Molekulárně genetické vyšetření u akutní myeloidní leukemie

Overview

Východiska:
Akutní myeloidní leukemie (AML) je klinicky i molekulárně značně heterogenní onemocnění. Standardně používané konvenční cytogenetické vyšetření a vyšetření FISH (fluorescenční in situ hybridizace) přinášejí významnou informaci o biologické i klinické povaze onemocnění a umožňují rozdělení AML pacientů do tří rizikových skupin. Stanovení prognózy však stále zůstává složité u cca 50 % nemocných s AML, kteří mají normální cytogenetický nález. V poslední dekádě byla u nemocných s cytogeneticky normální AML objevena celá řada rekurentních mutací genů, u kterých byl následně prokázán jejich vliv na prognózu. Objev těchto mutací byl umožněn rychlým vývojem molekulárně biologických metod, zejména metod sekvenování nové generace. Kromě prognostického významu je možné v některých případech využít genové mutace při monitoraci minimální reziduální nemoci v průběhu a po ukončení léčby AML a přestavují také potenciál pro vývoj nové cílené léčby. Důležitost vyšetření genových mutací u nemocných s cytogeneticky normální AML potvrzuje fakt, že WHO klasifikace AML zařadila od roku 2008 přítomnost genových mutací u cytogeneticky normální AML do definice několika samostatných jednotek.

Cíl:
V této práci přinášíme přehled nejvýznamnějších mutací genů, které prokazujeme u nemocných s cytogeneticky normální AML, popisujeme jejich význam pro prognózu nemocných, jejich význam při sledování minimální reziduální nemoci a jejich potenciál pro vývoj nové cílené léčby. Dále je stručně popsán význam akumulace genových mutací při klonálním vývoji onemocnění a zásadní vliv tohoto fenoménu při relapsu AML.

Klíčová slova:
akutní myeloidní leukemie – genetika – mutace – prognóza – minimální reziduální nemoc – klonální vývoj

Úvod

Akutní myeloidní leukemie (AML) je klonální onemocnění krvetvorby charakterizované přítomností proliferujících, abnormálně diferencovaných buněk hematopoetického systému v kostní dřeni, periferní krvi a případně extramedulárních tkáních.

Standardní diagnostické postupy pro klasifikaci AML v současné době zahrnují nejen morfologické hodnocení nátěru periferní krve i kostní dřeně a analýzu povrchových nebo cytoplazmatických markerů pomocí průtokové cytometrie, ale také identifikaci chromozomálních změn pomocí metod konvenční cytogenetiky nebo metody FISH (fluorescenční in situ hybridizace) a vyšetření mutačního stavu vybraných molekulárních markerů.

Již od 90. let minulého století je známo, že cytogenetické aberace jsou spojeny s různým průběhem onemocnění. Na základě výsledků cytogenetického vyšetření byla v roce 1998 vytvořena první kategorizace AML do rizikových skupin dle Grimwade (tab. 1) [1]. Zařazení AML do rizikové skupiny má důležitý význam pro stanovení prognózy onemocnění a výběr vhodné léčebné strategie. Stanovení individuálního rizika onemocnění umožňuje vyčlenit skupinu nemocných s vysokým rizikem relapsu (RR) onemocnění, kteří benefitují z provedení alogenní transplantace v rámci 1. léčebné linie, a naopak skupinu nemocných s nízkým RR, u kterých alogenní transplantaci krvetvorby v rámci 1. léčebné linie standardně neprovádíme z důvodu vysoké morbidity a mortality spojené s touto vysoce intenzivní léčebnou metodou. Z cytogenetických aberací hrají základní roli v leukemogenezi rekurentní chromozomální strukturní variace, např. t (15; 17), t (8; 21), inv (16), t (16; 16), t (9; 21), t (9; 11), del5, del7, které jsou již zavedenými diagnostickými a prognostickými  markery.

Problém pro stanovení prognózy přestavuje značně heterogenní skupina pacientů s cytogeneticky normální AML (CN-AML). Do této skupiny spadá 40–50 % pacientů. Je proto vyvíjena snaha o hledání dalších faktorů, které umožní lepší stratifikaci CN-AML a definují skupinu nemocných, kteří budou profitovat z intenzifikace terapie a provedení alogenní transplantace krvetvorných buněk v 1. léčebné linii. Kromě klinických prognostických faktorů, jako je přítomnost hyperleukocytózy či nedostatečná blastoredukce při časném hodnocení v průběhu první indukční terapie, hrají důležitou roli v prognostické stratifikaci molekulárně genetické markery.

