Molekulární prognostické markery chronické lymfocytární leukemie a jejich klinický význam

Overview

Chronická lymfocytární leukemie je nejčastější typ leukemie v západním světě postihující zejména starší dospělé osoby. Navzdory stále se zdokonalující léčbě zůstává z důvodu značné biologické i klinické variability nadále nevyléčitelným onemocněním. Patogeneze chronické lymfocytární leukemie není dodnes plně objasněna, nicméně velkou roli hrají antigenní stimulace, narušená apoptóza a vliv mikroprostředí. Mezi nejvýznamnější molekulární prognostické faktory s jasným klinickým dopadem patří mutační stav genů pro těžký řetězec imunoglobulinů (IGHV), cytogenetické aberace a mutace genů TP53 a ATM. Zavedení nových sekvenačních technologií umožnilo v posledních letech zpřesnění analýzy stávajících i detekci nových potenciálních prognostických markerů chronické lymfocytární leukemie. Významnými kandidáty jsou mutace genů SF3B1, NOTCH1 a BIRC3, jejichž klinický dopad je předmětem intenzivního výzkumu. V neposlední řadě jsou nadále studovány také další mechanizmy patogeneze chronické lymfocytární leukemie, mezi něž patří deregulace signalizace přes B buněčný receptor a regulace genové exprese pomocí microRNA. Přesná charakterizace molekulárních abnormalit je klíčová pro lepší rozdělení rizikových skupin pacientů s chronickou lymfocytární leukemií, kteří mohou profitovat z nových terapeutických přístupů.

Klíčová slova:
chronická lymfocytární leukemie –  biologické markery –  chromozomální aberace –  mutace –  prognóza

Úvod

Chronická lymfocytární leukemie (CLL) patří mezi nízce maligní lymfoproliferativní onemocnění, které je zpravidla charakterizováno akumulací zralých monoklonálních B lymfocytů s typickým imunofenotypem (CD5, CD19, CD20 a CD23) v periferní krvi, kostní dřeni a lymfatických orgánech [1]. Díky velmi variabilnímu klinickému průběhu choroby a absenci kauzální genové aberace není prozatím u CLL dostupná univerzální účinná léčba. Nicméně byla popsána celá řada klinicko‑biologických faktorů, které přispívají k objasnění patogeneze CLL a stanovení prognózy pacientů (tab. 1). Zdá se, že mezi hlavní molekulární mechanizmy patří vliv mikroprostředí podílející se na antigenní stimulaci B buněčného receptoru (B-cell receptor – BCR) a vnitrobuněčná akumulace genetických defektů (obr. 1) [2,3]. Významná role antigenu ve vývoji CLL je podpořena existencí pozměněného repertoáru genů pro těžký řetězec imunoglobulinů (IGHV) při srovnání s fyziologickými B lymfocyty a rovněž také faktem, že někteří pacienti využívají sekvenčně identický, tzv. stereotypní BCR [4– 6]. Objev cytogenetických a molekulárně‑genetických markerů výrazně napomohl objasnění heterogenity biologického pozadí CLL. Dle klasického Döhnerova modelu [7] lze podle přítomnosti cytogenetických abnormalit určit prognózu, která je nejhorší v případě delece 17p (del(17p)), následované delecí 11q (del(11q)). Nedávno publikované výsledky celogenomového a exomového sekvenování ukázaly, že kromě známých nádorových supresorů TP53 a ATM jsou u CLL rekurentně mutovány i další geny, jako je SF3B1, NOTCH1 a BIRC3, které mohou přispívat k horší prognóze pacientů [8– 11]. Přítomnost určitých molekulárních lézí odráží klinickou fázi a rovněž klonální evoluci choroby, kdy např. premaligní léze známá jako monoklonální B lymfocytóza (MBL) je charakterizována nízkým počtem abnormalit, zatímco agresivní CLL nebo tzv. Richterův syndrom (RS) jsou spojovány s akumulací závažných genetických defektů [12– 14]. V následujícím textu bychom rádi shrnuli poznatky o molekulární podstatě patogeneze a klonální evoluci CLL s důrazem na význam klasických i nových molekulárních prognostických markerů pro klinickou praxi.

