XXVI. Základní a aplikovaný výzkum v onkologii

XXVI/ 42. BIOLOGICAL EFFECTS OF IONIZING RADIATION OF DIFFERENT TYPES AS MANIFESTED BY DNA DAMAGE AND REPAIR AT THE MICRO-SCALE AND NANO-SCALE

FALK M.¹, HAUSMANN M.², KOPEČNÁ O.¹, PAGÁČOVÁ E.¹, NEITZEL C.², FALKOVÁ I.¹, CHRAMKO T.³, DOBEŠOVÁ L.¹, TOUFAR J.¹, PARSIMEHR E.¹

¹Institute of Biophysics, Czech Academy of Sciences, Brno, Czech Republic, ²Kirchhoff Institute for Physics, Heidelberg University, Germany, ³Joint Institute for Nuclear Research, Dubna, Russia

The development of photon and particle radiotherapy and radioprotection in space research confront us with urgent need of our better understanding of the relationship between the physical properties and the biological eff ects of various types of ionizing radiation, including heavy ions with high linear energy transfer (LET). In this lecture, we present our results on the induction, repair, and misrepair of DNA double strand breaks (DSBs) – the most serious radiation DNA lesions – in the context of chromatin architecture analysed at the correlated micro- and nano-scale. The results are compared for diff erent normal and cancer cell types exposed to low-LET gamma rays (60Co) and various high-LET ions (11B (7.5 MeV/ n, 148.3 keV/ μm)), 15N (13.1 MeV/ n, 181.4 keV/ μm)), 20Ne (33.9 MeV/ n, 170.9 keV/ μm)), respectively, generated by particle accelerators at JINR Dubna. Based on the interconnection of unique technologies – medical treatment irradiation sources, particle accelerators and advanced optical immunofl uorescence microscopy methods, including single molecule localization microscopy (SMLM) with resolution down to 10 nm (i.e. single molecules), we mainly focus on the question whether and potentially how the higherorder architecture of distinct chromatin domains determines the character of DNA damage and consequently the decision-making process for a particular repair pathway at each individual DSB site, the efficiency of DSB repair, the risk of formation of chromosomal aberrations and finally the overall cell typespecific radiosensitivity. We show repair mechanism-dependent re-arrangements of damaged chromatin and IRIF architecture, and classify γH2AX repair clusters accordingly.

The work was supported by the projects for cooperation with JINR Dubna to M.F. (The Government Commissioner Projects and The 3+3 Projects; 2012-2020), GACR 20-04109J, and GACR 19-09212S. The Czech-German collaboration was supported by the Heidelberg University Mobility Grant for International Research Cooperation within the excellence initiative II of the Deutsche Forschungsgemeinschaft, the DFG-grant H1601/ 16-1 to M.H., and DAAD-19-03 Project.

XXVI/ 43. FIBROBLASTOVÝ AKTIVAČNÍ PROTEIN – MOŽNÝ DIAGNOSTICKÝ A TERAPEUTICKÝ CÍL V MIKROPROSTŘEDÍ GLIOBLASTOMU A V MOZKOVÝCH METASTÁZÁCH

ŠEDO A.¹, BUŠEK P.¹, BALÁŽIOVÁ E.¹, ZUBAĽ M.¹, VÝMOLA P.¹, VANÍČKOVÁ Z.¹, KŘEPELA E.¹, ŠÁCHA P.², KONVALINKA J.²

¹1. LF UK v Praze, ²Ústav organické chemie a biochemie, ČS AV Praha

Fibroblastový aktivační protein (FAP, sepráza) je membránová proteáza typicky exprimovaná v embryonálních tkáních, místech tkáňové přestavby a v řadě nádorů různého původu. Cílem našich studií je určení role FAP a FAP pozitivních buněk v nádorovém mikroprostředí v rozvoji primárních a sekundárních mozkových nádorů a posoudit potenciál FAP jako možného léčebného cíle. Expresi FAP jsme prokázali v nádorových i stromálních buňkách glioblastomů (GBM). Popsali jsme roli transformujícího růstového faktoru beta 1 (TGF beta 1) jakožto pozitivního regulátoru exprese FAP v buňkách GBM a prokázali, že FAP exprimující stromální elementy zvyšují migraci transformovaných buněk a stimulují nádorovou neovaskularizaci. Naše výsledky dále prokázaly vysokou přítomnost FAP exprimujících stromálních buněk v sekundárních mozkových nádorech. Ačkoliv role FAP v mozkových nádorech není dosud zcela objasněna, jeho velmi nízká exprese v nenádorové tkáni nabízí možnost selektivního zacílení nádorového mikroprostředí mozkových nádorů. V současné době testujeme originální PET/ SPECT proby a HMPA polymerní nosiče konjugované s vysoce specifickým inhibitorem (anti-FAP iBodies), které mají umožnit vizualizaci a léčebné zacílení této proteázy v mozkových nádorech.

Práce byla podpořena grantovým projektem AZV 15-31379A, Progres Q28/ 1LFUK a LM2015064 EATRIS-CZ.

XXVI/ 46. GLOBÁLNÍ PROFILOVÁNÍ EXPRESE MIKRORNA V MOZKOVÝCH METASTÁZÁCH

VEČEŘA M.¹, RADOVÁ L.¹, SIDOROVÁ S.¹, SIEGL F.1, SMRČKA M.², JANČÁLEK R.³, HERMANOVÁ M.⁴, KŘEN L.⁵, ŠÁNA J.^1,6, SLABÝ O.^1,7

¹CEITEC, MU, Brno, ²Neurochirurgická klinika LF MU a FN Brno, ³Neurochirurgická klinika LF MU a FN u sv. Anny v Brně, ⁴I. ústav patologie LF MU a FN u sv. Anny v Brně, ⁵Ústav patologie, LF MU a FN Brno, ⁶Klinika komplexní onkologické péče LF MU a MOÚ Brno, ⁷Biologický ústav, LF MU, Brno

Východiska: Mozkové metastázy (BM) jsou nejčastější intrakraniální nádory vyskytující se u 20–40 % dospělých onkologických pacientů. BM byla dlouho věnována malá pozornost a obecně byla indikována symptomatická paliativní péče bez snahy o výrazné prodloužení celkového přežívání (OS). Současný přístup k léčbě BM se mění, protože incidence v čase roste jako důsledek účinnější léčby primárních nádorů prodlužující OS a také zlepšení zobrazovacích metod k detekci menších asymptomatických BM. Ačkoli přežívání pacientů s BM je obecně nepříznivé, prognóza se individuálně výrazně liší. Proto by bylo užitečné posílit prognostické nástroje novými výkonnými molekulárními markery. V tomto ohledu jsou slibné mikroRNA (miRNA), nekódující RNA o délce 18–25 nt, které posttranskripčně regulují genovou expresi umlčením mRNA cílů. Jsou stabilní, a tak vhodné pro sekvenování (RNASeq) i retrospektivní analýzy ve tkáních fixovaných ve formalínu a zalitých v parafinu (FFPE). Ačkoli dysregulovaná exprese (DE) a diagnostický potenciál miRNA byly popsány u mnoha nádorů včetně BM, existuje jen malé množství studií popisujících expresní profilování miRNA v BM a hodnotících asociaci BM s OS. Materiál a metody: Pomocí RNA-Seq jsme provedli expresní analýzu čerstvě zmražených histopatologicky potvrzených 71 tkání BM (ca plic 37 %, melanom 23 %, ca prsu 18 %, RCC 15 %, CRC 7 %). Informovaný souhlas schválený etickou komisí byl obdržen od pacientů před započetím léčby. Příprava knihoven byla provedena pomocí QIAseq miRNA Library Kit. Statisticky hodnoceno bylo 2 437 maturovaných miRNA. Pro mapování čtení na referenční genom a součet čtení připadajících na cílovou sekvenci byl použit nástroj miraligner a pro diferenciální analýzu exprese limma. Výsledky: Diferenciální analýza objevila 373 miRNA s významně DE v 5 skupinách BM (p < 0,001). Neřízené shlukování založené na expresi 58 miRNA bylo schopné správně zařadit 42 % BM ca plic, 81 % BM melanomu, 85 % BM ca prsa, 82 % BM RCC a 100 % BM CRC. Pro následnou validaci byly vybrány miR-200c-3p, miR-141-5p, miR-141-3p, miR-200c-5p, miR-215-5p, miR-200b-3p, miR-211-3p, miR-429, miR-200a-3p a miR-200b-5p. Závěr: Uvedené výsledky potvrdily statisticky významnou dysregulovanou expresi miRNA v BM. Tyto RNA tak mají potenciál stát se vhodnými diagnostickými markery u BM. Výsledky budou ověřené na nezávislém retrospektivním souboru FFPE tkání a statisticky analyzovány v souvislosti s OS a současnými prognostickými skórovacími systémy.

