protilátkou).

Reťazce α1, α2, α3, α4, α5 a α6 kolagénu IV boli detekované metódou nepriamej fluorescenčnej imunohistochémie. Rezy boli fixované 10 minút v chladenom acetóne a opláchnuté vo fosfátovom pufre (phosphate buffered saline, PBS, pH = 7,4). Následne boli rezy inkubované jednu hodinu s primárnou protilátkou riedenou v PBS s 1% bovínnym sérom albumínom pri izbovej teplote. Boli použité myšie a potkanie monoklonálne protilátky v nasledujúcich koncentráciách: anti-kolagén IV α1 (1 : 50), anti-kolagén IV α3 (1:50), anti-kolagén IV α5 (1 : 50), (Wielisa, Wieslab, Švédsko), anti-kolagén IV α2 (1 : 300), (Chemicon International Inc., Temecula, USA), anti-kolagén IV α4 (1 : 25) a anti-kolagén IV α6 (1 : 50), (poskytnuté doktorom Sadom, Japonsko). Po opláchnutí (3 5 minút v PBS) boli rezy inkubované 1 hodinu s anti-myšacou (1 : 500) alebo anti-potkaňou (1 : 100) IgG sekundárnou protilátkou konjugovanou s FITC (fluorescein isothiocyanate), (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, USA). Pre zhotovenie preparátov bolo použité montovacie médium Vectashield s propidium iodidom pre vizualizáciu bunkových jadier (Vector Laboratories, Inc. Burlingame, USA). Všetky experimenty boli prevedené dvakrát.

Rezy boli pozorované pod fluorescenčným mikroskopom Olympus BX 51 pri zväčšení 100–400-krát. Pre fotografickú dokumentáciu sme použili Vosskühler VDS CCD – 1300 kameru (VDS Vosskühler GmbH, Nemecko) a pre hodnotenie vzorkov program LUCIA 4.8 (Laboratory Imaging, ČR). Intenzita signálu bola hodnotená jednou osobou pomocou škály: – negativita, + slabá pozitivita, ++ stredná pozitivita, +++ silná pozitivita.

VÝSLEDKY

Intenzita signálu pre jednotlivé reťazce kolagénu IV a ich lokalizácia v kontrolných rohovkách a rohovkách pacientov so ZPD je zobrazená v tabuľke 2.

Reťazec α1 kolagénu IV nebol detekovaný ani v BME, ani v strome kontrolných rohoviek. Pozitívny signál bol zaznamenaný v BM limbusu a spojovky (dáta neuvedené). V jednom prípade bol reťazec α1 detekovaný na stromálnej strane DM v jednej línii na periférii rohovky (K3).

BME pacientov so ZPD bola negatívna. Stroma troch pacientov bola silno pozitívna predovšetkým v zadnej časti (1/5 – 1/3 stromy). Prechod medzi silno pozitívnou a kompletne negatívnou časťou stromy bol veľmi výrazný. U šiestich pacientov so ZPD bol reťazec α1 slabo až silno pozitívny na endotelovej strane DM v jednej línii na periférii rohovky (P1, P2) alebo prerušovane po celej dĺžke DM (P3, P4). U pacientov P5 a P7 bola táto línia zdvojená (obr. 1A).

Reťazec α2 kolagénu IV nebol detekovaný v BME ani v strome kontrolných rohoviek. Pozitívny signál pre reťazec α2 sa objavil v BM limbusu a spojovky (dáta neuvedené) a v DM šiestich kontrolných rohoviek, a to vo všetkých  prípadoch na stromálnej strane (K1, K3 – K7) a v dvoch prípadoch aj na endotelovej strane DM (K1, K4).

U pacientov so ZPD bola v štyroch rohovkách slabo až silno pozitívna BME. U piatich pacientov bola silno pozitívna zadná (1/10 – 1/3) časť stromy, ktorá bola ostro ohraničená od negatívnej časti stromy. DM všetkých pacientov bola po celej dĺžke pozitívna v jednej línii, u šiestich pacientov na endotelovej strane (P1 – P5, P7), u dvoch pacientov na endotelovej aj stromálnej strane (P3, P5) a u jedného pacienta len na stromálnej strane (P6) (viď obr. 1B).

Reťazec α3 kolagénu IV bol slabo až stredne pozitívny v BME troch kontrolných rohoviek. Táto pozitivita sa strácala smerom k periférii rohovky. Stroma vykazovala slabú difúznu pozitivitu v piatich a DM vo všetkých kontrolných rohovkách, a to na endotelovej strane v jednej línii po celej dĺžke rohovky.

