Makro-komplexy a možnosti jejich detekce

Overview

Cíl studie: Zpracování aktuálních znalostí o klinické problematice makro-komplexů a možnostech jejich detekce.

Typ studie: Přehledná práce.

Název a sídlo pracoviště: Institut klinické a experimentální medicíny, Vídeňská 1958/9, 140 21 Praha 4

Materiál a metody: Na základě studia literatury je v této práci zhodnocena klinická problematika makro-komplexů. Jsou uvedeny jejich typy, asociace s chorobami a frekvence výskytu. Dále jsou referovány současné možnosti detekce makro-komplexů.

Výsledky: Makro-komplexy vznikají nejčastěji vazbou enzymu a imunoglobulinu G (IgG). Může se jednat buď o vazbu nespecifickou, nebo o vazbu se specifickými autoprotilátkami cirkulujícími v séru. Prvním popsaným makro-enzymem byla makro-amyláza, která je spolu s makro-AST reportována nejčastěji. Díky neustále se zvyšující citlivosti laboratorních metod jsou v současnosti zachycovány i makro-troponiny a jiné makro-proteiny. Prevalence makro-komplexů v séru není zcela známá, ve studiích se u jednotlivých makro-komplexů odlišuje a je udávána od 0,5 % (makro-TSH) do 20,4 % (makro-troponin). Přítomnost makro-komplexu se považuje za benigní nález, který se vyskytuje jak u zcela zdravých jedinců bez symptomů, tak i v asociaci s autoimunitními (zejména systémový lupus erythematodes) a jinými chorobami (malignity, zánětlivá onemocnění, aj.).

Závěr: V případě přetrvávajícího izolovaného zvýšení enzymu nebo proteinu bez prokázaných příčin je potřeba věnovat pozornost možnosti výskytu makro-komplexu v séru pacienta nebo jiných možných interferencí (přítomnost heterofilních protilátek, revmatoidního faktoru, hemolýzy, aj.). Efektivní komunikace mezi klinikem a laboratoří je proto při diskrepanci výsledků nezbytná jak pro záchyt a detekci suspektních makro-komplexů, tak pro odhalení jiných interferujících látek ve vzorku séra.

Klíčová slova:

makro-komplexy – makro-enzymy – makro-proteiny

Úvod

Makro-komplexy vznikají sloučením proteinu, nejčastěji enzymu, s jinou komponentou krevní plazmy, která neinhibuje aktivitu enzymu či funkčnost proteinu. Nejčastěji se jedná o imunoglobuliny třídy IgG a IgA (makro-komplexy typu 1), popsány jsou ale také sloučeniny enzymu s lipoproteinovými částicemi či spontánně polymerované sloučeniny (makro-komplexy typu 2). Příčiny vzniku makro-komplexů nejsou dosud známé [1]. Jsou popsány studie, u kterých byla přítomnost makro-komplexu asociována s malignitami či autoimunitními onemocněními [2, 3], častěji ovšem přítomnost makro-komplexů nebývá podmíněna žádným konkrétním onemocněním [4-6]. Ve vyšetřovaném séru nebo plazmě se přítomnost makro-komplexů projevuje perzistentní elevací koncentrace (aktivity) daného proteinu (enzymu) z důvodu vysoké molekulové hmotnosti komplexu a jeho delšího biologického poločasu. Zvýšené izolované koncentrace enzymů (proteinů) jsou často diagnosticky zavádějící a vedou k dalším, často i invazivním vyšetřením [7].

Typy makro-komplexů

Nejčastěji popisovanými sloučeninami tvořícími makro-komplexy jsou enzymy, zejména amyláza, aspartát-aminotransferáza (AST), kreatinkináza (CK), laktátdehydrogenáza (LDH), alkalická fosfatáza (ALP) a lipáza [4, 6, 8, 9-11] (Tabulka 1). Přítomnost makro-gamaglutamyltransferázy (GGT), makro-5´nukleosidázy či makro-leucin aminopeptidázy v plazmě je popisována méně často [12]. Kromě enzymů jsou z ostatních makro-forem dále zachycovány makro-troponin, makro-prolaktin, makro-thyreotropin i jiné makro-proteiny [13-15].