Tato studie byla vypracována s grantovou podporou Ministerstva zdravotnictví ČR – grant č. NV18-03-00398.

XXVI/ 47. STUDIUM PIWI-INTERAGUJÍCÍCH RNA V RÁMCI PATOLOGIE GLIOBLASTOMU – NOVÁ ÚROVEŇ REGULACE GLIOBLASTOMOVÝCH KMENOVÝCH BUNĚK?

SIEGL F.¹, VEČEŘA M.¹, TRACHTOVÁ K.¹, AL TUKMACHI D.¹, BUŠEK P.², FADRUS P.³, SLABÝ O.^1,4, ŠÁNA J.^1,5

¹CEITEC, MU Brno, ²Ústav biochemie a experimentální onkologie, 1. LF UK v Praze, ³Neurochirurgická klinika LF MU a FN Brno, ⁴Biologický ústav, LF MU, Brno, ⁵Klinika komplexní onkologické péče LF MU a MOÚ Brno

Východiska: Glioblastom (GBM) je nejčastějším maligním nádorem mozku astrocytárního původu. Navzdory radikální terapii je recidiva GBM častou a poměrně brzkou událostí v průběhu onemocnění. Jedním z mechanizmů recidivy GBM je existence glioblastomových kmenových buněk (GSC), schopných odolávat terapii a zakládat nová ložiska GBM. Klíčovou roli v jejich biologii mohou hrát PIWI-interagující RNA (piRNA), zodpovědné za udržování stability genomu, zejména u zárodečných a kmenových buněk. Nicméně dysregulace jejich exprese byla popsána u řady nádorových onemocnění, vč. GBM. Identifikace specifických piRNA u GSC by mohla vést k odlišení těchto buněk od diferencovaných buněk GBM a k jejich možnému zacílení. Materiál a metody: Pro derivaci párových buněčných primokultur byla využita disociovaná nativní GBM tkáň, následně rozdělená do dvou alikvotů s odlišnými podmínkami kultivace. GSC byly kultivovaný v DMEM/ F12 médiu s přídavkem růstových faktorů bFGF a EGF, pro diferencované buňky bylo využito DMEM médium s FBS (10 %). Pro sekvenační analýzu (NGS) byly vybrány párové kultury na základě exprese neurálních kmenových markerů CD133 a SOX2, schopnosti zakládat nádory v imunodeficientních myších a schopnosti diferencovat. Pro přípravu cDNA knihoven byl využit NEXTFLEX Small RNA-Seq Kit v3. V rámci přípravy knihoven byla prodloužena ligace 3‘ adapteru a vzorky byly ošetřeny blokovacími oligonukleotidy pro YRNA a tRNA fragmenty. Sekvenační analýza byla provedena s využitím Next500/ 550 High Output v2 Kitu pro 75 cyklů a sekvenátoru NextSeq 500. Výsledky: Pro NGS bylo vybráno 12 párových primokultur na základě exprese CD133 (průměrné množství CD133+ buněk = 67,5 %, jednotlivé GSC kultury se pohybují v intervalu 22,5–99,2 % CD133+ buněk, diferencované linie v intervalu 0,14–1,17 % CD133+ buněk), SOX2 (průměrné množství SOX2+ buněk = 51,2 %, jednotlivé GSC kultury se pohybují v intervalu 97,2–1,34 % SOX2+ buněk, diferencované linie v intervalu 2,96–0,23 % SOX2+ buněk), schopnosti zakládat nádory v imunodeficientních myších a schopnosti diferencovat v případě GSC linií. Výsledky NGS se bioinformaticky zpracovávají a budou publikovány na konferenci Brněnské onkologické dny 2021. Závěr: PiRNA specificky dysregulované v GSC mohou představovat slibný nástroj pro identifikaci a terapeutické zacílení těchto buněk, což by v konečném důsledku mohlo významným způsobem ovlivnit prognózu pacientů s GBM.

Podpořeno z programového projektu MZ ČR s reg. č. NV19-03-00501. Veškerá práva podle předpisů na ochranu duševního vlastnictví jsou vyhrazena.

XXVI/ 118. PŘEDSTAVENÍ CENTRA UMĚLÉ INTELIGENCE V ONKOLOGII

KOZUBEK M.

Centrum analýzy biomedicínského obrazu, MU, Brno

Východiska: Umělá inteligence postupně proniká do různých oblastí lidské činnosti nevyjímaje zdravotnictví včetně onkologie. Pro zlepšení uplatnění umělé inteligence v onkologii je nezbytná spolupráce expertů z oblastí informatiky, biologie a medicíny. Za tímto účelem vzniká v Brně Centrum umělé inteligence v onkologii zkoumající aplikace umělé inteligence v boji s rakovinou. Cíl: Posláním Centra umělé inteligence v onkologii je výzkum vzniku, diagnostiky a léčby rakoviny. Naše hlavní zaměření je analýza biomedicínských obrazů, ale rovněž se věnujeme dolování dat ze záznamů o pacientech. Rozvíjíme dialog a spolupráci expertů různých odborností pocházejících z univerzit, výzkumných ústavů, nemocnic a průmyslu. Zaměřujeme se na využití umělé inteligence v těch onkologicky relevantních úlohách, které jsou příliš časově náročné nebo dokonce nezvládnutelné lidským úsilím. Snažíme se přispět jak k obecnému pokroku v pochopení jevů souvisejících s rakovinou, tak k personalizované péči o pacienta. Pracujeme se třemi druhy vstupních dat: data z medicínského zobrazování (2D/ 3D obrazy nebo videa vyšetřovaného orgánu pacienta s nádorem získaná pomocí MRI, CT, PET, UZ nebo jiných modalit), data z biologického zobrazování (2D/ 3D obrazy nebo videa nádorových buněk nebo tkání včetně uměle pěstovaných sféroidů nebo organoidů po aplikaci určitého léčiva získaná pomocí mikroskopie) a neobrazová data (údaje o pacientech, např. fyzické, rodinné nebo „lifestyle“ charakteristiky + klinické poznámky a další lékařské záznamy integrované se souvisejícími biomedicínskými datovými soubory zahrnující např. geny, mutace, proteiny, buněčné cesty, nemoci, intervence, léky nebo publikace). Vstupní data jsou zpracovávána pomocí umělé inteligence, typicky pomocí postupů strojového učení, zpravidla hlubokého učení. Jelikož se většinou používá učení s učitelem, musí být dostatečné množství dat doplněno správnými odpověďmi poskytnutými experty (tzv. zlatý standard co se týče referenčních anotací) pro fázi vývoje algoritmu. Po trénovací a validační fázi může být vyvinutý postup/ model aplikován na další neanotovaná data. Výsledek umělé inteligence by měl být následně interpretován s obezřetností a kombinován s lidskou inteligencí. Závěr: Výstupy umělé inteligence slouží finálně lékařům jako pomůcka pro přijímání rozhodnutí ohledně prevence, diagnózy nebo léčby buď ve formě obecného know-how, které by se mělo vzít v potaz, anebo jako specifický podnět pro konkrétního pacienta. Bližší informace lze nalézt na webových stránkách Centra umělé inteligence v onkologii na https:/ / onco.fi.muni.cz/ .