BME bola slabo až silno pozitívna v šiestich rohovkách od pacientov so ZPD. Stroma štyroch pacientov (P2 – P5) bola silno pozitívna len v zadnej časti (1/5 – 1/3). Stroma troch pacientov (P1, P6 a P7) vykazovala slabú až silnú difúznu pozitivitu po celej dĺžke stromy. DM bola slabo až silno pozitívna u šiestich pacientov v jednej línii po celej dĺžke endotelu. U pacienta P3 bola táto línia zdvojená (obr. 1C).

Reťazec α4 kolagénu IV nebol detekovaný v BME ani v strome kontrolných rohoviek. DM všetkých kontrolných rohoviek vykazovala slabú až silnú pozitivitu na endotelovej strane po celej dĺžke rohovky.

Reťazec α4nebol prítomný ani v BME, ani v strome rohoviek získaných od pacientov so ZPD (okrem slabo pozitívnej zadnej 1/3 stromy pacienta P5). Na endotelovej strane DM piatich rohoviek bol detekovaný slabý signál pre reťazec α4. V dvoch rohovkách signál nebol prítomný.

Reťazec α5 kolagénu IV vykazoval silnú pozitivitu v BME a strednú až silnú pozitivitu na endotelovej strane DM kontrol. Stroma piatich kontrolných rohoviek vykazovala slabú difúznu pozitivitu po celej dĺžke stromy.

Stredne až silno pozitívny signál bol prítomný aj v BME a na endotelovej strane DM patologických rohoviek. U pacientov P3 a P5 sa objavilo zdvojenie línie v DM. Stroma pacientov P3 a P5 bola silno pozitívna len v zadnej časti (1/5 – 1/3), stroma pacientov P1 a P6 vykazovala slabú difúznu pozitivitu po celej dĺžke a stroma ostatných pacientov bola negatívna.

Reťazec α6 kolagénu IV bol stredne až silno exprimovaný v BME kontrolných rohoviek. Pozitívna bola aj BM limbusu, spojovka bola negatívna (dáta neuvedené). Stroma všetkých kontrolných rohoviek bola negatívna. DM vykazovala slabú až silnú pozitivitu na endotelovej strane v jednej línii po celej dĺžke rohovky.

BME a DM väčšiny rohoviek pacientov so ZPD boli slabo až stredne pozitívne, stroma bola negatívna.

V bunkách endotelu a epitelu nebol prítomný žiaden z detekovaných reťazcov kolagénu IV.

DISKUSIA

Cieľom tejto štúdie bolo charakterizovať výskyt reťazcov α1 – α6 kolagénu IV v kontrolných rohovkách a rohovkách pacientov so ZPD. Charakterizácia lokalizácie jednotlivých reťazcov kolagénu IV v normálnej rohovke je dôležitá ako pre poznanie štruktúry zdravej rohovky, tak aj pre zistenie prípadných rozdielov v prítomnosti a lokalizácii kolagénov v patologických rohovkách.

Výskyt jednotlivých reťazcov α kolagénu IV v našich kontrolných rohovkách je takmer zhodný so zverejnenými výsledkami lokalizácie kolagénu IV [19, 26]. Na rozdiel od nás detekovali Ljubimov a kol. [19] reťazec α1 na stromálnej strane DM a reťazec α4 v BME a strome. Naopak Tuori a kol. [26] podobne ako my reťazec α4 v BME nedetekovali. Rozličné výsledky môžu byť spôsobené hlavne použitím odlišných protilátok a modifikáciami v prevedení imunohistochemickej metódy.

Za zásadný nález považujeme oproti kontrolám značne zvýšený výskyt reťazca α1 v DM väčšiny rohoviek pacientov so ZPD. Prítomnosť reťazca α1 kolagénu IV bola zaznamenaná aj v zadnej strome troch pacientov so ZPD. Reťazec α2 sme oproti negatívnej strome všetkých kontrolných rohoviek detekovali v strome väčšiny rohoviek pacientov so ZPD. Oproti kontrolám sme zaznamenali aj zosilnenie intenzity signálu reťazca α2 aj v DM a BME. Lokalizácia reťazcov α1 a α2 bola na rozdiel od kontrolných rohoviek (pozitivita na stromálnej strane DM) zaznamenaná na endotelovej strane DM, ktorá sa tvorí v dospelosti a môže vypovedať o zmenách vznikajúcich na základe abnormálnej sekrécie patologického endotelu.