Prognostické faktory asociované s deregulací BCR signalizace

BCR receptor na povrchu lymfocytů hraje velice významnou fyziologickou úlohu v rozpoznávání antigenu a spouštění signální kaskády, která je nezbytná pro přežití a proliferaci jak normálních, tak i maligních B lymfocytů. Základní komponentou tohoto receptoru je membránový imunoglobulin, jehož struktura zahrnující preferenční využívání určitých typů subgenů pro těžký řetězec (např. VH3- 21, VH1- 69) hraje významnou roli v patogenezi CLL. Přítomnost somatických mutací v genech pro IGHV je jedním ze základních prognostických markerů, který umožňuje rozlišení dvou skupin pa­cientů s jasně odlišnými klinicko‑biologickými rysy. V případě mutovaného IGHV (M‑ CLL) dochází k vývoji CLL až po reakci B lymfocytu s antigenem, který prošel germinálním centrem lymfatické uzliny. Naopak leukemické buňky s nemutovaným IGHV (U‑ CLL) se s antigenem sice setkaly, ale nebyly po této reakci podrobeny procesu somatické hypermutace (obr. 1). Hranice pro U‑ CLL byla stanovena arbitrárně a odpovídá více než 98% sekvenční homologii s genem zárodečné linie [15]. Tito pacienti mají vyšší frekvenci nepříznivých genových abnormalit a celkově výrazně horší prognózu než pacienti s mutovaným IGHV, kteří vykazují významně delší celkové přežití (overall survival – OS) (tab. 1) [4,5]. Zvláštní případ pak reprezentuje genový segment VH3- 21, jehož přítomnost v leukemickém klonu představuje nepříznivou prognózu bez ohledu na jeho mutační stav [16]. V posledních letech se objevil další fakt podporující význam antigenní stimulace při vývoji a progresi CLL. Bylo zjištěno, že asi 30 % CLL pacientů využívá určitý typ tzv. stereotypního BCR receptoru, který je charakteristický identickou sekvencí VH CDR3 oblasti (variable heavy complementarity‑ determining region 3) imunoglobulinu (tzv. subset) pro danou skupinu nepříbuzných pa­cientů [6,17]. Tito pa­cienti vykazují výrazně rozdílné genetické pozadí a také celkový průběh choroby. Například pacienti ze subsetu #2 využívající stereotypní VH3- 21 mají nepříznivou prognózu bez ohledu na mutační stav genů IGHV a byla u nich prokázána vyšší frekvence výskytu SF3B1 mutací a poškození p53 dráhy [18,19]. Celkově tedy tato nedávná pozorování naznačují, že vývoj CLL je pravděpodobně řízen vysoce specifickou antigenní selekcí B lymfocytů spojenou se získáváním určitých genetických defektů.

Další prognostické markery zapojené do BCR signalizace jsou molekuly ZAP‑ 70 a CD38, jejichž vyšší úroveň exprese je asociována s U‑ CLL a tedy agresivnějším průběhem onemocnění [5,20]. ZAP‑ 70 (zeta asociovaný protein) je tyrozinkináza, která se fyziologicky vyskytuje v T lymfocytech a také v různých vývojových stadiích normálních i maligních B lymfocytů [21]. Při studiu CLL bylo prokázáno, že vysoká hladina ZAP‑ 70 moduluje BCR signalizaci a přispívá k nutnosti dříve zahájit terapii [22]. CD38 je transmembránový glykoprotein kooperující se ZAP‑ 70 během BCR signalizace, který po aktivaci spouští typickou signální kaskádu pro proliferaci CLL buněk. Prognóza pacientů CD38+/ ZAP‑ 70+ je horší než u nemocných se zvýšenou expresí pouze znaku CD38 [23]. Oba tyto markery dříve sloužily jako alternativa k poněkud obtížnému stanovení mutačního stavu genů IGHV. Nicméně exprese ZAP‑ 70 a CD38 se mění spolu s vývojem onemocnění a navíc prognosticky významná míra exprese je obtížně stanovitelná díky odlišným metodám používaným v jednotlivých laboratořích. Proto dnes slouží už jen jako doprovodné prognostické faktory ke standardizovanému vyšetření genů IGHV.

Cytoplazmatická BCR signalizace je zprostředkována řadou kináz aktivujících nezbytné pro‑proliferační a anti‑apoptické procesy v CLL buňkách [24]. Fosforylační kaskáda zahrnuje především kinázy Lyn, Syk a Btk. Zajímavé je, že Lyn není pro BCR signalizaci nezbytná tak jako ostatní zmíněné kinázy, ale naopak hraje klíčovou roli v ukončení BCR aktivace. Fosforylací jsou dále aktivovány proteiny PI3K a PLCγ2 odpovědné za tvorbu tzv. druhých poslů, které zprostředkovávají aktivaci příslušných drah (např. RAS, NFκB, AKT, MAPK, PKC atd.) [25]. Pochopení mechanizmů BCR signalizace vedlo k navržení nových terapeutických postupů založených na inhibici jednotlivých komponent této dráhy. Tyto tzv. BCR inhibitory mají pro nádorovou buňku fatální následky; vedou nejenom k inhibici signálů pro přežití, ale ovlivňují také migraci maligních buněk [26]. Mezi klinicky testovaná léčiva patří např. ibrutinib jako inhibitor Btk dosahující velmi dobrých klinických výsledků (schválen v USA v roce 2014 pro léčbu relabující/ refrakterní CLL v druhé léčebné linii), fostamatinib pro inhibici Syk a nebo PI3K inhibitor idelalisib [27].

Cytogenetické prognostické faktory

Získané genetické změny se vyskytují v době dia­gnózy CLL u více než 80 % nemocných a hrají významnou roli v patogenezi onemocnění. Jejich identifikace má význam pro prognózu, volbu léčebné strategie, a tedy OS nemocných. Na jejich určení se už od 70. let minulého století podílí řada cytogenetických a molekulárně‑cytogenetických metod, jako je klasická cytogenetika, fluorescenční in situ hybridizace (FISH), čipové technologie a v poslední době i nejmodernější technologie sekvenování nové generace (next-generation sequencing – NGS). Přes výskyt velkého spektra genetických změn byly určeny rekurentní změny prognostického významu.