Etiopatogenetickým podkladem pro vznik AML je kumulace mutací v genech, které hrají významnou roli v regulaci dělení a diferenciace hematopoetických buněk. Typ mutací a jejich komplexnost ovlivňuje klinický průběh onemocnění a odpověď na léčbu. Význam komplexnosti mutačního stavu hematopoetické buňky dokládají v recentní práci Wakita et al, kteří analyzovali přítomnost 28 různých mutací u 271 pacientů s AML v souvislosti s jejich prognózou [2]. Bylo prokázáno, že u mladších nemocných ve středním cytogenetickém riziku je celkové přežití (overall survival – OS) významně sníženo v případě přítomnosti tří a více mutací genů (5leté OS 18,1 vs. 45,9 %; p = 0,0006), a to i ve skupině nemocných s FLT3-ITD negativitou (5leté OS 28,3 vs. 63,2 %; p = 0,001). Předpokládá se tedy, že vyšší počet mutací je znakem vysoké genetické nestability, která souvisí s horší odpovědí choroby na léčbu.

Význam molekulárně genetického vyšetření u nemocných s AML dokládá také ta skutečnost, že mutace v genech NPM1 a CEBPA jsou od roku 2008 součástí klasifikace AML dle Světové zdravotnické organizace (WHO) [3] a spolu s mutacemi ve FLT3 jsou začleněny do prognostické klasifikace AML dle European LeukemiaNet (ELN) z roku 2010 (tab. 2) [4]. Při recentní revizi WHO klasifikace v roce 2016 byla přidána rovněž provizorní kategorie AML s mutací v genu RUNX1 [5].

Díky značnému poklesu ceny a automatizaci většiny kroků analytického postupu se široce rozšířily ve výzkumných i rutinně diagnostických laboratořích nové genomické metodické přístupy založené zejména na sekvenování nové generace. V rámci rozvoje celogenomového sekvenování byly v posledním desetiletí zjištěny další rekurentní somatické mutace, jejichž prognostický význam je intenzivně studován. Velkým přínosem je naprosto nový pohled na spektrum a frekvenci mutací, jejich kooperaci nebo vzájemnou výlučnost. Umožňují navíc sledovat skladbu buněčných subklonů a klonální evoluci v průběhu onemocnění.

Genomický pohled na AML

Leukemogeneze AML je vícekrokový proces, který vyžaduje spolupráci nejméně dvou tříd mutací [6,7]. Mutace třídy I aktivují dráhy signální transdukce a dávají proliferační výhodu hematopoetickým buňkám (např. mutace vedoucí k aktivaci tyrozinkinázových receptorů FLT3, c-kit a Ras), mutace třídy II ovlivňují transkripční faktory a poškozují hematopoetickou diferenciaci (např. rekurentní chromozomální aberace t (8; 21), inv (16), t (15; 17), které generují fúzní transkripty RUNX1T1, CBFB/MYH11 a PML/RARA, a rovněž mutace v genech RUNX1, CEBPA a MLL. Konsekvence mutací v dalších genech asociovaných s AML jako DNMT3A, TET2, IDH1, IDH2, NPM1, ASXL1 nejsou dosud známy. Bývají nalezeny obvykle u CN-AML (tab. 3).