XXVI/ 198. INFEKCE VIREM SARS-COV2 PŘEDEVŠÍM U DĚTÍ SE ZHOUBNÝMI NÁDORY: LÉČBA REMDESIVIREM

PETRUS J.¹, DUNOVSKÁ K.¹, KLAPKOVÁ E.¹, HOSNEDLOVÁ B.², JAKUBEK M.², ČEPOVÁ J.¹, PRŮŠA R.¹, KIZEK R.¹

1FN Motol, Praha, ²BIOCEV, 1. LF UK v Praze

Virus SARS-CoV2 (+ssRNA) se váže na receptory ACE2 a (TLR)2. Nedávno bylo zjištěno, že (TLR)2 interaguje s SARS-CoV2 (a dalšími β-koronaviry). Receptor řídí zánětlivou cytokinovou produkci. Potencionálně přispívá k narušení regulace imunitní odpovědi u pacientů s covidem-19 a způsobí vážné zdravotní komplikace. Předpokládáme, že nemocní se zhoubnými nádory jsou rizikovou skupinou. Pro léčbu je doporučován remdesivir (analog adenosinu). Remdesivir se metabolizuje systémem cytochromů (CYP2C8, CYP2D6 a CYP3A4) na aktivní formu. Jako analog adenosinu ovlivňuje virovou replikaci. Cílem práce bylo z dostupné literatury provést srovnávací analýzu virové infekce u dětských pacientů se zhoubným nádorem a použitou léčbou a zavést metodu pro stanovení remdesiviru v biologickém vzorku pomocí LC-MS/ MS. Podle aktuálních dat WHO bylo k 25. 6. 2021 potvrzeno 179 513 309 případů a zemřelo 3 895 661 (2,17 %) nemocných. V původních sděleních bylo zařazeno 720 pacientů a zemřela 2,4 %. V přehledových studiích bylo uvedeno 527 pacientů a zemřela 3 %. V běžné populaci se pohybuje smrtnost souvisejících s SARS-CoV2 kolem 2–5 %; u dětí se pohybuje kolem 1 %. Monitorování hladiny remdesiviru a jeho metabolitů se rutinně neprovádí, a proto by bylo vhodné zavést metodu stanovení remdesiviru a jeho metabolitu u onkologických pacientů pro vhodnější nastavení léčby. Zaměřili jsme se na optimalizaci techniky LC-MS/ MS v biologickém vzorku s využitím gradientu mobilních fází. Vyvinutá metoda umožní studovat léčbu remdesivirem a jeho případné interakce s bílkovinami (především albuminem) u pacientů s vážným průběhem onemocnění. Zavedení metody LC-MS/ MS pro monitorování hladin remdesiviru a jeho metabolitu do klinické praxe by mohlo přinést zcela nové poznatky a informace o farmakokinetice a farmakodynamice a zlepšit šance pacientů s infekcí SARS-CoV2. Práce byla realizována za podpory organizace Liga proti rakovině Praha a za institucionální podpory FN Motol.

XXVI/ 206. STUDIUM INTRATUMOROVÉ HETEROGENITY A SESTAVENÍ TROJROZMĚRNÝCH MUTAČNÍCH PROFILŮ U POKROČILÝCH KOLOREKTÁLNÍCH LÉZÍ

SEMYAKINA A.¹, PTÁČKOVÁ R.¹, MINÁRIK M.², HÁLKOVÁ T.¹, SUCHÁNEK Š.³, TRABOULSI E.⁴, BROGYUK N.³, ZAVORAL M.3, BENEŠOVÁ L.¹

¹Genomac výzkumný ústav, s.r.o., Praha, ²Elphogene, s.r.o., Praha, ³Interní klinika 1. LF UK a ÚVN Praha, ⁴Oddělení patologie, ÚVN Praha

Východiska: V posledních letech výzkum kolorektálního karcinomu (CRC) a jeho premaligních lézí postupuje stále více směrem ke stanovení přítomnosti, lokalizace a rozšíření genetických změn v rámci nádoru, tzv. intratumorové genetické heterogenity (ITH). Ta má význam pro charakterizaci jednotlivých nádorových klonů, zejména pokud jde o jejich vznik, vývoj v prostoru a čase, vzájemné vztahy s okolním prostředím, vliv na průběh nemoci a odpověď na různé druhy léčby. V naší studii jsme zkoumali ITH 34 premaligních lézí a navrhli trojrozměrné modely jejich mutačních klonů. Materiál a metody: Do studie bylo zařazeno celkem 34 lézí (z nich 29 adenomů, 4 hyperplastické polypy a 1 intramukozální karcinom) o velikosti > 10 mm, které byly získány během screeningového kolonoskopického vyšetření. Vzorky byly rozkrájeny na 6–26 dílků v závislosti na velikosti a byla k nim pořízena podrobná fotodokumentace pro následující sestavení trojrozměrného modelu. Z každé části byla izolována DNA a provedena heteroduplexní analýza přítomnosti mutací v 11 oblastech 5 genů: KRAS, BRAF, TP53, PIK3CA, APC. Genetická data byla porovnána s histopatologickými. Následně byly navrženy 3D modely mutačního profilu každé léze. Výsledky a závěr: Molekulárně-genetická analýza odhalila výraznou heterogenitu adenomů, a to jak v počtu mutací, tak i v zastoupení mutačních klonů v rámci každé léze. Při srovnání mutačních profilů bylo zjištěno, že stejné typy lézí vykazují shody. Vytvořené trojrozměrné modely ukazují, že mutační klony vznikají nezávisle v různých částech lézí, což podporuje tzv. big-bang teorii vzniku kolorektálních neoplazií. Kromě lepšího porozumění molekulární morfogenezi premaligních lézí by získané výsledky také mohly pomoci při jejich endoskopické resekci, zejména v případech, kdy není (většinou z důvodu umístění či velikosti) možnost jejich odstranění v jednom celku a snížit tak riziko lokální rekurence.

Podpořeno z projektu MZ ČR s reg. č. 17-31909.