Makro-amyláza byla prvním makro-komplexem popsaným Wildingem et al. [4] u pacienta s 3-8krát zvýšenou aktivitou amylázy v séru v průběhu deseti let. Pro přítomnost makro-amylázy v séru je charakteristická až stonásobně redukovaná renální clearance amylázy, a to vzhledem k velké molekulové hmotnosti tohoto makro-komplexu. Makro-amyláza je nejčastěji tvořena imunoglobulinem IgA kappa, méně pak IgG. Popsána je i asociace amylázy s léky [1]. Známý je i současný výskyt makro-amylázy IgA a IgG [16].

Makro-AST je dalším z nejčastěji se vyskytujících makro-enzymů skládající se z cytoplazmatického AST, který se váže na IgG (kappa nebo lambda), nebo z mitochondriálního AST, který může tvořit vazbu jak s IgG, tak i s IgA (kappa nebo lambda). V séru pa-cienta se tak mohou vyskytovat buď jeden nebo oba typy makro-AST [17]. Na elektroforéze se makro-AST vyskytuje jako abnormální proužek mezi cytoplazmatickým a mitochondriálním AST [5]. V případě asociace s onemocněním jsou nejčastěji zachyceny při akutním infarktu myokardu (AIM), akutní a chronické hepatitidě a jaterních malignitách [12]. Na rozdíl od ostatních makro-komplexů je vyšší incidence spíše v mladším věku a bez asociace s jaterními či jinými chorobami [18-20].

Makro-CK se mohou vyskytovat ve dvou formách, a to makro-CK 1 a makro-CK 2. Makro-CK 1 je podobně jako makro-AST komplex enzymu (nejčastěji izoenzymu CK-BB) a imunoglobulinu (nejčastěji IgG kappa) o molekulové hmotnosti kolem 200 kDa. Makro-CK 2 
vzniká polymerizací mitochondriální CK s molekulovou hmotností přesahující 300 kDa, která je produkována samostatným genem [8]. Přítomnost makro-CK byla popsána u pacientů s karcinomem žaludku či prostaty [21]. Vícekrát je popsána asociace současné přítomnosti makro-CK a makro-LDH u pacientů s akutním infarktem myokardu [22, 23]. Delanghe et al. [22] zaznamenali přítomnost makro-CK u pacientů desátý den po příhodě AIM, zatímco v časných fázích AIM makro-komplexy přítomny nebyly. Ke stejnému poznatku dospěli i Pudek a Jacobson [23]. Vzácněji byl výskyt makro-CK popsán i u dětí s leukoencefalopatií [24].

Makro-LDH se může stejně jako makro-CK vyskytovat ve více formách. Makro-LDH 1 je komplex LDH s imunoglobulinem (v 60 % s IgA) vyznačující se abnormálním množstvím proužků LDH na elektroforéze. Makro-LDH 2 vzniká asociací s β-lipoproteiny, na elektroforéze se vyznačuje změněnou pohyblivostí izoenzymů LDH. Makro-LDH 3 vzniká vzájemnou asociací izoenzymů LDH a na elektroforéze se vyznačuje výraznějšími proužky, které jsou typické pro izoenzymy LDH [9]. Makro-LDH nebývá popisována v asociaci s konkrétním onemocněním, nejčastěji se jedná o benigní nález [3]. Popisována je přítomnost makro-LDH v séru u pacientů s AIM, vzácněji u pacientů s následným rozvojem sekundární perikarditidy (Dresslerova syndromu) [9]. V literatuře se prozatím vyskytuje nesoulad ohledně asociace výskytu makro-LDH s autoimunitními chorobami. Galasso et. al. [21] ve své studii popsal makro-LDH u sedmi z deseti pacientů s revmatickým onemocněním. V jiné studii [25] bylo makro-LDH detekováno pouze u jednoho pacienta ze sta, kteří se léčili s revmatoidní artritidou a systémovým lupus erythematodes (SLE).

ALP nejčastěji tvoří vazbu s IgG lambda, vzácně s IgA a tento makro-komplex bývá dobře rozlišitelný elektroforézou od makro-komplexu alkalické fosfatázy s membránovými fragmenty či s lipoproteinem X [26]. Přítomnost je převážně popisována jako benigní [10], nicméně jsou reportovány i případy výskytu makro-ALP u pacientů s ulcerózní kolitidou [2] či v asociaci s jiným zánětlivým střevním onemocněním [27].