Klonální evoluce u AML

Celogenomové sekvenování u pacientů s AML ukázalo, že klonálně odvozená hematopoetická buňka akumuluje obrovský počet mutací v závislosti na věku, avšak naprostou většinu těchto mutací lze považovat za náhodné benigní události. Tyto mutace byly tedy zřejmě přítomny již v hematopoetické buňce, která byla transformována iniciující (driver) mutací [8]. Mnohé studie prokazují, že většina případů AML je charakterizována klonální heterogenitou v době diagnózy, s přítomností jak zakládajícího klonu, tak alespoň jednoho subklonu [9]. Byla publikována různá schémata klonální evoluce, která se mohou skrývat za relapsem onemocnění a být příčinou jeho rezistence [10–13]. Základní model uvádí dvě možné situace: 1. zakládající klon získává mutace a vyvíjí se v relabující klon; 2. subklony s různými mutacemi se vyskytují mezi zakládajícími klony a jeden ze subklonů z této populace expanduje v relaps [10]. U pacientů v morfologické remisi může pokračovat klonální hematopoéza těch klonálních populací, které jsou blízce příbuzné klonu zakládajícímu. Zároveň však byla pozorována expanze hematopoetické populace, která nebyla příbuzná s iniciální AML, ale nesla mutace v genech často mutovaných u AML a myelodysplastického syndromu (MDS). Tyto mutace bylo možné detekovat ve velmi nízkých frekvencích již v době diagnózy AML. Výsledky podporují hypotézu, že neleukemické hematopoetické kmenové a progenitorové buňky, které nesou určité mutace, mohou získat kompetitivní výhodu díky perzistenci těchto mutací během i po ukončení indukční chemoterapie [14]. Cytoredukční chemoterapie tak působí selekčním tlakem na leukemickou i neleukemickou hematopoetickou populaci [10,15].

V rámci Cancer Genome Atlas (TCGA) Research Network byly analyzovány genomy 200 pacientů a téměř v každém vzorku byla nalezena jedna potenciální driver mutace, která poskytuje hematopoetické progenitorové buňce růstovou výhodu vedoucí ke klonální expanzi [9]. Signifikantně mutované geny, které jsou relevantní pro patogenezi, byly organizovány do devíti funkčních kategorií – fúze transkripčních faktorů (18 % případů), NPM1 (27 %), tumor-supresorové geny (16 %), geny vztahující se k DNA metylaci (44 %), signální geny (59 %), geny modifikující chromatin (30 %), geny pro myeloidní transkripční faktory (22 %), geny pro kohezinový komplex (13 %) a geny pro komplex spliceozomu (14 %). Systém vzájemné spolupráce a výlučnosti mezi mutačními událostmi v těchto genech pak pravděpodobně přispívá k patogenezi AML u konkrétního pacienta.

Sekvenování nové generace a prognostická klasifikace  CN AML

Nejvýznamnějším prognostickým parametrem byly dosud rekurentní cytogenetické aberace [16]. Předmětem intenzivního výzkumu je nyní hodnocení molekulárně genetických lézí jako prognostických a prediktivních markerů [17–19]. V současné době jsou na základě doporučení ELN v klinické praxi používány tři molekulární markery (NPM1, CEBPA a FLT3-ITD) [4]. V budoucnu je očekáváno zařazení dalších markerů (např. RUNX1, ASXL1 a TP53), které byly opakovaně asociovány s horší prognózou, přičemž prognostický význam dalších často mutovaných genů (např. DNMT3A, IDH1, IDH2, TET2) je stále nejasný.

FLT3

FLT3 je buněčný receptor s tyrozinkinázovou aktivitou patřící do stejné skupiny receptorů jako je c-kit nebo PDGF-R. FLT3 protein hraje důležitou roli v dělení a diferenciaci myeloidních buněk. Nejčastější mutací genu FLT3 je interní tandemová duplikace (FLT3-ITD), která je prokazována u 20–30 % případů AML [20,21]. Mutace vede k trvalé aktivaci kinázové domény FLT3 receptoru a následné poruše diferenciace myeloidních buněk a jejich leukemické transformaci. Druhou méně častou mutací genu FLT3 je bodová mutace v aktivační smyčce druhé tyrozinkinázové domény (FLT3-TKD). Tato mutace je prokazována u 5–8 % případů AML [6,22,23]. Obě tyto mutace v genu pro FLT3 jsou asociovány s vyšším počtem leukocytů, nižším počtem trombocytů a vyšším zastoupením blastů v kostní dřeni v době diagnózy. Relativně častěji je mutovaný gen FLT3 prokazován u akutní monocytární leukemie (AML FAB M5), a to cca ve 40 % případů. Častěji je přítomen u CN-AML ve srovnání s AML s cytogenetickou abnormalitou [22]. Mutace FLT3-ITD je také často asociována s t (6; 9) (88–90 %) a MLL-PTD. Kooperativní mutace byly nalezeny také u FLT3-TKD a CBFB/MYH1 [7].

