CRISPR-Cas9 jako nástroj v terapii nádorových onemocnění

Východiska: Editace genomu využívající CRISPR-Cas9 se v průběhu krátké doby zařadila mezi základní metody bio­logického výzkumu. Tento nedávno objevený mechanizmus adaptivní antivirové obrany bakterií se podařilo přizpůsobit potřebám vědy a učinit z něj tak neocenitelný nástroj v manipulaci s DNA. K rozšíření metody přispěla především její jednoduchost a spolehlivost, s jakou ji lze využít. Pod pojmem editace genomu rozumíme úpravy genomové DNA cílené s přesností na jeden pár bází. V jednoduchosti zaměření enzymu na cílovou sekvenci se CRISPR-Cas9 zásadním způsobem liší od předchozích technologií. Na poli výzkumu nádorových onemocnění umožnil CRISPR-Cas9 vývoj řady modelových systémů vhodných pro studium karcinogeneze a testování léčiv. Z terapeutického hlediska našel CRISPR-Cas9 uplatnění v oblasti imunoterapie, a to zejména při ex vivo genetických modifikacích T lymfocytů pa­cienta.

Cíl: Terapeutický potenciál CRISPR-Cas9 v léčbě nádorových onemocnění se nyní snaží ověřit několik klinických studií. Na základě těchto studií jsme v článku shrnuli strategie použité při přípravě terapeutických nástrojů použitelných v protinádorové terapii.

Závěr: Technologie CRISPR-Cas9 se ukazuje jako nepostradatelná v oblasti základního výzkumu při studiu funkce jednotlivých genů v procesu karcinogeneze. Využití metody v protinádorové terapii je více problematické. Před vlastní klinickou praxí je potřeba provést ještě řadu optimalizací týkajících se účinnosti, bezpečnosti a specifity CRISPR-Cas9.

Klíčová slova:

CRISPR-Cas9 – imunoterapie – klinická studie

Úvod

Technologie editace genomu s využitím systému CRISPR-Cas9 je v bio­logickém výzkumu již natolik rozšířená, že bychom jen těžko hledali oblast, která ji nevyužívá. Přitom ještě před 10 lety byl pojem CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) známý jen úzkému okruhu mikrobio­logů, kteří jej objevili jako systém adaptivní imunity bakterií. Když se však podařilo objasnit mechanizmus, jakým CRISPR-Cas9 brání opakované infekci bakterie fágem, vyšel najevo obrovský potenciál tohoto systému pro vědu. V roce 2013 byl představen CRISPR-Cas9 optimalizovaný pro využití v lidských buňkách [1,2] a ihned se začal šířit do laboratoří po celém světě rychlostí typickou pro revoluční objevy, a to i navzdory skutečnosti, že tento nástroj nepřinesl v principu nic, čeho by nebylo možné dosáhnout pomocí dřívějších technologií. Systém CRISPR-Cas9 nebyl první a není jedinou technikou umožňující tzv. editaci genomu [3]. K jeho rozšíření přispěla především jednoduchost, s jakou jej lze používat. Jedná se o jednoduchou a spolehlivou metodu, která do té doby nebyla dostupná a s jejímž příchodem bylo možno naplno využít potenciál ostatních technologií.

Pod pojmem editace genomu rozumíme úpravy genomové DNA cílené s přesností na jeden pár bází. Přesnost je přitom klíčová a umožňuje zasahovat do DNA způsobem, kterým lze dosáhnout požadovaných změn. Na molekulární úrovni mají systémy pro editaci genomu podobu enzymů, které dokážou rozštěpit DNA v místě dané sekvence (jedná se tedy o nukleázy, konkrétně DNázy). Známe celou řadu nejrůznějších DNáz štěpících více či méně specifické sekvence DNA. O editaci genomu však mluvíme pouze tehdy, pokud využíváme enzymy, které jsou naprogramovatelné tak, aby specificky štěpily námi zvolenou libovolnou sekvenci. V jednoduchosti zaměření enzymu na cílovou sekvenci se tak CRISPR-Cas9 zásadním způsobem liší od předchozích technologií ZFN (zinc-finger nucleases) a TALEN (transcription activator-like effector nucleases) [3,4].