Milníkem ve vývoji cytogenetiky CLL a jejího klinického významu byla práce z roku 2000, kdy Döhner et al určili na základě cytogenetické (FISH) analýzy 325 CLL nemocných prognostický význam nejčastějších chromozomových změn v hierarchickém uspořádání [7]. Tato „Döhnerova prognostická klasifikace“ ukázala, že nemocní s delecí 13q (del(13q)) jako jedinou změnou v karyotypu mají dobrou prognózu, zatímco pacienti s del(17p ) zahrnující gen TP53 a del(11q ) zahrnující gen ATM, mají nepříznivou prognózu. Nález trizomie chromozomu 12 (tris(12)) je spojován se střední prognózou společně s nálezem normálního karyotypu. Právě tato cytogenetická prognostická stratifikace doplnila a upřesnila již existující hodnocení klinického stadia podle Bineta a Raie [28,29].

Kromě uvedených chromozomových změn, které jsou součástí rutinního CLL panelu FISH vyšetření, existují i další chromozomové aberace, jež byly určeny klasickou cytogenetickou nebo čipovou technologií. K takovým změnám patří zmnožení krátkých ramen chromozomu 2, které bylo pozorováno u 8– 28 % CLL nemocných [30,31]. Zmnožení zahrnuje oblast s lokalizací významných onkogenů jako MYCN, REL a nebo MSH2 a častěji se vyskytuje u nemocných v pokročilejším stadiu onemocnění (Binet B a C) a také jako sekundární změna spojená s kratším OS a transformací do RS [31,32].

Změny chromozomu 13q

Del(13q) se vyskytuje až u 50 % CLL nemocných v době diagnózy a je nejčastější změnou detekovanou metodou FISH. Během posledních několika let byla tato oblast obzvlášť intenzivně studována a byla navržena řada kandidátních genů (obr. 2), které by mohly být odpovědné za patogenezi stejně jako za prognostickou heterogenitu nemocných s del(13q) . V deletované oblasti byly určeny geny kódující microRNA (miRNA), miR 15a a miR16- 1 [33,34], ale jasná korelace s expresí a počtem alel nebyla přesně stanovena. Kromě těchto miRNA bylo studováno několik dalších genů lokalizovaných v deletované oblasti 13q, jako gen DLEU7 nebo DLEU2, které by mohly hrát významnou roli v aktivitě nádorových supresorů [35]. Jednoznačný závěr však zatím nebyl proveden. Analýzy deletované oblasti dále ukázaly, že velká delece zahrnující gen RB1 (typ I) je spojena s kratším časem do první léčby (time to first treatment –  TTFT) a OS, ve srovnání s nemocnými, kteří mají kratší delece zahrnující jen geny miR15a and miR16- 1 (typ II) [35– 38]. Pacienti mohou mít také bialelickou del(13q), která je pozorována až ve 30 % případů [39]. Bialelická delece je často spojena s malou delecí nezahrnující RB1 gen. Klinický význam bialelické delece je stále kontroverzní, avšak častěji je pozorována u nemocných s agresivnějším průběhem onemocnění [40,41]. Prognostický význam bialelické delece je obtížné stanovit také proto, že může být ovlivněn řadou dalších faktorů, ke kterým řadíme zejména velikost klonu s touto delecí. Orlandi et al ukázali, že klon, který tvoří 65– 90 % buněčné populace, může znamenat prognostické zhoršení u nemocných s izolovanou del(13q) [41] .

Trizomie chromozomu 12

Tris(12) je druhá nejčastější cytogenetická změna u nemocných s CLL s frekvencí 20– 30 %, z čehož až v 60 % případů se vyskytuje jako jediná změna karyotypu. Pokud se objevuje spolu s dalšími cytogenetickými aberacemi, pak často s trizomií chromozomů 18 a 19, ale také s del(11q), del(13q), del(14q), del(17p) anebo s translokacemi zahrnujícími gen IGH [7]. Tris(12) je považována za marker střední prognózy, i když některé práce potvrdily výskyt u pa­cientů s agresivnějším průběhem onemocnění [42]. Tato aberace je považovaná za změnu časného stadia onemocnění, která podporuje akumulaci dalších změn, např. mutací genů NOTCH1 nebo TP53 [43]. Tris(12) vede dále ke zvýšené regulaci řady genů lokalizovaných na chromozomu 12 (obr. 2), přičemž za hlavní patogenetický mechanizmus této změny je považována dávka genů [44].

Delece chromozomu 11

Del(11q) je pozorována u 5– 20 % CLL nemocných [2,7]. Tato delece je značně heterogenní a je klasifikována buď jako „velká delece“ vyskytující se častěji, nebo jako „malá delece“, která je mnohdy spojena s mutacemi na druhé párové alele. Delece se často vyskytuje společně s dalšími defekty a je součástí komplexních změn, což potvrzuje nestabilitu nádorového genomu [45,46]. Minimálně deletovaná oblast téměř vždy zahrnuje gen ATM. Homozygotní delece nebyla zatím u CLL nemocných pozorována, ale 20– 30 % nemocných s heterozygotní del(11q) má mutaci párové ATM alely [46]. V blízkosti genu ATM, v oblasti 11q22, je lokalizován také gen BIRC3 (obr. 2), jehož role v patogenezi a prognóze CLL je v současnosti intenzivně studována. Bylo pozorováno, že nemocní s delecí nebo mutací genu BIRC3 jsou často rezistentní na léčbu fludarabinem [47].