Mutace v genu FLT3 mají jasně prokázaný negativní prognostický význam. Pravděpodobnost dosažení kompletní remise (complete remission – CR) onemocnění po indukční terapii není sice mutací FLT3 ovlivněna, četnost CR u mladších nemocných je v případě FLT-ITD negativity 66,8 % a v případě FLT3-ITD pozitivity 71,2 %. Mutace FLT3 jsou však spojeny s významně vyšším RR onemocnění. OS pacientů s CN-AML s mutací FLT3-ITD nebo TKD je tak horší oproti nemocným bez přítomnosti těchto mutací. Na OS nemocných má kromě samotné přítomnosti mutace FLT3 vliv alelický poměr FLT3 mutovaného/nemutovaného genu (FLT3 mutant/wt). Bylo prokázáno, že nemocní s mutací NPM1 a současnou mutací FLT3 s nízkým alelickým poměrem FLT3 mutant/wt mají stejně dobrou prognózu jako nízce rizikoví CN-AML nemocní s mutací NPM1 bez mutace FLT3 (5leté OS 47 ± 10 vs. 56 ± 5 %; p = nesignifikantní). Oproti tomu nemocní s mutací NPM1 a vysokým alelickým poměrem FLT3 mutant/wt mají OS významně zkrácené (5leté OS 29 ± 7 vs. 56 ± 5 %; p = 0,017). Prognóza pacientů s nízkým alelickým poměrem FLT3 mutant/wt a nemutovaným genem NPM1 je spojena s vyšší pravděpodobností relapsu onemocnění a horším OS (5leté RR 74 ± 20 vs. 48 ± 6 %; p = 0,017; 5leté OS 20 ± 12 vs. 39 ± 6 %; p = 0,014) [24].

Provedení alogenní transplantace krvetvorné tkáně (hematopoietic stem cell transplantation – HSCT) v rámci 1. léčebné linie snižuje RR onemocnění a vede k prodloužení OS u nemocných s mutací NPM1 a vysokým alelickým poměrem FLT3 mutant/wt (5leté RR 20 ± 13 vs. 80 ± 9 %; p = 0,014; 5leté OS 22 ± 10 vs. 70 ± 14 %; p = 0,03) (tab. 4). Naopak z provedení alogenní HSCT v 1. CR nebenefitují pacienti s mutací NPM1 bez mutace FLT3 (5leté RR 35 ± 7 vs. 20 ± 11 %; p = 0,49; 5leté OS 64 ± 7 vs. 79 ± 11 %; p = 0,296) a také nemocní s mutací NPM1 s nízkým alelickým poměrem FLT3 mutant/wt (5leté RR 22 ± 15 vs. 19 ± 20 %; p = 0,566; 5leté OS 67 ± 16 vs. 56 ± 17 %; p = 0,873). Pacienti s cytogeneticky normální AML bez přítomnosti mutace NPM1 obecně profitují z provedení alogenní HSCT v rámci 1. léčebné linie. Alogenní HSCT snižuje 5leté RR u pacientů s NPM1 wt a FLT3-ITD (5leté RR 42 ± 14 vs. 100 %; p = 0,00016) a také u pacientů s NPM1 wt a FLT3 wt (5leté RR 25 ± 10 vs. 45 ± 7 %; p = 0,08) [24].

FLT3-ITD je nestabilní prognostický marker – až u 30 % pacientů, kteří nesli tuto mutaci při diagnóze choroby, byla pozorována ztráta nebo změna počtu tandemových duplikací v době relapsu [24].

NPM1

Nukleofosmin je fosfoprotein, který plní úlohu molekulárního chaperonu a transportního proteinu. NPM1 se uplatňuje v různých buněčných procesech – při biogenezi ribozomů, zdvojení centrozomu, reparaci DNA a odpovědi na buněčný stres, ovlivňuje funkci p53 a p19. NPM1 wt chrání hematopoetické buňky před apoptotickými účinky p53 v podmínkách buněčného stresu. Existuje více než 40 různých variant mutací, přičemž nejčastější je inzerce 4 bp v exonu 12 způsobující aberantní delokalizaci proteinu z jádra do cytoplazmy. Buňky jsou následně citlivější k buněčnému stresu vyvolanému chemoterapií, což znamená lepší  prognózu [25].