XXVI/ 207. REGULACE KONTROLNÍCH BODŮ IMUNITNÍ REAKCE U NÁDOROVÝCH BUNĚK POMOCÍ HSP90 INHIBITORŮ

ZATLOUKALOVÁ P.¹, BONCZEK O.², MÜLLER P.³, KREJČÍŘ R.², HRABAL V.², FRIEDLOVÁ N.⁴, COATES P.⁵, VOJTĚŠEK B.²

¹Regionální centrum aplikované molekulární onkologie, MOÚ Brno, ²Výzkumná skupina B. Vojtěška, MOÚ Brno, ³Výzkumná skupina P. Müllera, MOÚ Brno, ⁴RECAMO, MOÚ Brno, ⁵Výzkumná skupina P. J. Coatse, MOÚ Brno

Molekulární chaperony se podílejí na udržení homeostázy proteinů v buňce a to tím, že regulují vytvoření správné konformace „klientských“ proteinů, z nichž mnohé jsou důležité pro proliferaci a přežití buněk. Klíčovým chaperonem je Hsp90, který spolu s proteiny rodiny Hsp70 je součástí chaperonového systému. Mnoho onkogenních proteinů umožňujících proces maligní transformace buňky vyžaduje stabilizaci molekulárními chaperony. Proto u řady nádorových buněk byla zjištěná zvýšená hladina HSP90, která je požadovaná pro jejich růst a přežití v nepříznivých podmínkách nádorového prostředí. Závislost nádorových buněk na zvýšené aktivitě chaperonu činí z Hsp90 slibný cíl protinádorové terapie a intenzivní výzkum v této oblasti vedl k syntéze řady látek inhibujících jejich funkci. Kontrolní body imunitní reakce jsou považovány za efektivní imunoterapeutické cíle. Značná pozornost je věnovaná především inhibiční dráze PD-1/ PD-L1, jejíž blokádou dochází k obnovení účinnosti imunitních mechanizmů a ke zvýšení protinádorové aktivity. I přes určité úspěchy této terapie mnoho pacientů vykazuje minimální odezvu nebo vznik rezistence. V posledních letech se objevují data ukazující, že chaperonový aparát může ovlivňovat imunitní odpověď a to regulací kontrolních imunitních bodů exprimovaných na povrchu nádorových buněk. Z našich předběžných výsledků vyplývá, že HSP90 ovlivňuje expresi PD-L1. Zjistili jsme také, že proteiny IFITM (transmembránové proteiny indukované interferonem) mohou působit obdobně jako PD-L1. Cílem projektu je objasnit, jakým způsobem inhibitory Hsp90 modifikují hladinu PD-L1 (i IFITM) a tím citlivost nádorových buněk na imunitní ataku. Transkripční faktory regulující bazální a indukované hladiny PD-L1/ IFITM budou identifikovány pomocí CRISPR-Cas9 screeningu a validovány v kombinaci s různými inhibitory Hsp90. Mechanizmy aktivace imunitní odpovědi pomocí inhibitorů budou studovány na více úrovních, což nám poskytne celkový pohled na principy umožňující kombinovat více imunoterapeutických přístupů.

XXVI/ 208. HODNOCENÍ PROTILÁTKOVÉ ODPOVĚDI U TERAPIE CHECKPOINT INHIBITORY

MÜLLER P.¹, BARDELČÍK M.², ŠIMONČÍK O.³, TICHÝ V.³, KŘIVÁNKOVÁ K.³, JAŠČUROVÁ J.⁴, GRELL P.⁵

¹RECAMO, MOÚ Brno, ²Úsek diagnostické bioptické patologie, MOÚ Brno, ³Výzkumná skupina P. Müllera, MOÚ Brno, ⁴LF MU, Brno, ⁵Klinika komplexní onkologické péče LF MU a MOÚ Brno

Zavedení inhibitorů PDL1 a PD1 CTLA4 přinesly v posledních letech průlom do imunoterapie solidních nádorů. Monoklonální protilátky blokující aktivaci receptorů PD-1 a CTLA4 a ligandu PD-L1 vedou k aktivaci buněčné imunitní reakce namířené proti nádorům nesoucím velkou mutační nálož. Mutované peptidy vystavené jako neoantigeny na povrchu nádorových buněk prostřednictvím MHCI jsou rozlišovány T buněčným receptorem (TCR), který vede k aktivaci buněčné imunity. Nádorové buňky zabraňují protinádorové imunitní odpovědi zvýšenou expresí ligandu PD-L1, který se váže na PD1 receptor na povrchu T buněk a blokuje tak jejich aktivaci. Další významnou roli v regulaci protinádorové imunitní odpovědi hraje checkpoint protein CTLA4, který obdobně jako PD1 inhibuje aktivaci T lymfocytů. Inhibičním signálem pro CTLA4 je pak vazba ligandů B7-1 a B7-2, které se nacházejí na povrchu antigen prezentujících buněk. Zatímco aktivace T lymfocytů je po aplikaci checkpoint inhibitorů dobře popsána, není jasné, zda může docházet i k aktivaci protilátkové odpovědi a tvorbě nádorově specifických protilátek nebo autoprotilátek zodpovědných za nežádoucí vedlejší účinky. Dosavadní studie věnující se protilátkové odpovědi u terapie checkpoint inhibitory se soustředili pouze na stanovení standardních autoprotilátek vyšetřovaných v rámci známých autoimunitních onemocnění. Otázkou proto zůstává, zda v důsledku působení checkpoint inhibitorů dochází ke vzniku nádorově specifických protilátek a zda se tyto protilátky podílejí na účinku terapie.

XXVI/ 209. PROTEINOVÁ KORONA A JEJÍ VÝZNAM PRO CÍLENOU LÉČBU U NÁDOROVÝCH ONEMOCNĚNÍ

KIZEK R.¹, HOSNEDLOVÁ B.², SEHNAL K.³, JAKUBEK M.², PARÁK T.⁴, PRŮŠA R.⁵, KEPINSKA M.⁶

¹FN Motol, Praha, ²BIOCEV, 1. LF UK v Praze, ³CONEM Metallomics Nanomedicine Research Group, Praha, ⁴Oddělení klinických laboratoří, Nemocnice Milosrdných bratří, Brno, ⁵Ústav lékařské chemie a klinické biochemie, 2. LF a FN Motol, Praha, ⁶Wroclaw Medical University, Poland

Nádorová onemocnění jsou druhou nejčastější příčinou úmrtí ve vyspělých zemích. Proteinová korona je souhrn všech proteinů reagujících s povrchem. Taková modifikace může významným způsobem ovlivnit chování povrchu/ částice. Různé typy částic mohou mít potenciál využití v léčbě zhoubných nádorů. Cílem práce je ukázat výhody a nevýhody proteinové korony. Je známo, že protinádorová terapie vykazuje řadu závažných nežádoucích účinků. Významným je nedostatek selektivity pro nádorovou tkáň s relativně nízkou terapeutickou koncentrací v místě nádoru. Nízká koncentrace protinádorového léčiva umožní buněčnou selekci a způsobuje rezistenci až multirezistenci nádorových buněk vůči léčivům. Personalizovaný přístup pro cílenou léčbu představuje moderní a efektivní způsob protinádorové terapie. Nanotechnologie přináší nové možnosti pro biologickou aplikaci. Lze připravit různé druhy nanotransportérů, které jako základ využívají uhlíkové, zlaté, stříbrné a další nanočástice. Nanotransportéry do buňky mohou vstoupit nezávisle na jejím typu a funkční skupině. Kromě toho fyzikálněchemické vlastnosti nanočástic hrají rozhodující roli v jejich potenciální buněčné toxicitě. Metody cílení jsou založeny na mechanizmu účinku EPR a specifickém kyselém prostředí v nádoru. Hledány jsou strategie cílení na vybraný nádor pomocí ligandů nebo protilátek. Velkou roli v specifickém zacílení nanotransportéru hraje proteinová korona. Proteinovou koronou se rozumí soubor všech proteinů, které se na nanočástice mohou vázat. Vytvoření proteinové korony je většinou asociováno s výrazným snížením terapeutického potenciálu nanočástic, ale mohou být využity i pro zvýšení tohoto potenciálu. Nezodpovězenou otázkou je interakce nanočástic s thiolovými sloučeninami, jako jsou nízkomolekulární glutation nebo metalothionein. Výzkum v této oblasti nanomedicíny je zcela otevřený a jistě přinese mnoho nečekaných objevů v blízké budoucnosti.