Delece chromozomu 17

Del(17p) je pozorována u 3– 10 % nemocných v době dia­gnózy CLL [7,47,48], avšak až u 30 % léčených a refrakterních pa­cientů [48]. Delece může být přítomna de novo v době diagnózy nebo se může objevit až v průběhu onemocnění jako výsledek klonálního vývoje [49]. V současnosti převládá názor, že přítomnost více než 25 % pozitivních jader určených metodou FISH předpovídá horší průběh onemocnění [48,50]. Více než 75 % nemocných s delecí genu TP53 má mutaci v párové alele (obr. 2). Tito nemocní s bialelickým defektem mají horší průběh onemocnění, kratší dobu přežití bez progrese (progression-free survival – PFS) i OS [51]. Nicméně negativní vliv na prognózu má ale také samotná delece nebo mutace genu TP53, což potvrzuje, že každá tato změna je dostatečná pro rezistenci a klonální vývoj. Pomocí sekvenování nové generace s vysokým pokrytím (tzv. ultradeep NGS) se ukázalo, že výskyt TP53 mutací je prognosticky nepříznivý i v případě, že jsou přítomny v malých subklonech [52]. Del(17p) je často součástí komplexních karyotypů, vyskytující se společně s delecí chromozomu 4p, 18p, 20p a změnami chromozomu 8 [53,54].

Komplexní karyotyp a chromotripse

Komplexní karyotyp (CK) je obecně definován jako nález tří a více změn v karyotypu. U nemocných s CLL se vyskytuje přibližně u 16 % nemocných [55,56]. Nález CK je velmi často asociován s nemutovaným stavem IGHV, expresí CD38 a krátkým OS. Provedená analýza počtu změn v komplexním karyotypu ukázala, že prognostická hodnota CK je vyšší u nemocných s nálezem pěti a více změn, a dále byla potvrzena vysoká asociace CK s del(11q) a del(17p) [57]. Baliakas et al analyzovali celkem 1 001 neléčených CLL nemocných a CK pozorovali u 157 (15,6 %) nemocných [56]. Tento nález byl asociován s nemutovaným stavem IGHV a změnami 17p. Nález CK se ukázal jako nezávislý prognostický faktor pro přežívání bez události (event-free survival – EFS) u neléčených CLL pacientů. Cytogenetická analýza 72 nemocných s relabující/ refrakterní CLL, kteří byli léčeni kombinací s ibrutinibem, odhalila CK u 26 (36 %) nemocných, přičemž u 22 z nich byla součástí del(17p). Tato studie dále ukázala, že CK je nezávislý faktor spojený s nepříznivým EFS a OS u těchto nemocných. Toto nebylo potvrzeno u nemocných s del(17p) bez CK, což vedlo k závěru, že s nepříznivým průběhem relabující/ refrakterní CLL je spojen spíše CK než del(17p) [58].

Chromotripse je pojem odvozený z řeckých slov „chromos“ pro chromozom a „thripsis“ pro rozpad chromozomů na kousky. Tento proces úzce souvisí se vznikem komplexního karyotypu a označuje jednu katastrofickou událost, během níž se chromozom nebo více chromozomů rozpadne na mnoho kousků, které se pak spojují zpět pomocí DNA opravných procesů v náhodném pořadí. Takto mohou být vysvětleny komplexní chromozomové přestavby s řadou zlomů představující tzv. marker chromozomy. V nádorových buňkách vede chromotripse ke ztrátě nádorových supresorů a může být příčinou amplifikace onkogenů. Chromotripse se může vyskytovat u 2– 3 % nádorů a byla pozorována až u 25 % nádorů kostí [59]. V případě CLL byl tento jev objeven nedávno pomocí metody NGS, kdy se jednalo o chromotripsi chromozomu 4 [59]. Kombinací celogenomového sekvenování, komparativní genomové hybridizace (arrayCGH) a SNPs array se povedlo analyzovat a určit chromotripsi i u řady dalších nádorů [60,61].

Poškození ATM/ p53 apoptické dráhy

Narušení apoptotické dráhy je další velice důležitý mechanizmus patogeneze CLL, které umožňuje přežívání B lymfocytů v periferní krvi. Molekulární defekty bránící správnému průběhu apoptózy zahrnují zvýšenou expresi antiapoptických proteinů rodiny Bcl‑ 2 a aberace (delece a/ nebo mutace) nádorových supresorů TP53 a ATM, které představují významné negativní prognostické faktory CLL. ATM/ p53 signální dráha spouští v odpovědi na buněčný stres mechanizmy zabezpečující potlačení klonální expanze buněk a udržení integrity genomu [62]. Samotný prognostický význam hladiny proteinu Bcl‑ 2 nebyl prokázán a některé studie ukazují spíše na významný poměr hladin molekul Bcl‑ 2/ Bax při regulaci apoptózy [63].