Mutace NPM1 je nejčastější mutací u pacientů s AML (25–30 %) a je prokazována cca u 45–60 % pacientů s CN-AML mladších 60 let [26]. Nemocní s CN-AML a mutací NPM1 bez přítomnosti jiné mutace lépe odpovídají na indukční chemoterapii a mají významně nižší RR onemocnění po ukončení léčby. Nejlepší léčebná odpověď na indukční terapii byla u nemocných s mutací NPM1 a nemutovaným FLT3 (86 %), následovala skupina nemocných s nemutovaným NPM1 a mutací FLT3-ITD (76 %), ve skupině s nemutovaným NPM1 i FLT3 byla odpověď na indukci 68,5 % a nejnižší pravděpodobnost dosažení CR onemocnění po indukci byla pozorována ve skupině se současnou mutací NPM1 a FLT3-ITD (63 %)  [27,28]. Na základě těchto poznatků současná prognostická klasifikace dle ELN z roku 2010 zařazuje CN-AML s mutací NPM1 bez mutace FLT3 či DNMT3A do nízce rizikové skupiny, u které není v rámci 1. léčebné linie doporučeno provedení alogenní transplantace krvetvorných buněk [4].

CEBPA

Gen CEBPA kóduje myeloidní transkripční faktor. Je mutovaný u přibližně 10 %  CN-AML a může se vyskytnout také současně s chromozomálními aberacemi, např. del (9q) a vzájemně se vylučují s balancovanými chromozomálními přestavbami [29]. V genu CEBPA se u AML vyskytují zejména dva typy mutací – 33 bp inzerce na C-konci, která zasahuje oblasti, které se podílejí na dimerizaci proteinu a jeho vazbě na DNA, a frameshift delece na N-konci s důsledkem zkrácené formy proteinu [30]. Výskyt obou těchto mutací v bialelické formě se vyskytuje u více než poloviny pacientů s prokázanou mutací CEPB a slouží jako příznivý prognostický faktor s nevýznamně delším OS a významně nižším výskytem relapsu. Pouze jedna mutace je přitom spojována s horší prognózou. Tento biologický paradox dosud nebyl zcela objasněn [31,32].

Mutace v epigenetických regulátorech

Epigenetické regulátory zodpovídají za regulaci transkripce prostřednictvím dvou hlavních mechanizmů – metylace DNA (enzymy kódované geny DNMT3A, IDH1, IDH2 a TET2) a modifikace histonů (ASXL1). Výsledky studií zabývajících se klonální evolucí podporují hypotézu, že mutace v genech, které jsou zahrnuty v epigenetické regulaci (tj. DNMT3A, ASXL1, IDH1, IDH2 a TET2), jsou přítomny již v preleukemické hematopoetické kmenové buňce a objevují se velmi časně ve vývoji AML [10,11,33]. Tyto původní preleukemické kmenové buňky jsou schopny diferenciace do více linií, dokáží přežít chemoterapii a expandovat během remise až k rozvoji potenciálního relapsu. Současné studie ukazují, že klonální hematopoéza se somatickými mutacemi, obvykle v genech DNMT3A, TET2 a ASXL1, vzrůstá spolu s věkem a je asociována se zvýšeným rizikem rozvoje hematologické malignity [34]. Prognostický význam těchto mutací však nebyl jednoznačně stanoven.

DNMT3A

DNMT3A patří mezi DNA metyltransferázy, které katalyzují adici metylové skupiny na cytozinové zbytky CpG dinukleotidů. Funkční experimenty ukazují, že ztráta DNMT3A (DNA metyltransferáza 3 alfa) poškozuje diferenciaci hematopoetických buněk a působí zvýšenou akumulaci těchto buněk v kostní dřeni [35]. Mutace v DNMT3A nejčastěji (60–64 %) postihují arginin R882 a způsobují redukovanou aktivitu enzymu způsobující globální hypometylaci [36,37]. Ostatní méně časté mutace se nacházejí po celém genu, především v exonech 13–23. Zahrnují missense, nonsense, frameshift a mutace měnící místo sestřihu a jsou obvykle heterozygotní. Různé typy mutací mohou mít různý dopad na funkci enzymu. Delece DNMT3A v myších modelech vede k inhibici diferenciace hematopoetických kmenových buněk, avšak samotný deficit tohoto genu nevede ke vzniku AML. Zdá se tedy, že pro vznik AML je nutný vznik další tzv. driving mutace v jiných genech.