XXVI/ 215. PROTINÁDOROVÁ LÉČBA S VYUŽITÍM KONJUGÁTŮ SPECIFICKÝCH PROTILÁTEK A CHEMOTERAPEUTICKÝCH LÁTEK

TICHÝ V., ŠIMONČÍK O., BARDELČÍK M., KŘIVÁNKOVÁ K., MÜLLER P.

Výzkumná skupina P. Müllera, MOÚ Brno

Konjugáty specifických protilátek a léčiv (antibody-drug conjugates – ADC) představují elegantní přístup k léčbě rakoviny, který spojuje specificitu monoklonálních protilátek s cytotoxicitou klasických chemoterapeutických látek, což teoreticky umožňuje zvýšenou aktivitu a sníženou toxicitu. Konjugáty typu ADC se skládají ze tří částí – monoklonální protilátky, cytotoxického činidla a linkeru, přičemž všechny tři prvky mají významný dopad na účinnost konjugátu. Protilátka je odpovědná za rozpoznání cílového antigenu, který je v ideálním případě nádorově specifický a oproti zdravým buňkám nadměrně exprimovaný. Chemoterapeutická látka by měla vykazovat dostatečnou účinnost vzhledem k jejímu omezenému množství, které vstoupí do buňky. Nejčastěji používanými látkami jsou analogy auristatinu a maytansinu, což jsou klasická cytotoxická činidla, jejichž cílem je narušení mechanizmu tvorby mikrotubulů. Linker spojuje monoklonální protilátku s chemoterapeutickou látkou a ovlivňuje rozpustnost a stabilitu konjugátu během výroby a také uvolňování účinné látky. Konjugáty typu ADC lze rozdělit na dvě skupiny, a to konjugáty se štěpitelným linkerem (např. SYD985), které uvolňují léčivo v závislosti na koncentraci glutathionu, Ph nebo prostřednictvím enzymatické proteolýzy, a konjugáty s neštěpitelným linkerem (např. T-DM1), které vyžadují degradaci uvnitř lysozomu po internalizaci. Praktickým příkladem je již zmíněný T-DM1, který je dosud jediným schváleným konjugátem typu ADC pro léčbu rakoviny prsu. Je postaven na monoklonální protilátce trastuzumab, která se váže na specifický epitop receptoru HER2. Účinnou látkou je emtansin (DM1), derivát maytansinu, který je silným inhibitorem polymerace tubulinu nezbytného pro buněčné dělení. Počáteční úspěchy s T-DM1 daly vzniknout mnoha dalším studiím, které se v současné době zabývají vývojem účinnějších preparátů s vyšší specificitou a nižší systémovou toxicitou. V naší laboratoři se také snažíme navázat na tyto studie a připravit konjugát typu ADC s vysokou specificitou pro nádorové buňky produkující extracelulární molekulární chaperon Hsp90 (eHsp90). Protein Hsp90 se uplatňuje při skládání a stabilizaci funkční konformace klientských proteinů, což hojně využívají nádorové buňky pro udržování aktivovaného stavu onkoproteinů. Na rozdíl od zdravých buněk však maligní buňky vystavují Hsp90 také na membráně, odkud je procesem internalizace přijímán zpět do buňky. Právě lokalizace a internalizace proteinu eHsp90 představují slibný potenciál pro vývoj konjugátu typu ADC.

XXVI/ 216. DETECTION OF CANCER-SPECIFIC LONG NON-CODING RNAS IN EXOSOMES AND TISSUE SAMPLES FROM COLORECTAL CANCER PATIENTS

MADRZYK M.¹, CATELA IVKOVIĆ T.¹, VYCHYTILOVÁ P.¹, KOTOUČEK J.², MAŠEK J.², SLABÝ O.¹

¹CEITEC, MU, Brno, ²Veterinary Research Institute (VÚVL), Brno

Background: Exosomes are nanosized extracellular vesicles that facilitate cell-to-cell communication on a local and systemic level. They contain nucleic acids, proteins and other bioactive molecules that refl ect biological properties of the parental cell [1]. Cancer-derived exosomes carry tumour specific molecules which makes them a potentially interesting source of circulating cancer-specific markers [2]. In colorectal cancer (CRC), late diagnosis is associated with poor prognosis. Therefore, non-invasive, and clinically validated biomarkers that can detect cancer at an early stage are needed [3]. This gap could be filled by circulating exosomal long non-coding RNAs (lncRNAs). Some lncRNAs are enriched and more stable in exosomes, suggesting they might have an important role in the cancer development and progression [4]. We focused on the detection of cancer-specific lncRNAs in exosomes isolated from CRC patient serum samples and compared it to their expression in CRC tissue and adjacent normal mucosa. Material and methods: Exosomes were isolated from human blood serum collected from CRC patients and healthy donors. Exosomes were validated according to the ISEV guidelines. Long ncRNAs were preamplified and then quantified by qRT-PCR. Results: We successfully detected cancer specific lncRNAs in exosomes that were isolated from CRC patient blood sera. ZFAS1, MALAT1, NEAT1 were detected both in exosomes and colonic tissue, HOTAIR and CRNDE-h were found only in the tissue but not in the exosomes. Conclusion: Some lncRNAs present in CRC tissue were also found in circulating exosomes which shows that cancer-specific lncRNAs could be detected by non-invasive methods. Our data also show that exosomal lncRNAs can be detected even in low amount of patient samples and therefore they could potentially be used in the clinical application.

This work was supported from the projects GA20-18889S, BBMRI-CZ no. LM2018125, CZ.02.1.01/ 0.0/ 0.0/ 15_003/ 0000495, and MZE-RO0518.

References: [1] Pickl J, Heckmann D, Ratz L et al. Novel RNA markers in prostate cancer: functional considerations and clinical translation. Biomed Res Int 2014; 2014: 765207. doi: 10.1155/ 2014/ 765207. [2] Sun W, Luo JD, Jiang H et al. Tumor exosomes: a double-edged sword in cancer therapy. Acta Pharmacol Sin 2018; 39(4): 534–541. doi: 10.1038/ aps.2018.17. [3] Yang Y, Yan X, Li X et al. Long non-coding RNAs in colorectal cancer: novel oncogenic mechanisms and promising clinical applications. Cancer Lett 2021; 504: 67–80. doi: 10.1016/ j.canlet.2021.01.009. [4] Yu M, Song XG, Zhao YA et al. Circulating serum exosomal long non-coding RNAs FOXD2-AS1, NRIR, and XLOC_009459 as diagnostic biomarkers for colorectal cancer. Front Oncol 2021; 11: 618967. doi: 10.3389/ fonc.2021.618967.

XXVI/ 217. PENTAMETINIOVÁ SŮL – NOVÝ FOTOSENZIBILIZÁTOR S POTENCIÁLEM VE FOTODYNAMICKÉ TERAPII NÁDORŮ

KREJČÍŘ R.¹, BŘÍZA T.², ŠTĚRBA M.¹, MÜLLER P.¹, COATES P.¹, MARTÁSEK P.³, VOJTĚŠEK B.¹, ZATLOUKALOVÁ P.¹

¹RECAMO, MOÚ Brno, ²Vysoká škola chemicko-technologická; 1. LF UK v Praze ³Klinika dětského a dorostového lékařství 1. LF UK a VFN v Praze