Mechanizmus editace genomu metodou CRISPR-Cas9

Systém CRISPR-Cas9 běžně používaný v laboratorní praxi se skládá ze dvou komponent –  proteinu Cas9 (CRISPR associated protein 9) fungujícího jako nukleáza a specifické malé molekuly RNA nazývající se sgRNA (single-guide RNA). Ta se váže na Cas9 a odpovídá za jeho navedení na cílovou sekvenci. Na základě komplementarity bází mezi cílovou DNA a sgRNA dochází k rozpoznání sekvence a k jejímu následnému štěpení. Enzym Cas9 štěpí vždy jen takovou sekvenci, která je komplementární k jeho sgRNA. Vytvoření vhodné sgRNA představuje jednoduchou, rutinní záležitost a adaptace celého systému pro štěpení jakékoliv sekvence je nenáročná s ohledem na čas, materiál nebo know-how laboratoře [1].

CRISPR-Cas9 lze využít především k modulaci exprese genu, a to jak k aktivaci, tak jeho inhibici (schéma 1A) [5]. Vyřazení funkce genu v buňce můžeme dosáhnout pouhým rozštěpením řetězce DNA v místě vybraného genu. Dvouřetězcové zlomy v DNA jsou v lidské buňce nejčastěji opravovány pomocí mechanizmu nehomologního spojování konců, které však vede často ke vzniku mutací v podobě krátkých inzercí nebo delecí v místě zlomu. Mutace pak mají za následek vznik nefunkčního genového produktu, a to jak na úrovni proteinu, tak nekódující RNA. Takto vyřazený gen nám umožňuje zkoumat jeho funkci v daném systému, např. jedná-li se o vyřazení onkogenu v nádorové buňce nebo o vyřazení nádorového supresoru v buňce zdravé.

Štěpení DNA lze také využít k opravě vybraného genu (schéma 1B). Pomocí CRISPR-Cas9 lze přímo eliminovat genetické změny vedoucí k nekontrolované proliferaci či metastazování [6]. V určité fázi buněčného cyklu má buňka k dispozici další typ oprav, a sice opravu řízenou homologní sekvencí. V tomto případě buňka využije jako templát pro opravu dvouřetězcového zlomu druhý homologní chromozom a výsledkem je dokonale opravené vlákno v původní podobě. Tento mechanizmus je ale možné využít i pro vnesení změn do sekvence DNA. Pokud do buňky vneseme spolu se systémem CRISPR-Cas9 i krátkou molekulu DNA, která má sekvenci homologní s cílovým genem lišící se pouze v místě bodové mutace, kterou chceme opravit, může tato DNA posloužit jako templát a oprava povede k nahrazení původní nefunkční varianty funkční variantou genu [7]. Tato možnost je zajímavá především pro genovou terapii. Na rozdíl od dřívějších metod genové terapie nabízí CRISPR-Cas9 přímou opravu nefunkčního genu, a nikoli pouze vnesení kopie genu, která je navíc v buňce přítomna pouze po přechodnou dobu, nebo se náhodně začlení do genomové DNA.

Další možností využití CRISPR-Cas9 je cílená epigenetická editace (schéma 1C) umožňující měnit např. histonové modifikace či DNA metylace a tím ovlivňovat expresi proteinů [8]. Vezmeme-li v úvahu množství epigenetických faktorů zahrnutých do regulace nádorových onemocnění, mohlo by zaměření se na tyto regulační mechanizmy znamenat významný pokrok v terapii nádorů. Základem tohoto sytému je komplex Cas9/ sgRNA, ve kterém mutantní Cas9 není schopen štěpit DNA, proto funguje dohromady se sgRNA pouze jako naváděcí DNA vazebná doména. Fúzním partnerem Cas9 je potom další protein se specifickou funkcí, kterou chceme aplikovat na vybrané místo v DNA. Může se jednat např. o enzymy modifikující chromatin, které ovlivňují genovou expresi, a tím umožňují zvýšit nebo snížit množství genového produktu v buňce.