Mutace v genu DNMT3A jsou prokazovány u 17–20 % nemocných s AML, ve skupině pacientů s normálním cytogenetickým nálezem je prokazována až ve 27–30 % případů [38–40]. Jedná se tak o třetí nejčastější prokazovanou mutaci u nemocných s AML. Mutace DNMT3A je spojena s vyšším věkem nemocných, vyšším počtem leukocytů a krevních destiček v periferní krvi v době diagnózy. Významně častěji je prokazována u nemocných se současnou mutací genu NPM1, IDH1/2 nebo mutací FLT3-ITD. Asociace mutace DNMT3A je silná zejména v případě mutace NPM1, až 80 % pacientů s mutací DNMT3A má současně přítomnou mutaci NPM1.

Z hlediska prognostického významu mutace DNMT3A jsou výsledky jednotlivých klinických studií diskrepantní. V původní práci Thol et al z roku 2011 bylo prokázáno signifikantně horší přežití nemocných s mutací DNMT3A a současnou mutací NPM1 a FLT3-ITD oproti těmto pacientům s nemutovaným genem DNMT3A  (medián OS 12,3 vs. 41,1 měsíce; p < 0,0001)  [38,39]. Ve stejné práci však nebyl prokázán vliv mutace DNMT3A na OS nízce rizikových pacientů s mutací NPM1 bez FLT3-ITD. Tyto výsledky nekorelují s dosud nejrozsáhlejší prací Gaidzik et al, ve které vliv mutace na OS a dobu do relapsu u CN-AML prokázán nebyl [41]. Gale et al vysvětlují diskrepantní výsledky tzv. Simpsonovým paradoxem, který je dán vysokou koincidencí mutace DNMT3A s prognosticky příznivou mutací NPM1 [37]. Aby mohl být tedy ukázán negativní prognostický význam mutace DNMT3A, musí být výsledky stratifikovány podle NPM1 genotypu. Pokud hodnotíme skupinu CN-AML pacientů jako celek, nebyl prokázán vliv mutace DNMT3A na OS pacientů (p = 0,7). Pokud rozdělíme nemocné na dvě skupiny podle přítomnosti či nepřítomnosti mutace NPM1, byl v obou těchto skupinách prokázán negativní prognostický vliv mutace DNMT3A na OS nemocných. Mutace DNMT3A je tedy obecně považována za negativní prognostický marker u nemocných s AML.

V rámci optimalizace dávek daunorubicinu u standardní indukční terapie 3 + 7 bylo prokázáno, že nemocní s mutací DNMT3A výrazně více profitují z podání vyšší dávky daunorubicinu oproti jiným geneticky definovaným skupinám [38,39].

IDH1, IDH2

IDH1 a IDH2 kódují NADP-dependentní izocitrát-dehygrogenázy, které katalyzují oxidativní dekarboxylaci izocitrátu na 2-oxoglutarát v citrátovém cyklu. Mutace v IDH1 a IDH2 jsou hemizygotní, způsobující v IDH1 záměnu argininu R132 a v IDH2 argininu R172 nebo R140 [42]. Nové mutace byly nalezeny pomocí masivního paralelního sekvenování zejména u CN-AML jak v IDH1 [43], tak IDH2 [44]. IDH1 a IDH2 se uplatňují především v buněčném metabolizmu a syntéze lipidů, v ochraně buňky před oxidativním stresem [45]. IDH1 a IDH2 způsobují aberantní hypermetylaci a potvrdila se vzájemná výlučnost mutací v IDH1 a IDH2 a v TET2 [46,47].

Mutace genů IDH1 a IDH2 byla prokázána u 7,6, resp. u 8,7 % nemocných s AML [42]. Je asociována s vyšším věkem nemocných (p = 0,002), s nižším počtem leukocytů (p = 0,04) a vyšším počtem trombocytů v době diagnózy (p = 0,007). Mutace IDH1 a IDH2 je častěji prokazována u nemocných s CN-AML, zejména u nemocných s mutovaným NPM1 bez FLT3-ITD (p < 0,001). Asociace s mutací NPM1 neplatí pro mutaci IDH2 v kodonu 172. Mutovaný IDH1 zároveň silně asociuje s MLL-PTD [48].