Výskyt makro-lipázy byl poprvé popsán u pacienta s non-Hodgkinovským lymfomem v roce 1987, kdy se jednalo o vazbu lipázy s IgG [11]. Zaman et al. [28] následně popsal současný výskyt makro-lipázy a makro-amylázy, které byly vázané na IgA. Kromě imunoglobulinů byla Taesem et al. [29] prokázána vazba lipázy i na alfa-2-mikroglobulin.

Makro-GGT prokázali Davidson a Watson [7] u čtyřiceti pacientů s diagnózou převážně jaterních onemocnění či alkoholismu; Thomas [1] popsal výskyt makro-GGT u pacientů s hepatobiliárními onemocněními. GGT může tvořit vazbu s imunoglobuliny, kde převládá vazba na IgA, nebo také s lipoproteinovými částicemi, podobně jako alkalická fosfatáza nebo leucin aminopeptidáza [1].

5´nukleotidáza tvoří makrokomplexy stejným způsobem jako GGT či ALP a jejich výskyt je asociován také s hepatobiliárním onemocněním [30].

Mezi další méně známé makro-komplexy patří i makroprolaktin, nazývaný též jako „big-prolaktin“ (ve formě dimeru), či „big big prolaktin“ (ve formě polymeru) [31], který se projevuje abnormálně zvýšenými hodnotami prolaktinu v séru. Součástí makromolekuly prolaktinu je nejčastěji molekula IgG. Vzniká často v asociaci s endokrinologickými onemocněními, zejména chorobami štítné žlázy, dále v průběhu těhotenství či při užívání léků, nejčastěji psychofarmak [32]. Při nepravděpodobně zvýšených hodnotách prolaktinu v séru lze odlišit přítomnost makroprolaktinu od prolaktin secernujícího adenomu, a tedy zjištění množství biologicky aktivního monomeru prolaktinu v séru, i pomocí jednoduchých laboratorních postupů jako je precipitace vzorku séra s polyethylenglykolem.

V roce 2016 byla popsána Prodanem et. al. [33] přítomnost makro-parathormonu u 56leté ženy. Koncentrace parathormonu v séru se pohybovala od 122 – 165 pmol/L. Po reakci séra s polyethylenglykolem klesla koncentrace na 12,1 pmol/L.

Z dalších neenzymových makro-komplexů jsou nyní objevovány i díky zvyšující se citlivosti metod komplexy imunoglobulinu, respektive autoprotilátek proti troponinu, s troponiny. Domanski et al. [34] popsali případ 62letého pacienta s mnohočetným myelomem s dlouhodobě zvýšenou koncentrací troponinu I (2800-3000 ng/L) bez ostatních ukazatelů poškození myokardu, na EKG byla patrná blokáda pravého Tawarova raménka. Podobný případ reportovali Wong et al. [35] a dále Warner s Marshallem [13]. V roce 2018 byl poprvé popsán i případ výskytu makro-troponinu T (hs TnT dlouhodobě 73 ng/L). Jednalo se o 22letého pacienta bez abnormalit na EKG a echokardiogramu a s fyziologickými hodnotami troponinu I [36]. Falešně zvýšenou koncentraci troponinu I nebo T může kromě makro-troponinu způsobovat i přítomnost vysoce specifických protilátek proti zvířecím antigenům (HAAA) [37], heterofilních protilátek, fibrinových vláken, přenos mezi vzorky (carryover), hemolýza, lipémie či náhodná chyba [13].

Možnosti detekce makro-komplexů

Techniky detekce makro-komplexů a určení jejich typu často zahrnují komplikovanější a pracné procesy, které vyžadují specializované vybavení laboratoře, jako např. chromatograf, ultracentrifugy a elektroforézu, a proto v klinické laboratoři nebývá toto stanovení začleněno. Při podezření na přítomnost makro-komplexu ve vzorku je v současnosti možno využít Registr raritních vyšetření, který má toto vyšetření v nabídce. Screening makro-komplexů (zejména makro-enzymů) lze provést jednoduchou reakcí s polyethylenglykolem (PEG), nebo reakcí s Proteinem A nebo G, které precipitují imunoglobuliny ve vyšetřovaném vzorku [7]. Pro sedm základních enzymů sice publikovali referenční rozmezí procenta precipitace (% PPA) Davidson a Watson [7], nicméně pro ostatní makro-enzymy/proteiny je rozmezí zatím neznámé, což zůstává nevýhodou této jednoduché techniky. V případě diskrepantních výsledků a podezření na makro-komplex ve vyšetřovaném séru pacienta je doporučováno přeměření vzorku jinou diagnostickou soupravou založenou na jiném principu měření (zejména pro suspektní makro-troponin, makro-parathormon, makro-TSH a jiné makro-proteiny). Jako součást průkazu makro-proteinu je také popisován diluční pokus pro zjištění (ne)linearity měření a dále použití speciálních zkumavek na blokaci heterofilních protilátek v měřeném vzorku séra [13]. Pro jednoznačnou detekci makro-komplexů se zdá být nejvhodnější technikou kombinace elektroforézy a gelové permeační chromatografie, kdy velké molekuly zůstávají na povrchu gelu, kterým je kolona naplněna, eluují se tak s nižším elučním časem než molekuly menší.