Aberace genu TP53

Protein p53 je jaderný transkripční faktor, který se v závislosti na rozsahu a typu buněčného poškození podílí zejména na reparaci DNA, blokaci buněčného cyklu a iniciaci apoptózy. Somatické poškození genu TP53 bylo popsáno u více než poloviny onkologických malignit a v případě leukemií a lymfomů má jeho stanovení silný prognostický a prediktivní význam [64,65]. Výskyt zárodečných aberací genu TP53 je navíc spjat s autozomálně dominantními Li‑ Fraumeni a Li‑ Fraumeni‑like syndromy, vyznačujícími se rodinnou predispozicí k vývoji četných nádorových onemocnění v mladém věku (zpravidla v < 45 letech) [66]. Nejčastějšími způsoby deregulace proteinu p53 je narušení vazebné a/ nebo transaktivační schopnosti tohoto nádorového supresoru; popsáno je ovšem také získání onkogenní aktivity p53 u CLL mutovaných buněk [67]. U nově diagnostikované CLL jsou aberace genu TP53 detekovány u 5– 10 % pacientů a zpravidla asociují se zdaleka nejhorší prognózou onemocnění [7,68]. Nejkratší OS přitom vykazují nemocní s bialelickým poškozením genu TP53 (medián ~19 měsíců) [68,69], kdy je del(17p) nejčastěji kombinována s mutacemi lokalizovanými v oblasti DNA‑ vazebné domény [70]. Výskyt samostatné mutace genu TP53 je u neléčené CLL pozorován vcelku ojediněle (3– 5 % pacientů), ovšem stejně jako bialelický defekt přispívá k rezistenci nádorových klonů na standardní chemoimunoterapii a celkovou léčebnou odpověď tak dosáhne pouze zhruba 30– 60 % pacientů [68,71]. Při relapsu onemocnění jsou navíc často leukemické buňky nesoucí TP53 aberace v rámci klonálního vývoje selektovány [13,72]. Tyto aberace je pak možné zaznamenat u 30– 40 % chemorefrakterní CLL a až u poloviny případů RS [14,73]. Detekce minoritních TP53 mutací je ovšem v diagnostických vzorcích často z důvodu nedostačující senzitivity konvenčně používaných metod velmi problematická a v těchto případech je doporučováno využití přístupů NGS [52,72,74]. Nezbytná součást mutační analýzy je také stanovení funkčního důsledku každé detekované TP53 varianty, ať už pomocí specifických testů (zejména FASAY) nebo dohledáním v dostupných databázích (http:/ / p53.iarc.fr/ ,http:/ / p53.free.fr/ ). Současné poznatky týkající se analýzy mutací genu TP53 včetně charakterizace nejčastěji používaných detekčních metodik, které lze využít také u ostatních nádorových onemocnění, jsou přehledně shrnuty v mezinárodně platných doporučeních Evropské iniciativy pro výzkum CLL [74]. Nemocným s jakoukoliv prokázanou patogenní TP53 aberací je standardně doporučována účast v klinických studiích testujících léčiva nezávislá na funkci p53 signální dráhy, popřípadě jsou indikováni k alogenní transplantaci krvetvorných buněk [1,75]. V minulém roce bylo v USA organizací FDA pro léčbu těchto pa­cientů a nemocných s relabovanou nebo refrakterní CLL schváleno použití nového tyrozinkinázového inhibitoru ibrutinibu na základě výsledků studie RESONATE [76].

Inaktivace genu ATM

ATM je převážně jaderná kináza, která je aktivována po vzniku dvouřetězcových zlomů DNA a prostřednictvím fosforylace aktivuje řadu efektorových molekul zahrnutých v odpovědi na poškození DNA [77]. Kinázová kaskáda směřuje k mnoha cílovým molekulám, z nichž nejvýznamnější je protein p53 spouštějící procesy na ochranu integrity genomu [78]. Zárodečné mutace v genu ATM vedou k autozomálně recesivnímu syndromu ataxia‑ telangiectasia, který je spojen se zvýšeným rizikem infekcí a vzniku nádorových onemocnění, zejména leukemií, lymfomů a nádorů prsu [79]. Gen ATM může být u CLL pacientů zasažen prostřednictvím del(11q) a/nebo somatické (případně germinalní) mutace. Při analýze obou typů defektů se ukázalo, že dohromady představují nejčastější abnormalitu spojenou s negativní prognózou při diagnóze CLL, kdy se vyskytují u přibližně 25 % pacientů [80]. U pacientů vyžadujících léčbu může být tato frekvence ještě vyšší [81]. Dopad ATM defektů na prognózu pacientů byl prokázán v řadě studií, které ukazují jejich negativní vliv na přežití a také jejich potenciální prediktivní charakter [80– 84]. Nicméně analýza mutací v tomto extrémně dlouhém genu (62 kódujících exonů) je pro většinu laboratoří náročná, a proto se rutinně vyšetřuje pouze del(11q) . Přestože NGS technologie značně zjednodušily tento proces, interpretace identifikovaných variant zůstává nadále problematická. Je proto velmi vhodné využít některý z funkčních testů, který by vyčlenil skutečně patogenní mutace s jednoznačným vlivem na funkci proteinu. Tyto testy jsou založeny zejména na sledování indukce exprese p53 a jeho cílového genu p21 po poškození DNA ionizujícím zářením nebo vybranými chemoterapeutiky [85– 88]. Právě pomocí funkčních analýz bylo zjištěno, že kompletní inaktivace ATM je u CLL pa­cientů zprostředkována zejména bialelickými defekty (del(11q) / mutace nebo mutace/ mutace), které vedou k trvalému narušení p53 dráhy po poškození DNA [81]. Samotná del(11q)  k inaktivaci ATM nevede, protože transkripce z druhé alely je schopna zajistit dostačující syntézu funkčního proteinu, avšak může ovlivňovat průběh choroby prostřednictvím haploinsuficience dalších genů lokalizovaných v oblasti 11q22– 23 (např. BIRC3) [80]. Klinický dopad jednotlivých ATM defektů u CLL pacientů byl podrobněji popsán teprve nedávno, protože starší studie sledovaly pouze vliv del(11q)  bez analýzy možné přítomnosti ATM mutací. Efekt mutace doprovázející asi ve třetině případů deleci se projevuje ve významném zkrácení TTFT a OS ve srovnání se samotnou delecí [81]. Práce Skowronské et al prokázala signifikantní zhoršení PFS a OS pouze u pacientů s bialelickým ATM defektem [83]. Navíc bylo zjištěno, že tito pacienti jsou rezistentní na standardně používanou cytotoxickou chemoterapii, jejíž mechanizmus účinku je závislý na funkční p53 dráze [81,83]. Proto je do budoucnosti velice žádoucí hledat nové možnosti léčby s p53 nezávislým mechanizmem účinku, které by byly vhodné pro ATM‑ defektní pacienty. Jednou z možností by mohlo být použití inhibitorů BCR signalizace [89] nebo také některého z nových terapeutických přístupů založených na konceptu syntetické letality, který k usmrcení nádorových buněk využívá dysfunkce ATM spolu s terapeutickým zvýšením genotoxického stresu [90].