Fotodynamická terapie je léčebná metoda využívající kombinaci fotosenzitizující látky a světla k selektivní eliminaci nádorových buněk. Mezi výhody této metody patří její neinvazivní charakter, přesné zaměření na nádorovou tkáň a nízká toxicita pro organizmus. Základem léčby je lokální nebo systémová aplikace fotosenzibilizátoru, který v kombinaci se světlem o vhodné vlnové délce produkuje reaktivní kyslíkové radikály (fotodynamický efekt) poškozující nádorové buňky. V naší studii jsme se zaměřili na látku ze skupiny pentametiniových solí (sůl 1), která sama o sobě vykazuje protinádorové působení a současně interaguje se světlem za vzniku fototoxické reakce. S využitím kultivovaných nádorových buněk in vitro jsme zjišťovali, jaké světlo je pro fotoexcitaci soli 1 nejvhodnější, jaká koncentrace soli 1 a světelná dávka je potřebná pro potlačení růstu nádorových buněk a jaká je jejich reakce na toto ošetření. Zjistili jsme, že z testovaných vlnových délek je nejúčinnější délka 630 nm spadající do červené oblasti spektra, přičemž právě červené světlo se využívá ve fotodynamické terapii díky své dobré prostupnosti do tkání. Dále jsme zjistili, že v buňkách ošetřených solí 1 je po vystavení světlu o délce 630 nm výrazně zvýšená hladina reaktivních kyslíkových radikálů a potvrdili jsme tak, že dochází k navození fotodynamického efektu. Sůl 1 se uvnitř buňky specificky hromadí v mitochondriích a ty jsou fototoxickým účinkem poškozovány. Dochází k narušení jejich struktury a také k poklesu mitochondriálního membránového potenciálu, což je ukazatel kondice těchto organel. V případě výrazného fototoxického poškození potom buňky vstupují do apoptózy a odumírají. Sůl 1 se ukázala jako vhodný fotosenzibilizátor také díky své účinnosti při nízkých koncentracích (IC50 = 121 nm) a fotoexcitaci při nízkých dávkách aplikovaného světla (5 J/ cm²). Sůl 1 je proto vhodným kandidátem pro použití ve fotodynamické terapii nádorů a vzhledem k jejímu protinádorovému působení i bez aplikace světla by při úspěšném otestování na zvířecích modelech mohla nabídnout možnost kombinovat dva terapeutické přístupy, systémovou chemoterapii a lokální fotodynamickou terapii.

Podpořeno z Evropského fondu pro regionální rozvoj – projekt ENOCH (reg.č.: CZ.02.1.01/ 0.0/ 0.0/ 16_019/ 0000868).

XXVI/ 218. VLIV IFITM1 NA „SURFACEOM“ BUNĚK CERVIKÁLNÍHO KARCINOMU

FRIEDLOVÁ N.¹, DOSEDĚLOVÁ L.², ZAVADIL KOKÁŠ F.², HERNYCHOVÁ L.², VOJTĚŠEK B.¹, NEKULOVÁ M.²

¹Výzkumná skupina B. Vojtěška, MOÚ Brno, ²RECAMO, MOÚ Brno

Interferon-induced transmembrane protein 1 (IFITM1) je membránový protein, jehož zvýšená exprese byla potvrzena u řady typů nádorů a je spojována s vyšší proliferací, migrací a invazivitou nádorových buněk. IFITM1 také přispívá k rezistenci nádorových buněk vůči radioterapii, chemoterapii a působení inhibitorů aromatázy. Naše výsledky ukazují, že IFITM1 ovlivňuje hladinu HLA třídy I [1]. IFITM1 také pozitivně koreluje s vyšším počtem imunitních buněk infiltrujících nádor. Abychom odhalili další membránové proteiny regulované proteinem IFITM1, které ovlivňují mezibuněčnou komunikaci, provedli jsme analýzu „surfaceomu“ s využitím techniky pulzního SILAC (stable isotope labeling with aminoacids in cell culture), izolace povrchových proteinů a hmotnostní spektrometrie na modelu buněčné linie SiHa odvozené od cervikálního karcinomu a jejích stabilních derivátů s cíleně vyřazeným genem kódujícím IFITM1 (IFITM1 KO). Hladina vybraných povrchových proteinů potenciálně regulovaných IFITM1 (CD166, CD40, CD276) byla verifikována pomocí průtokové cytometrie. Prokázali jsme výrazně nižší hladinu proteinu CD166 (activated leukocyte cell adhesion molecule – ALCAM) na povrchu IFITM1 KO buněk. Tento protein je exprimován různými typy buněk a slouží jako ligand pro CD6 na T lymfocytech. CD166 je navíc označován jako potenciální marker nádorových kmenových buněk, regulátor epiteliálněmezenchymální tranzice a promotor metastáz. Na základě těchto vlastností analyzujeme protein CD166 dále ve funkčních studiích. Buněčnou linii SiHa lze krátkodobě sortovat na populace zahrnující buňky s vysokou (CD166high) a nízkou (CD166low) expresí CD166. CD166high populace vykazuje mezenchymální fenotyp ve srovnání s epiteliálním fenotypem populace CD166low, což podporuje data publikovaná u jiných typů nádorů. CD166 usnadňuje tvorbu cervikosfér a migraci nádorových buněk. Souvislost IFITM1 a CD166 tak otevírá nový směr studia v oblasti nádorové progrese a interakce nádoru s imunitním systémem. Přítomnost obou proteinů na povrchu buněk umožňuje snadnější detekci a modulaci jak ve fázi studia jejich funkcí, tak potenciálně v přístupech protinádorové (imuno)terapie.

Podpořeno z projektu Grantové agentury ČR s č. 18-23773Y, projektu OP VVV „Molekulární, buněčný a klinický přístup ke zdravému stárnutí“ (ENOCH) č. CZ.02.1.01/ 0.0/ 0.0/ 16_019/ 0000868 a programů NVV MOÚ pro podporu vědy a výzkumu č. PPV 4/ 2018 a PPV 1/ 2021.

Literatura: [1] Gómez-Herranz M, Nekulova M, Faktor J et al. The eff ects of IFITM1 and IFITM3 gene deletion on IFNγ stimulated protein synthesis. Cell Signal 2019; 60: 39–56. doi: 10.1016/ j.cellsig.2019.03.024.

XXVI/ 255. ANALÝZA ERBB2 AMPLIKÓNU V IVF PROCESE

LAMANCOVÁ P.¹, URDZIK P.², TOPORCEROVÁ S.³, KUNCOVÁ B.², RABAJDOVÁ M.¹

¹Ústav lekárskej a klinickej biochémie, LF UPJŠ v Košiciach, Slovenská republika, ²Gynekologicko-pôrodnícka klinika LF UPJŠ v Košiciach, Slovenská republika, ³Gynekologicko-pôrodnícka klinika LF UPJŠ a UN L. Pasteura, Košice, Slovenská republika