Diskuse

Makro-komplexy, skládající se z proteinu a imunoglobulinu (případně lipoproteinu či membránového fragmentu), jsou v posledních letech hojně reportovány pravděpodobně i díky neustále se zvyšující citlivosti laboratorních metod. K výskytu makro-enzymů, které jsou postupně popisovány již od roku 1964, se nyní přidávají makro-proteiny, jako jsou makro-troponiny, makro-prolaktiny, makro-thyreotropiny a makro-parat-hormony. Prevalence makro-komplexů je obecně neznámá, odvíjí se od použité metody stanovení makro-komplexů, věku a pohlaví. V literatuře je popisována od 0,5 % do 20,4 %, některé studie předpokládají prevalenci i vyšší. Přítomnost makro-komplexů v séru může přetrvávat od několika měsíců až po desítky let, výskyt makro-komplexů je reportován se zvyšujícím se věkem s výjimkou makro-AST, které je reportováno v dětském věku.

Makro-komplexy jsou klinicky zajímavé zejména ze dvou důvodů – jednak často způsobují nejasnosti při interpretaci laboratorních vyšetření a dále mohou, anebo nemusí, být asociovány s patologickým stavem. V případě asociace s chorobami se nejčastěji jedná o malignity a zánětlivá onemocnění, nejvíce diskutovaná je souvislost s autoimunitními onemocněními, ze kterých je u makro-komplexů nejvíce zastoupená SLE a přítomnost revmatoidních faktorů (RF).

Pro screening makro-komplexů lze využít jednoduchý precipitační test s polyethylenglykolem, který se specificky váže na globuliny krevní plazmy. Metoda je rychlá, levná a poměrně efektivní. Dle Davidsona a Watsona [7], působí polyethylenglykol částečně i na lipoproteiny, čímž dokáže zachytit i některé makroenzymy typu 2, jako jsou makro-ALP a makro-GGT, ale naopak neprecipituje makro-CK 2, která neobsahuje imunoglobuliny ani lipoproteinové částice. Pro tyto suspektní nálezy lze dnes použít dobře dostupné komerční kity na elektroforézu izoenzymů, v případě vybavenosti laboratoře i gelovou permeační chromatografii, kde pomocí závislosti elučního objemu na koncentraci enzymu (proteinu) lze potvrdit či vyvrátit přítomnost makro-komplexu ve vyšetřovaném vzorku. V případě izolovaného zvýšení enzymu/proteinu v séru bez prokázaného makro-komplexu, lze využít diluční test k ověření linearity reakce či inkubaci vzorku ve speciálních zkumavkách pro blokaci heterofilních protilátek a k následné re-analýze. V případě negativních výsledků těchto analýz, může dále připadat v úvahu interference revmatoidním faktorem, biotinem, hemolýzou či lipémií.

Závěr

Při diskrepantních výsledcích laboratorního testu je vždy potřeba brát v úvahu i možnou interferenci v podobě přítomnosti makro-komplexu ve vzorku. Pomocí efektivní komunikace mezi klinikem a laboratoří lze zabránit nejasnostem při interpretaci výsledků a předejít tak dalšímu mnohdy nákladnému a invazivnímu vyšetřování pacienta.

Autoři prohlašují, že nejsou ve střetu zájmů

Do redakce došlo 26. 8. 2019

Adresa pro korespondenci:

RNDr. Jitka Komrsková

Oddělení klinické biochemie

Pracoviště laboratorních metod

Institut klinické a experimentální medicíny

Vídeňská 1958/9

140 21 Praha

E-mail: jitka.komrskova@ikem.cz