Význam deregulace miRNA

MiRNA jsou krátké nekódující úseky RNA podílející se na regulaci exprese nejméně 20– 30 % všech protein kódujících genů, zahrnutých zejména v buněčné proliferaci, diferenciaci a apoptóze. Jejich význam v iniciaci a progresi onkologických malignit podtrhuje fakt, že zhruba polovina známých lidských miRNA je lokalizována v genomových oblastech asociovaných s karcinogenezí [33]. Nádorově supresorová, popřípadě onkogenní funkce miRNA byla popsána také u CLL, kde je možné na základě specifického expresního profilu těchto markerů odlišit nádorové buňky od fyziologických B lymfocytů [91]. Pomocí vytipovaného panelu miRNA vyznačujících se v rámci CLL rozdílnou expresí lze do určité míry ve spojitosti s ostatními molekulárními markery rovněž predikovat průběh tohoto onemocnění [91,92]. Zdaleka nejčastěji (> 60 % případů) je u CLL pozorována deregulace klastru miR 15a a miR 16- 1 lokalizovaných v často deletované oblasti 13q14 [33], která vede k navýšení exprese antiapoptotického proteinu Bcl‑ 2 [93]. Vztah mezi hladinou exprese miRNA, rekurentními genomovými defekty a klinickým průběhem CLL byl prokázán rovněž u genů kódujících miR 34b/ c (lokus 11q22.3) a miR 34a regulovaných proteinem p53 [94]. Význam aberantní exprese těchto a dalších miRNA (např. miR 150 a miR 155) u CLL je dáván do spojitosti také s aktivní BCR signalizací asociovanou se zvýšenou proliferací leukemických buněk [27,95,96].

Příčinou deregulované exprese miRNA mohou být také mutace v těchto markerech (detekované např. u miR 16- 1), které byly sporadicky nalezeny u pacientů s familiární CLL, a poukazují tak na význam genetické predispozice při jejím vývoji [91]. Navzdory prokázané úloze při patogenezi CLL není prozatím aberantní exprese miRNA u tohoto onemocnění z důvodu nestandardizované detekční metodiky rutinně vyšetřována.

Nové potenciální prognostické markery CLL

Rychle se vyvíjející technologie NGS umožnily pomocí celogenomového či celoexomového přístupu objevení dalších rekurentně se vyskytujících genových aberací u CLL [8,9,11]. Jsou to zejména mutace v genech SF3B1, NOTCH1 nebo BIRC3, které se vyskytují u 5– 15 % nově dia­gnostikovaných pacientů a zejména pak v pozdějších fázích onemocnění (obr. 1). Jejich klinický dopad a možnost využití jako nových „bio­markerů“ je v současné době intenzivně studován [97– 99]. V nedávné době bylo popsáno, že jsou asociovány s nepříznivými cytogenetickými aberacemi a také s celkově horším průběhem choroby, odrážejícím se v rychlejší progresi, rezistenci na léčbu a kratším PFS a OS pacientů (tab. 1) [19,47,98– 100]. Na druhé straně ale není přesně znám funkční dopad těchto mutací a také chybí standardizované detekční metody, což prozatím znemožňuje zavedení těchto analýz mezi rutinní vyšetření CLL pacientů. Další rekurentně mutovaný gen MYD88, jehož proteinový produkt se podílí na iniciaci imunitní odpovědi spojené se zánětem, byl v nedávné době asociován s mutovaným IGHV a del(13q) a zřejmě je tedy spojen s příznivější prognózou CLL pacientů (tab. 1) [11,43].