Význam mutace IDH1 a IDH2 pro určení prognózy není zcela jasně definován, výsledky jednotlivých prací se liší. Paschka et al ve své práci neprokazují vliv mutace na dosažení remise onemocnění po indukční terapii [42]. Negativní vliv mutace IDH1 a IDH2 na OS byl v jeho práci prokázán pouze ve skupině nemocných s CN-AML s mutovaným NPM1 bez mutace FLT3-ITD (5leté OS 41 vs. 65 %; p = 0,03). Pokud hodnotíme skupinu nemocných s CN-AML jako celek, nebyl vliv mutace IDH1 a IDH2 na OS nemocných prokázán. Patel et al naopak u nemocných s AML ve středním cytogenetickém riziku prokázali významně lepší 3leté OS nemocných, kteří byli nositeli mutace NPM1 a současně mutace IDH1 a IDH2, ve srovnání s nemocnými, kteří měli mutovaný pouze NPM1 bez IDH1 a IDH2 (3leté OS 89 vs. 31 %; p < 0,001) [49]. V tomto srovnání však nebyl brán v potaz negativní vliv mutace FLT3-ITD na OS nemocných. Analýza jednotlivých geneticky definovaných podskupin v práci Patel et al potvrdila negativní prognostický význam mutace IDH2 v kodonu 172 na OS nemocných ve středním riziku, což je pravděpodobně dáno malou asociací této konkrétní mutace s mutací genu  NPM1.

TET2

Enzym TET2 je dioxygenáza, která dokáže konvertovat 5-metylcytozin (5-mC)  na 5-hydroxymetylcytozin (5-hmC), který je meziproduktem DNA demetylace [50]. Pacienti nesoucí mutaci v TET2 jsou tedy charakterizováni hypermetylovaným fenotypem s místně specifickou metylací cytozinu cílových genů a zároveň poklesem 5-hmC. Pokles 5-hmC je tedy pravděpodobně průvodním jevem stárnutí hematopoetického systému, na němž se podílí právě mutace v TET2. Ztráta TET2 vyvolává vzrůstající sebeobnovu hematopoetických kmenových buněk a kompetitivní růstovou výhodu [51].

Mutace genu TET2 jsou prokazovány v 7–13 % případů AML. Tato mutace je asociována s vyšším věkem nemocných, vyšším počtem leukocytů a nižším počtem trombocytů v době diagnózy. Častěji je také prokazována u nemocných s mutací NPM1, CEPBA a ASXL1 [46].  Naopak mutace TET2 není téměř nikdy prokazována u nemocných s mutovaných IDH1/2.

Prognostický vliv mutace TET2 je nejasný. Chou et al prokázali negativní prognostický význam a horší OS nemocných s mutací TET2 ve středním cytogenetickém riziku (medián OS – medián OS nebyl dosažen vs. 14,7 měsíce; p = 0,021) [52]. Silná asociace mutace TET2 s horším OS byla pozorována zejména ve skupině pacientů s FLT3-ITD pozitivitou (medián OS 5,0 vs. 16,9 měsíce; p = 0,001) a ve skupině pacientů s nemutovaným NPM1 (medián OS 12,3 vs. 61,0 měsíce; p = 0,055). Tyto výsledky však nebyly potvrzeny v práci Gaidzik et al, která neprokázala žádný vliv mutace TET2 na OS nemocných s AML, a to ani ve skupině nemocných ve středním cytogenetickém riziku či s normálním cytogenetickým nálezem [53]. Do této práce však byli zahrnuti pouze mladší nemocní do 60 let, což z důvodu asociace mutace TET2 s vyšším věkem nemocných pravděpodobně ovlivnilo  výsledky.

Chou et al dále dokládají nevhodnost mutace TET2 pro sledování minimální reziduální nemoci v průběhu a po ukončení léčby. Mezi 13 pacienty, kteří byli vstupně TET2 pozitivní a u kterých došlo po ukončení léčby k relapsu  onemocnění, šest pacientů ztratilo při relapsu onemocnění původní mutaci  TET2 [52].