CRISPR-Cas9 v protinádorové terapii

Terapeutický potenciál CRISPR-Cas9 v oblasti protinádorové terapie byl potvrzen řadou in vitro, in vivo a ex vivo experimentů. Technologie CRISPR-Cas9 je nejvíce využívána v imunoterapii nádorových onemocnění, a to především v adoptivní imunoterapii, která je založená na izolaci pa­cientových T lymfocytů, jejich genetické modifikaci ex vivo, kultivaci a následném navrácení zpět do organizmu, kde dojde k navození imunitní odpovědi v oblasti nádoru. Cílem genetických modifikací na T lymfocytech je upevnit specifitu a zvýšit jejich afinitu k danému nádorovému antigenu, aktivovat imunitní odpověď a zároveň omezit riziko vzniku imunitní reakce štěpu proti hostiteli (graft versus host dis­ease –  GvHD). Rozsah imunitní reakce je závislý na interakci řady různých receptorů a ligandů, které zesilují či tlumí procesy aktivace T lymfocytů. Důležitou roli v potlačení imunitní odpovědi v nádorovém mikroprostředí hrají tzv. kontrolní body imunitního systému. Za jeden z nich je považovaná interakce PD-1/ PD-L1, která navozuje funkční inaktivitu lymfocytů, a tím chrání organizmus před vznikem autoimunitních onemocnění [9]. Tato interakce přispívá k „vyčerpání“ (exhausting) efektorových lymfocytů, které nejsou schopné specifické cytotoxické odpovědi a destrukce cílových buněk [10], což může naopak také vést k navození nádorové tolerance. K jejímu vzniku přispívá především exprese PD-L1 na povrchu nádorových buněk. Jednou z možností imunoterapie je vyřazení kontrolního bodu PD-1, a tím navození vyšší aktivity imunitního systému. Je nutno zmínit, že v současné době existují monoklonální protilátky blokující receptor PD-1, ale i ligand PD-L1, které byly schváleny k léčbě pokročilého metastazujícího melanomu, renálního karcinomu a nemalobuněčného karcinomu plic [11,12]. T lymfocyty modifikované CRISPR-Cas9 s vyřazeným PD-1 byly použity v probíhající klinické studii (NCT02793856) (schéma 2A^I) provedené u pa­cientů s nemalobuněčným karcinomem plic, u kterých selhala standardní léčba a u kterých byla zjištěna zvýšená exprese PD-L1 na nádorových buňkách. Jedná se o první studii, u které byly získány výsledky z CRISPR-Cas9 terapie. Studie je zaměřená na zhodnocení bezpečnosti a definování maximální tolerované dávky po implantaci autologních T lymfocytů modifikovaných CRISPR-Cas9 s vyřazeným PD-1 (PD-1-/ - T). Studie se zúčastnilo devět pa­cientů, dokončilo ji osm z nich. Pa­cienti byli zařazeni do tří skupin, s eskalací dávky 1 × 10⁷, 2 × 10⁷ a 4 × 10⁷ PD-1-/ - T/ kg ve dvou cyklech. Z nežádoucích účinků bylo nejzávažnější nadměrné pocení (hyperhidróza) dosahující stupně 3. Dále u pa­cientů docházelo ke zvýšené aktivitě jaterních transamináz (ALT/AST), trombocytopenii, únavě či horečce, vše hodnoceno v mírné až střední závažnosti (stupeň 1– 2). Jeden pa­cient trpěl srdeční arytmií stupně 1, a to po dobu 42,4 týdne. Sedm pa­cientů odpovídalo na průběh léčby. U dvou bylo onemocnění stabilizováno po dobu 18– 22 týdnů a zároveň byla zjištěna větší diverzita T lymfocytů než u dalších pěti pa­cientů, u kterých došlo k progresi onemocnění. Kontrola onemocnění (diasease control rate – DCR) po 8 týdnech byla zaznamenána ve 28,6 % a medián přežití bez progrese (progression-free survival – PFS) byl 7,6 týdne. Závěrem studie bylo konstatováno, že terapie PD-1-/ - T se zdá být bezpečná. Čtyři další klinické studie využívající obdobný koncept delece PD-1 na autologních T  lymfocytech byly registrovány při léčbě rakoviny prostaty (NCT02867345), močového měchýře (NCT02863913), jícnu (NCT03081715) a ledvin (NCT02867332). V další klinické studii (NCT03399448) (schéma 2A^II) je testováno využití T lymfocytů nesoucích tři různé genetické modifikace indukované CRISPR-Cas9 v léčbě mnohočetného myelomu, synoviálního sarkomu, myxoidního liposarkomu a melanomu. Kromě omezení exprese PD-1 bude vyřazena také část T buněčného receptoru (T-cell receptor –  TCR) a vnesen modifikovaný receptor selektivně se vázající na antigen NY-ESO-1 exprimovaný na nádorových buňkách. Vyřazení TCR by mělo napomoci snížit riziko vzniku GvHD. Další klinická studie fáze I/ II (NCT03044743) (schéma 2A^III) je registrována pro léčbu malignit asociovaných s virem Epsteina a Barrové, u nichž velmi často dochází ke zvýšené expresi PD-L1. Ve studii budou využity T lymfocyty modifikované CRISPR-Cas9 s vyřazeným PD-1, které jsou specifické k buňkám infikovaným virem Epsteina a Barrové. Jak již bylo zmíněno výše, k inhibici interakce PD-1/ PD-L1 jsou v současné době využívány monoklonální protilátky. Přesto celý záměr s „nabuzením“ imunitního systému pomocí modifikovaných T lymfocytů vypadá velmi slibně a je další alternativou protinádorové terapie využitelnou v klinickém prostředí.