Rossi et al integrovali tyto nově nalezené molekulární defekty do klasického cytogenetického hierarchického modelu a navrhli tak potenciálně dokonalejší prognostickou stratifikaci CLL pacientů [101]. Rozlišují čtyři skupiny: 1. vysoce rizikoví pacienti s defekty v genech TP53 a/ nebo BIRC3, 2. pacienti se středním rizikem s mutacemi v NOTCH1 a/ nebo SF3B1 a/ nebo s del(11q) , 3. pacienti s nízkým rizikem nesoucí tris(12) nebo normální karyotyp a 4. pacienti s velmi nízkým rizikem nesoucí pouze del(13q). V nedávné studii Baliakas et al podpořili klinickou významnost zejména SF3B1 a NOTCH1 mutací [19]. Nicméně tento prognostický model bude potřeba ještě ověřit na základě prospektivních klinických studií. Prediktivní potenciál těchto nových markerů s cílem využití v personalizované léčbě je stále předmětem diskuzí.

Mutace genu SF3B1

SF3B1 je jedna z proteinových komponent sestřihového aparátu buňky (splicezom), který se podílí na úpravě prekurzorové mRNA do její zralé formy [102]. Gen SF3B1 je lokalizován na 2. chromozomu a jeho mutace se vyskytují zejména v exonech 14– 16 v tzv. HEAT doménách v několika preferenčně mutovaných kodonech. Nejčastější mutací je záměna K700E, vyskytující se asi ve 40– 50 % případů. Frekvence mutací roste od diagnózy (5– 10 %), přes progresi choroby (17 %) až k refrakterní formě CLL (20 %) [8,11,98,99]. Mutace v SF3B1 jsou asociovány s nemutovaným IGHV, s del(11q)  a zdá se, že také s mutacemi genu ATM [11,99], čímž dále zhoršují už tak nepříznivou prognózu těchto pacientů; klinicky se projevují značně zkráceným TTFT a kratším OS pacientů [99,103]. Jejich funkční dopad není prozatím přesně objasněn, nicméně Paulsen et al ve své studii ukázali stěžejní roli sestřihového aparátu v udržování genomické stability, kdy při zablokování jednotlivých komponent splicesomu došlo k akumulaci poškození DNA [104]. Je tedy možné, že mutace SF3B1 vedou k narušení odpovědi na poškození DNA, podobně jako mutace v ATM [105].

Mutace genu NOTCH1

Gen NOTCH1, lokalizovaný v oblasti 9q34.3, kóduje heterodimerní transmembránový protein podílející se na regulaci buněčné proliferace (NF‑κB dráha), diferenciace a apoptózy. Aberace tohoto transkripčního faktoru byly asociovány s patogenezí řady nádorových onemocnění, kdy v rámci hematoonkologických malignit je výskyt prognosticky nepříznivých mutací genu NOTCH1 pozorován zejména u T‑ akutní lymfoblastické leukemie (~50 % případů) [106]. V případě CLL jsou somatické onkogenní mutace genu NOTCH1 detekovány u 8– 12 % nově diagnostikovaných pacientů [9,10] a zpravidla vedou ke konstitutivní aktivaci NOTCH1 signální dráhy. Zdaleka nejčastěji je přitom u CLL analyzována hot spot mutace c.7544_7545delCT (70– 80 % NOTCH1 mutací) vedoucí ke vzniku předčasně zkrácené aktivní formy proteinu. Spolu s ostatními NOTCH1 defekty je tato mutace pozorována zejména u pacientů s nemutovaným stavem genů IGHV a také s tris(12) [9,100]. Z hlediska prognózy CLL je výskyt patogenních mutací genu NOTCH1 zpravidla spojen se zkráceným PFS a OS pacientů (medián ~55 měsíců) [98] a také zvýšeným rizikem Richterovy transformace [10,107]. Předběžné výsledky klinických studií poukazují též na prediktivní význam přítomnosti NOTCH1 mutací u CLL, kdy u těchto pa­cientů nebyl prokázán léčebný prospěch z přidání rituximabu k režimu fludarabin‑cyklofosfamid [97].

Defekty genu BIRC3

BIRC3 je negativní regulátor kinázy MAPK, která aktivuje nekanonickou NF‑κB dráhu stimulující proliferaci buněk [108]. U CLL pacientů může být BIRC3 inaktivován pomocí del(11q) a/nebo mutace, podobně jak je tomu v případě ATM [19,47]. Gen BIRC3 je lokalizován do oblasti 11q22.2, ale nemusí vždy v případě del(11q)  chybět. Studie Rose‑Zerilliho et al detekovala deleci BIRC3 v 83 % případů delece genu ATM a ukázala, že spíše ATM mutace než BIRC3 delece a/ nebo mutace ovlivňují přežití pacientů s del(11q)  [109]. Inaktivace proteinu BIRC3 je spojena především s posunovými mutacemi nebo mutacemi vedoucímu ke vzniku stop kodonu, které způsobují ztrátu E3 ubikvitin ligázové aktivity směrem ke kináze MAPK a následně vedou ke konstitutivní aktivaci nekanonické NF‑κB dráhy. Výskyt mutací při diagnóze je nízký (5 %), zatímco u relabujících a fludarabin‑refrakterních pacientů je poměrně vysoký (25 %) [47].