ASXL1

ASXL1 (aditional sex comb-like 1) patří do rodiny Polycomb proteinů podílejících se na regulaci remodelace chromatinu. Ve spolupráci s HP1 ovlivňuje metylaci histonů prostřednictvím regulace aktivity demetylázy LSD1 [54]. Funkce ASXL1 v hematopoéze je však dosud nejasná. Mutace v genu ASXL1 byly nalezeny u chronické myelomonocytární leukemie (CMML), MDS, sekundárních AML, které se vyvinuly z CMML, i de novo AML [55,56].

Mutace ASXL1 jsou typu delecí nebo bodových mutací. Jejich výskyt u pacientů s AML je 9–18 % [57–59]. U nemocných se středně rizikovou AML je mutace ASXL1 asociována s mužským pohlavím (23,5 vs. 9,9 %; p < 0,001), s vyšším věkem nemocných (medián 71,8 vs. 61,8; p < 0,001). Mutace je významně častěji prokazována u nemocných s mutací RUNX1, naopak její přítomnost negativně koreluje se současnou přítomností mutací NPM1, FLT3-ITD, FLT3-TKD a DNMT3A. Významně častěji je mutace ASXL1 prokazována u AML s trizomií chromozomu 8 (52,7 %) [58].

Mutace ASXL1 je spojena s výrazně horší prognózou pacientů s AML. Bylo prokázáno významně zkrácené OS nemocných se středně rizikovou AML (medián OS 11,0 vs. 62,2 měsíce; p < 0,001) [57]. Zkrácení OS bylo prokázáno ve všech geneticky definovaných rizikových a věkových skupinách.  Mutace ASXL1 je tedy považována za významný negativní prognostický marker u nemocných s AML a pacienti s touto mutací by měli být směřování k provedení alogenní HSCT v rámci léčby 1. linie.

Závěr

Hledání nových molekulárně genetických markerů u nemocných s AML je důležité pro stanovení individuálního léčebného přístupu, zejména u nemocných ve středním cytogenetickém riziku. Z důvodu vysoké peritransplantační morbidity a mortality je nutné vyčlenit skupinu nemocných, kteří v rámci 1. léčebné linie neprofitují z provedení alogenní transplantace. Metody celogenomového sekvenování umožnily prokázat celou řadu mutací genů, které hrají významnou roli v patogenezi AML a mají význam pro prognostickou stratifikaci. Kromě prognostického významu představují mutované geny také potenciál pro vývoj nové cílené léčby. V rámci klinických studií jsou v současné době hodnoceny inhibitory FLT3, IDH1 a IDH2. Nové terapeutické přístupy jsou z důvodu neuspokojivé prognózy nemocných s AML vysoce očekávány.

Velké klinické studie prokázaly příznivý vliv na OS nemocných pouze u mutace genu NPM1 a bialelické mutace CEBPA, naopak jasně negativní vliv na prognózu má mutace genu FLT3 a DNMT3A.  Mutace NPM1, FLT3-ITD a DNMT3A se na pracovišti Interní hematologické a onkologické kliniky (IHOK) FN Brno rutinně vyšetřují u všech nemocných s nově diagnostikovanou AML, u kterých je plánováno zahájení intenzivní terapie. Z důvodu velmi nízké incidence bialelické mutace CEBPA se tato mutace standardně nevyšetřuje. Z nových molekulárně genetických markerů je negativní prognostický význam prokázán pouze u mutace ASXL1, která rovněž z důvodů nízké incidence není na IHOK vyšetřována. U ostatních markerů jsou výsledky jednotlivých prací diskrepantní a jejich prognostický význam není zcela jasně definován.

Tato práce byla podpořena programovým projektem MZ ČR s reg. č. 15-25809A a z projektu Masarykovy univerzity, Brno MUNI/A/1028/2016.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

MUDr. Lukáš Semerád

Interní hematologická a onkologická klinika

LF MU a FN Brno

Jihlavská 20

625 00 Brno

e-mail: lukas.semerad@fnbrno.cz

Obdrženo: 8. 9. 2016

Přijato: 30. 9. 2016