Východiská: Neplodnosť je globálny zdravotný problém ovplyvňujúci ľudí v reprodukčnom veku. Podľa súčasných údajov neplodnosťou trpí 186 miliónov jednotlivcov na svete, v dôsledku čoho stúpol počet in vitro fertilizácie (IVF). Zásadný proces v ženskom reprodukčnom systéme je angiogenéza, vplýva okrem iného aj na folikulogenézu a funkciu corpus luteum. Ovplyvňuje však aj niektoré patologické procesy v organizme. Medzi najvýznamnejšie faktory zapojené do angiogenézy patrí rodina vaskulárnych endotelových faktorov (VEGF, PLGF), angiopoetíny (Ang1,2), endoglín a signálne dráhy zahrňujúce ErBb2 a NOTCH3. Gény v ErbB2 amplikóne sa považujú za pozitívne modulátori expresie VEGF, ktorý sa podieľa na regulácii normálnej a patologickej angiogenézy. Overexprimácia ErbB2 amplikónu aktivuje VEGF prostredníctvom rôznych transkripčných faktorov – STAT3, Sp1 a hypoxiou indukovateľných faktorov (HIF). ErbB2 amplikón je tvorený skupinou génov, ktoré sú overexprimované v bunkách karcinómu prsníka a vaječníkov. Predpokladá sa, že jeden z týchto génov pôsobí ako spúšťač a vedie k deregulácii ostatných génov v amplikóne. Deregulácia amplikónu vedie k deregulácii angiogenézy nielen na molekulovej, ale aj na proteínovej úrovni, čo vo výsledku môže viesť k ovplyvneniu fyziologických procesov aj z hľadiska fertility. Ciele: Cieľom predkladanej štúdie bola detekcia proteínov ErbB2 amplikónu v sére žien v IVF procese. Materiál a metódy: Experimentálna skupina pozostávala z 38 pacientiek s výsledkom gravidity po IVF procese a 37 s negatívnym výsledkom gravidity v IVF programe. Hladiny exprimácie proteínov ErbB2 amplikónu boli detegované ELISA metódou. Výsledky: Štúdia poukázala na zvýšenie priemerných hodnôt sledovaných proteínov ErbB2 amplikónu u pacientiek s negatívnym výsledkom gravidity po IVF v porovnaní s pacientkami s výsledkom gravidity po IVF. U pacientiek s negatívnym výsledkom gravidity boli detegované zvýšené expresie proteínov ErbB2 o 22 %, Mien1 o 8 %, IKZF3 o 6,9 %, ERα o 42 % a ERβ o 342 % v porovnaní s pacientkami s pozitívnym výsledkom gravidity po IVF. Detegovali sme zníženie GRB7 o 6 % u pacientiek s negatívnym výsledkom gravidity po IVF v porovnaní s pacientkami s výsledkom gravidity po IVF. Signifikantné pozorované zmeny boli analyzované na hladine významnosti p ≤ 0,05. Záver: Získané výsledky hladín ErbB2 amplikónu naznačujú, že dereguláciou expresie ErbB2 amplikónu môže dochádzať ku zmenám na úrovni angiogenézy u neplodných pacientiek.

Táto práca bola podporovaná z projektu VEGA 1/ 0620/ 19, VEGA 1/ 0540/ 2021.

XXVI/ 262. PREDIKCE ODPOVĚDI NA LÉČBU IMUNOTERAPIÍ CHECKPOINT INHIBITORY U PACIENTŮ S POKROČILÝMI SOLIDNÍMI NÁDORY

BOŘILOVÁ S.¹, FABIAN P.², ZDRAŽILOVÁ DUBSKÁ L.³, SELINGEROVÁ I.⁴, MÜLLER P.⁵, KISS I.¹, VYZULA R.¹, GRELL P.¹

¹Klinika komplexní onkologické péče LF MU a MOÚ Brno, ²Oddělení onkologické a experimentální patologie, MOÚ Brno, ³Oddělení klinické mikrobiologie a imunologie, FN Brno, ⁴MOÚ Brno, ⁵RECAMO, MOÚ Brno

I přes široké využití imunoterapie v léčbě solidních nádorů je terapie checkpoint inhibitory účinná pouze u 20–40 % pacientů. Proto cílem našeho projektu je predikovat odpověď na imunoterapii na základě komplexní analýzy nádoru, jeho mikroprostředí a imunitního stavu pacienta. Doposud jsme prospektivně zahrnuli 70 pacientů s pokročilými nebo metastatickými solidními nádory, kteří byli léčeni anti-PD-1/ anti-PDL-1 protilátkami. U těchto pacientů provádíme komplexní molekulární charakterizaci nádoru a imunoprofilaci periferní krve pacienta. Tkáň tumoru se hodnotí IHC barvením pro různé subpopulace imunitních buněk (CD3+, CD4+, CD8+, CD45RO+, FoxP3+) a markery (PD-L1, Tim-3, Granzyme B, IDO1, IFN-y, MMR proteiny). Dále bylo provedeno komplexní genomické sekvenování. V buňkách periferní krve provádíme deskriptivní imunoprofilaci základních imunitních regulátorů a efektorů a jejich dynamiku během imunoterapie. Do studie bylo zařazeno 70 pacientů (34x maligní melanomů, 23x NSCLC, 8x renální karcinom, 2x kolorektální karcinom, 1x karcinom močového měchýře, 1x karcinom jícnu, 1x testikulární nádor), medián věku byl 67 let, 52 mužů. Odpověď na léčbu byla následující: kompletní odpověď u 10 %, parciální 24 %, stabilizace 10 % a progrese onemocnění u 52 % (u 7 % nehodnoceno). Medián přežití bez progrese byl 7,3 měsíce (95% CI; 5,1–12,9) a medián celkového přežití 17,6 měsíce (95% CI; 11,8–25,4). U části pacientů byla provedena předběžná deskriptivní imunoprofilace i imunitních regulátorů a efektorů periferní krve a jejich dynamiku. Pozorovali jsme signif kantně vyšší výchozí (před léčbou) počet T buněk (p = 0,008) a podíl CD8+ cytotoxických T buněk (p = 0,013) u respondérů (CR + PR + dlouhodobá SD). Nebyl zjištěn žádný významný rozdíl v CD4+, ALC (absolutní počet lymfocytů) a regulačních T buňkách (Tregs). Na konferenci budou prezentovány aktualizované a rozšířené výsledky odpovědi na léčbu ve vztahu k perifernímu imunoprofilu a výsledkům imunohistochemie.

Projekt byl podpořen MZ ČR, grant č. NV18-03-00339.

XXVI/ 263. STRESS RESPONSE REGULATION IN CANCER CELLS BY MACROMOLECULAR CROWDING

ŠIMONČÍK O.¹, MÜLLER P.², BARDELČÍK M.³, TICHÝ V.⁴, KŘIVÁNKOVÁ K.⁴

¹Regional Centre of Applied Molecular Oncology, MMCI Brno, Czech Republic ²RECAMO, MMCI Brno, Czech Republic, ³Department of Diagnostic Bioptic Pathology, MMCI Brno, Czech Republic, ⁴P. Müller’s Research Group, MMCI Brno, Czech Republic

Malignant transformation is associated with increased demands on the maintenance of protein homeostasis due to enhanced proteosynthesis and production of unstable proteins. Heat shock response (HSR) represents fundamental homeostatic mechanism constitutively activated in cancer cells. The major mediator is heat shock factor 1 (HSF1), which regulates the expression of stress related genes. Under physiological conditions, HSF1 is kept in inactive monomeric form. The stress conditions, common in advanced cancer, lead to HSF1 activation. HSF1 is assembled in trimers that bind DNA, undergo posttranslational modifications and activate transcription of downstream genes. HSF1 activation also leads to formation of characteristic chromatine structures known as nuclear stress bodies. Although HSR has been extensively studied, key aspects governing HSF1 activation remain a mystery. It is unclear whether HSF1 functions as a stand-alone stress sensor, or serves as a node integrating various cellular signalling pathways. While the heat shock response is well manifested in metabolically active cells, HSF1 activation is restricted in nutritionally deprived and quiescent cells. Altogether, the data point to the importance of total protein load for HSF1 activation. Therefore, we considered the phenomenon of macromolecular crowding to explain the global eff ect of protein load on HSF1 conformation. We used fl uorescent microscopy to study NSBs formation and HD exchange or native electrophoresis for conformational studies. By using cancer cell line expressing fl uorescently labeled HSF1 we observed that HSF1 is localized mainly in the nucleus and in response to enhanced crowding it forms nuclear stress bodies. This eff ect was diminished by co-treatment of cells with protein synthesis inhibitors. We also observed the conformational changes of HSF1 by modulating the intracellular environment. In this case, reduced crowding prevents initial steps of HSF1 activation despite persisting stress. Our results also show that HSF1 exists as a stable monomer without the help of chaperones under normal physiological conditions. Although chaperones may play a role in folding HSF1 monomers, they do not form permanent complexes to stabilize this conformation. In particular, the experiments where total protein load in cells were reduced by inhibiting proteosynthesis clearly show that HSF1 monomers are stable when Hsp90 is inhibited. We propose that conformational changes of monomeric HSF1 are primarily driven by physical conditions that determine the state with the lowest Gibbs free energy.