Další imunoterapeutická strategieje založena na využití modifikovaných T lymfocytů upravených ex vivo tak, aby exprimovaly chimérický antigenní receptor (chimeric antigen receptor –  CAR). Ten je tvořen intracelulární doménou TCR, která vede k aktivaci T lymfocytů a spouští cytotoxickou odpověď, a extracelulární doménou specificky rozeznávající cílový antigen [13]. Výhodou těchto geneticky modifikovaných T lymfocytů je specifita vazby na cílový antigen bez nutnosti zpracování antigenu a jeho prezentace na hlavním histokompatibilním komplexu (major histocompatibility complex –  MHC). Cílem je zajistit, aby tyto geneticky modifikované T lymfocyty rozpoznaly specifické antigeny vyskytující se na povrchu maligních buněk a eliminovaly je. Tato metodika se vyvíjí již více než 20 let [14]. V jejím průběhu vzniklo několik generací CAR a současně byly zdokonalovány metodiky bezpečného a účinného vložení CAR do autologních T lymfocytů. Původně byla používána transfekce DNA, dále pak transpozonové vektory obsahující element pro integraci, až po stabilní transdukci T lymfocytů pomocí lentivirových vektorů [11]. Úspěšně byla testována specifita CAR-T lymfocytů k antigenu CD19, jehož exprese je omezena především na B lymfocyty a je ideálním cílovým antigenem pro hematologické malignity vycházející z B lymfocytární linie [12]. U řady pa­cientů velmi často dochází k relapsu onemocnění z důvodů ztráty CD19 na nádorových buňkách. Řešení nabízí probíhající klinická studie fáze I/ II (NCT03398967) (schéma 2B^I), jejímž úkolem je zhodnotit proveditelnost a bezpečnost terapeutického použití CRISPR-Cas9 pro přípravu modifikovaných CAR-T lymfocytů specifických k CD19 a CD20 nebo k CD19 a CD22 u pa­cientů s recidivující B lymfocytární leukemií nebo s maligním B lymfomem. CD20 nebo CD22 jsou další antigenní struktury exprimované na povrchu B lymfocytů a CAR-T lymfocyty afinitní k těmto antigenům by napomohly rozpoznat nádorové buňky, u kterých došlo ke ztrátě CD19, a to rozpoznáním znaků CD20 nebo CD22.