Keďže reťazce α1 a α2 sa u kontrol exprimujú predovšetkým v BM limbusu a spojovky, v oblastiach s vysokou proliferačnou činnosťou, domnievame sa, že ich zvýšený výskyt na endotelovej strane DM u pacientov so ZPD môže byť spojený s proliferačnou kapacitou patologického endotelu, v ktorom sa nachádzajú bunky exprimujúce proliferačný marker Ki67 (dáta neuvedené). Navyše promigračné vlastnosti reťazcov α1 a α2 boli už popísané [23]. Bolo preukázané, že zmeny v zložení BM môžu navodiť zmeny v expresii cytokeratínov v bunkách ležiacich na BM [14]. Môžeme si predstaviť, že zmeny v zložení DM vedú k zmenám fenotypu endotelových buniek (epitelizácii endotelu), k jeho patologickej sekrécii, a tím spätne k ďalším zmenám v štruktúre  DM.

Akumulácia reťazcov α1 a α2 a strata reťazcov α3 a α5 kolagénu IV bola popísaná aj v BME rohoviek pacientov s keratokonusom  [5, 11, 26]. K strate reťazcov α3 a α5 ani k akumulácii reťazca α1 u nášho pacienta so ZPD a s keratokonusom (P5) nedošlo. U tohto pacienta sme v BME detekovali reťazec α2, ten sa ale vyskytoval aj v BME troch ďalších pacientov so ZPD (P2 – P4) bez prítomnosti keratokonusu. Z toho dôvodu akumuláciu reťazca α2 v BME nemôžeme jednoznačne dávať do súvislosti s prítomnosťou keratokonusu. To, či dochádza k akumulácii reťazca α2 v BME niektorých pacientov so ZPD v dôsledku ZPD, je treba overiť na väčšom súbore kontrolných aj patologických rohoviek.

Vyššiu intenzitu signálu pre reťazec α3 kolagénu IV v rohovkách získaných od pacientov so ZPD sme oproti kontrolám detekovali na úrovni BME, stromy a DM. Výskyt reťazca α3 v endoteli rohovky jedného pacienta so ZPD v dôsledku mutácie génu TCF8 bol popísaný Krafchakom [12]. V našich experimentoch sme prítomnosť žiadneho zo sledovaných reťazcov kolagénu IV v endoteli pacientov nepreukázali, aj napriek tomu, že mutácia v ZEB1 géne bola preukázaná u jedného nášho pacienta (P3), [18]. Zaujímavé je, že aj pacienti bez detekovanej mutácie v tomto géne vykazujú podobné zmeny v zastúpení a lokalizácii jednotlivých reťazcov kolagénu IV.

Táto štúdia charakterizuje výskyt jednotlivých reťazcov kolagénu IV v rohovkách pacientov so ZPD. U ZPD dochádza k akumulácii reťazcov α1 a α2 predovšetkým v DM a rohovkovej strome. Zmeny v zložení a lokalizácii reťazcov kolagénu IV spolu s  intracelulárnymi zmenami patologického endotelu môžu byť podkladom morfologických zmien aj proliferačnej kapacity, ku ktorým dochádza (zatiaľ bez preukázateľnej korelácie ku zmenám na molekulárne-genetickej úrovni) v rohovkách pacientov so ZPD.

ZÁVER

Reťazce kolagénu IV v zdravej rohovke vykazujú značnú heterogenitu v lokalizácii v jednotlivých vrstvách rohovky.

Z našich výsledkov vyplýva, že u pacientov so ZPD dochádza k zmenám v zastúpení a lokalizácii jednotlivých reťazcov kolagénu IV na úrovni DM, stromy ale aj BME. K akumulácii dochádza u reťazca α1 v DM a strome a u reťazca α2 v DM, strome aj BME. Mechanizmus vzniku týchto zmien, ktoré môžu podporovať proliferačnú kapacitu a morfologické zmeny patologického endotelu na molekulárne genetickej príčine zatiaľ nebol zistený.

Poďakovanie

Táto práca bola podporovaná z výskumného zámeru Ministerstva školstva, mládeže a tělovýchovy MSM 0021620806/20610011.Autori ďakujú Dr. Sadovi za poskytnutie protilátok proti reťazcom α4 a α6 kolagénu IV, MUDr. Viere Veselej a Šárke Kalašovej za pomoc pri technickej príprave experimentov.

Mgr. Stanislava Merjavá

Laboratoř biologie a patologie oka,

Institut dědičných metabolických chorob

VFN a 1. LF Univerzity Karlovy

U Nemocnice 2

128 08 Praha

merjava@centrum.cz