Klonální evoluce molekulárních aberací u CLL

CLL je klonální onemocnění, které prochází několika klinickými stadii od bezpříznakové fáze, přes symptomatickou CLL, která může přejít až ve vysoce agresivní formu známou jako RS. V průběhu CLL je možné detekovat různé molekulární léze, které mohou být klonálně zvýhodňovány a přispívat tak k progresi onemocnění (obr. 1). Biologická variabilita CLL je tedy dána různou kombinací genetických abnormalit a přítomností subklonálních defektů [110]. Ačkoliv se prozatím u CLL nepodařilo přímo určit kauzální (tzv. founder) aberaci podílející se na prvotní iniciaci onemocnění, byly odhaleny genomové změny spojené s vývojem a progresí CLL. Tyto tzv. driver aberace se mohou vyskytovat klonálně nebo subklonálně v časnějších, resp. pozdějších fázích evoluce CLL [9,43,111].

Mezi nejčastěji deregulované buněčné mechanizmy u CLL patří zejména narušení DNA reparace a kontroly buněčného cyklu (aberace TP53, ATM, BIRC3), ovlivnění RNA zpracování a sestřihu (mutace SF3B1, XPO1), navýšení intenzity proliferace (mutace NOTCH1, FBXW7, KRAS, NRAS, MED12), modulace imunitních mechanizmů (mutace MYD88) a změna modifikace chromatinu (CHD2) [11,43]. Řadu těchto patogenetických klonálních defektů je přitom možné zaznamenat už na úrovni hematopoetických prekurzorů a také u myeloidních buněk pa­cientů s CLL [112,113] a mohou se uplatnit rovněž při vývoji MBL. Tento premaligní leukemický stav nevyžadující hematologickou léčbu je možné diagnostikovat až u ~13 % příbuzných pa­cientů s CLL, z nichž 1– 2 % případů ročně progreduje do klinicky vyjádřené CLL [114].

V časných stadiích neléčené CLL jsou pomocí konvenčně dostupných metod ve většině nádorových buněk nalézány spíše klinicky příznivé genomové defekty (nejčastěji del(13q) a mutace genu MYD88), které jsou predominantně klonálního původu [43]. Až ve 20 % případů ovšem v průběhu CLL dochází také k nárůstu subklonálních populací nesoucích prognosticky nepříznivé genové aberace (např. TP53, ATM a SF3B1), které přispívají k agresivnímu fenotypu onemocnění včetně rezistence na standardně podávanou chemoimunoterapii (obr. 1). Riziko vývoje genomových aberací se přitom značně zvyšuje s přítomností nemutovaného IGHV a podáním terapie, která poskytuje významný selekční tlak [13,72,101]. Narušení reparačních a apoptotických mechanizmů u leukemických buněk ve spojení s navýšením intenzity jejich proliferace napomáhá akumulaci dalších patogenetických změn [43,110]. Důsledkem může být progrese CLL do malignit vyššího stupně, nejčastěji difúzního velkobuněčného B lymfomu, popřípadě prolymfocytární leukemie, které lze detekovat u 5– 15 % pacientů a jsou spojeny s infaustní prognózou onemocnění [115].

Dosud ne zcela objasněnou otázkou klonálního vývoje CLL zůstává, zda jsou později detekované mutace následkem spontánní mutageneze nádorové buňky nebo zda jsou do DNA vnášeny agresivní genotoxickou terapií. Nejnovější studie ukazují, že minoritně mutované subklony jsou přítomny v CLL buňkách již před terapií, která následně přispívá k jejich expanzi, a to až ve chvíli, kdy je eliminována většina nádorové populace senzitivní na léčbu [43,72,111].

Závěr

Klinická heterogenita CLL se zdá být v přímé souvislosti s biologickou podstatou tohoto dosud neléčitelného onemocnění. Nejsilnějšími klinicky významnými prognostickými markery CLL nadále zůstávají analýza mutačního stavu genů IGHV ve spojení s vyšetřením stávajících rekurentních chromozomálních a genových aberací. Při predikci léčebné odpovědi je kromě del(17p) a del(11q) doporučováno také stanovení mutačního profilu kódujících oblastí genů TP53 a ATM, které společně pomáhají určit pacienty schopné profitovat z alternativních léčebných modalit. V souvislosti s novými poznatky o patogenezi CLL a vývojem sofistikovanějších detekčních přístupů lze do budoucna očekávat rozšíření portfolia vyšetřovaných molekulárních markerů. Důkladné rozdělení pacientů dle přítomnosti rizikových genomových abnormalit by mohlo napomoci při výběru efektivní cílené terapie určené pro danou skupinu pa

Práce byla realizována za podpory grantů IGA MZ ČR NT13493-4/2012, NT13576-4/2012, NT13576, AZV MZ ČR č. 15-30015A-4/2015 a 15-31834A-4/2015 a TAČR TE02000058.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

prof. RNDr. Šárka Pospíšilová, Ph.D.

Interní hematologická a onkologická klinika

LF MU a FN Brno

Jihlavská 20

625 00 Brno

e-mail: sarka.pospisilova@fnbrno.cz

Obdrženo: 30. 7. 2015

Přijato: 4. 8. 2015