Většina CAR-T lymfocytů je připravena z T lymfocytů jednotlivých pa­cientů, čímž se terapie výrazně prodlužuje a finančně prodražuje. Možností je příprava univerzálních CAR-T lymfocytů, u nichž však dochází ke zvýšení rizika vzniku GvHD. Riziko GvHD bylo výrazně sníženo u CAR editovaného pomocí CRISPR-Cas9 do receptorů αβ TCR (tvořen polypeptidovými řetězci α a β) [15], které rozeznávají výhradně antigeny prezentované na povrchu MHC molekul. V probíhající klinické studii (NCT03166878) (schéma 2B^II) jsou testovány CAR-T lymfocyty specifické k CD19 a s vyřazeným TCR. Cílem je zjistit, zda tyto genetické modifikace T lymfocytů sníží riziko vzniku GvHD bez omezení terapeutického účinku u pa­cientů s recidivující B lymfocytární leukemií nebo s maligním B lymfomem. V další probíhající klinické studii (NCT03545815) (schéma 2B^III) jsou testovány CAR-T lymfocyty s CRISPR-Cas9 vyřazeným TCR a PD-1 (nebo CTLA-4), které se specificky vážou k mezotelinu, který je považován za povrchový antigen s vysokou expresí u řady solidních nádorů [16]. Vyřazení PD-1 nebo CTLA-4 (další kontrolní bod imunitního systému) napomáhá utlumit inhibiční mechanizmy imunitního systému a podpořit jeho nabuzení v hostitelském prostředí [17].

Jediná registrovaná in vivo studie (NCT03057912) plánuje využít CRISPR-Cas9 k léčbě cervikálních intraepiteliálních neoplazií (CIN), které mohou vést zejména ke vzniku karcinomu děložního hrdla u žen. Hlavním kauzálním faktorem je infekce vysoce rizikovými lidskými papilomaviry (human papillomavirus –  HPV), nejčastěji HPV16 a HPV18, u nichž v průběhu karcinogeneze dochází ke zvýšené expresi onkoproteinů E6 a E7. Cílem studie je eliminovat HPV přímo uvnitř lidského těla. Ženám ve věku 18– 50 let s lehkou dysplazií (CIN I) a pozitivní HPV infekcí bude 2× týdně po dobu 4 týdnů aplikován na infikovaný čípek gel nesoucí konstrukty CRISPR-Cas9, které byly navrženy tak, aby omezily expresi virových proteinů E6 a E7 a tím zabránily maligní transformaci.

Závěr

Studie týkající se úprav genomu byly prováděny již od 80. let minulého století a byly víceméně neúspěšné. Jednak manipulace s DNA byly ještě do nedávna finančně i technicky náročné, navíc se požadované úseky DNA do genomu začleňovaly náhodně a nebylo možné ovlivnit, zda v cílovém místě dojde k poškození životně důležitého genu nebo nádorového supresorového genu, jehož ztráta by podpořila proces maligní transformace. Technologie editace genů založená na CRISPR-Cas9 se tak ukázala nepostradatelnou pro vědecký pokrok. Je široce využitelná především v základním výzkumu při studiu funkce jednotlivých genů v procesu karcinogeneze. Jako více problematické se jeví využití CRISPR-Cas9 v protinádorové terapii. Je nutno podotknout, že před samotným využitím v klinické praxi bude ještě potřeba provést řadu optimalizací týkajících se účinnosti, bezpečnosti a specifičnosti metody. Budoucnost bude do značné míry záviset na schopnosti vyvinout nové varianty Cas9 stoprocentně specifické k cílové sekvenci a neovlivňující jiné buněčné procesy. V případě manipulace s buněčnými liniemi je možné tolerovat určité procento nespecifických interakcí, pokud však pracujeme s buňkami člověka/ pa­cienta, jde o závažnou komplikaci. Bude nezbytně nutné vylepšit vnesení CRISPR-Cas9 do organizmu v případě terapií in vivo. Nové možnosti se také otevírají v léčbě monogenně podmíněných dědičných chorob. V dnešní době již probíhá řada klinických studií hodnotících protinádorovou terapii založenou na CRISPR-Cas9 modifikacích T lymfocytů pa­cienta ex vivo. Netrpělivě jsou proto očekávány jejich výsledky, které by ujasnily možnosti využití tohoto přístupu v klinické praxi.

Práce byla podpořena projektem MŠMT – NPU I – LO1413.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do bi omedicínských časopisů.

Mgr. Pavlína Zatloukalová, Ph.D.

Regionální centrum aplikované molekulární onkologie

Masarykův onkologický ústav

Žlutý kopec 7

656 53 Brno

e-mail: pavlina.zatloukalova@mou.cz

Obdrženo/Submitted: 4. 6. 2019

Přijato/Accepted: 6. 8. 2019