XXVI/ 264. THE ROLE OF HSF1 IN THE REGULATION OF THE TRANSCRIPTIONAL RESPONSE TO STRESS

BARDELČÍK M., MÜLLER P., ŠIMONČÍK O., TICHÝ V., KŘIVÁNKOVÁ K.

P. Müller’s Research Group, MMCI Brno, Czech Republic

Transcription factor HSF1 is overexpressed in a variety of human cancers, which is associated with cancer aggressiveness and could be used as a prognostic biomarker. Genome instability, high mutation frequency, and increased proteosynthesis lead to activation of stress signaling pathways which include HSF1 activation and chaperone gene expression. Under normal conditions, HSF1 occurs in a monomeric conformation which cannot bind to DNA. Under stress conditions, three hydrophobic regions (HR-A, B and C) of HSF1 are exposed to the solvent and consequently, HSF1 is assembled into trimers. HSF1 trimers bind to DNA, undergo posttranslational modifications (PTMs) and trigger the expression of chaperones. Overexpression of chaperones then works as a negative feedback loop, when Hsp70 binds activated HSF1 trimers and facilitates their inactivation. HSF1 activity is regulated also by PTMs such as phosphorylation, acetylation and sumoylation. By comparing cells with high and low malignant potential, HSF1-regulated transcriptional program, specific to highly malignant cells, was identified and it was distinct from heat shock response. In particular, it remains unanswered whether HSF1, its isoforms, and/ or its PTMs are solely responsible for altered gene expression, or if other transcription factors synergizing with HSF1 are involved. For these needs, we prepared a stable cell line in which the function of HSF1 is modified to independently assess its role in stress response. Next, we prepared a double knockout of HSF1 and HSF2 in the lung cancer cell line H1299 to analyze stress-induced gene expression independent of HSF1/ 2 activation. At least, we created cell lines containing tet-on inducible mutants of HSF1 (constitutive trimers or dominant negative DNA binding mutant) to study the transactivation activity of HSF1 independently of stress. Our data reveal how HSF1 is involved in the transcriptional regulation of selected stress proteins. Hsp27 (HSPB1) and Hsp70 (HSPA1) mRNAs were analyzed by quantitative reverse transcription PCR in cell lines containing genetically modified HSF1. Our data showed that HSF1 induction plays a key role in regulation both genes and that the additional presence of stress is crucial for increased Hsp70 expression.

XXVI/ 265. VYUŽITÍ NANOTOXIKOLOGICKÝCH METOD PRO STUDIUM CYTOTOXICITY POKROČILÝCH MATERIÁLŮ

SUCHÁ

F. Ústav chemie a biochemie, AF Mendelovy univerzity, Brno

Kovové nanočástice jsou hojně využívány v medicíně, velkou pozornost získaly mimo jiné i nanočástice na bázi ušlechtilých kovů. Palladiové nanočástice mají významné optické a elektrické vlastnosti, díky čemuž jsou využívány jako fototermální činidla a nosiče léčiv. Palladiové nanočástice mohou mít také antimikrobiální, antioxidační a cytostatický účinek [1]. Rhodiové částice mohou být na základě svých fyzikálně-chemických vlastností využity jako nosiče léčiv, pro fototerapii nebo jako biokatalyzátory [2]. Rutheniové nanočástice mohou být využity při fotodynamické terapii, jako nosiče léčiv nebo jako katalyzátory biologických reakcí v těle. Komplexy RuNPs jsou také studovány jako protinádorová léčiva [3]. Platinové nanočástice mohou být využity při léčbě nádorových onemocnění. V současné době jsou testována léčiva obsahující nanočástice, na které jsou navázané deriváty platiny, jako je např. cisplatina, oxaliplatina a karboplatina [4]. V rámci diplomové práce byly sledovány čtyři druhy nanočástic: palladiové (PdNPs), rhodiové (RhNPs), rutheniové (RuNPs) a platinové (PtNPs). Sledované nanočástice byly charakterizovány pomocí DLS. Toxicita nanočástic a jejich vliv na klonogenicitu byly testovány na nenádorových buněčných liniích HaCaT a HEK 293. Na základě MTT testu byly stanoveny hodnoty 24IC50. U buněčné linie HaCaT byly hodnoty 0,220 mg/ ml pro PdNPs; 0,994 mg/ ml pro RhNPs; 0,960 mg/ ml pro RuNPs a 0,004 mg/ ml pro PtNPs. U buněčné linie HEK 293 byly hodnoty 0,220 mg/ ml pro PdNPs; 0,188 mg/ ml pro RhNPs; 0,240 pro RuNPs a 0,004 mg/ ml pro PtNPs. Stejný efekt byl pozorován i při vlivu nanočástic na klonogenicitu. Sledované nanočástice nevykazovaly vysokou míru cytotoxicity, a proto by mohly být potenciálně využity v medicíně, např. jako nosiče léčiv.

Literatura: [1] Fahmy SA, Preis E, Bakowsky U et al. Palladium nanoparticles fabricated by green chemistry: promising chemotherapeutic, antioxidant and antimicrobial agents. Materials 2020; 13(17): 3661. doi: 10.3390/ ma13173661. [2] Kang S, Shin W, Choi MH et al. Morphology-controlled synthesis of rhodium nanoparticles for cancer phototherapy. ACS Nano 2018; 12(7): 6997–7008. doi: 10.1021/ acsnano.8b02698. [3] Zeng L, Gupta P, Chen Y et al. The development of anticancer ruthenium(ii) complexes: from single molecule compounds to nanomaterials. Chem Soc Rev 2017; 46(19): 5771–5804. doi: 10.1039/ c7cs00195a. [4] Anselmo AC, Mitragotri S. Nanoparticles in the clinic: an update. Bioeng Transl Med 2019; 4(3): e10143. doi: 10.1002/ btm2.10143.

XXVI/ 266. VZTAH MEZI EXPRESÍ PROTEINŮ SIGNÁLNÍ DRÁHY P53 A FAKTORŮ KMENOVOSTI U SARKOMŮ DĚTSKÉHO VĚKU

CURYLOVÁ L.¹, NERADIL J.¹, ŠTĚRBA J.², VESELSKÁ R.¹, ŠKODA J.¹

¹Laboratoř nádorové biologie, Ústav experimentální biologie, PřF MU, Brno; Mezinárodní centrum klinického výzkumu, FN u sv. Anny v Brně, Brno, ²Mezinárodní centrum klinického výzkumu, FN u sv. Anny v Brně, Brno; Klinika dětské onkologie FN Brno a LF MU, Brno

Sarkomy se řadí mezi nejčastější nádory dětského věku, přičemž šance na přežití u pacientů trpících agresivními formami těchto nádorů stále zůstává pouze 20 %. Možným vysvětlením pro výskyt agresivních, diseminovaných a často rezistentních sarkomů je přítomnost nádorových kmenových buněk (CSCs), jejichž schopnost dlouhodobé sebeobnovy, vysoká buněčná plasticita a rezistence vůči konvenční protinádorové léčbě jsou obecně vnímány jako zásadní při iniciaci, progresi i metastázování nádoru. Hlavní funkcí nádorového supresoru p53 je zajištění adekvátní reakce při poškození genomu buňky, v současnosti však nabývá na důležitosti i jeho role v regulaci kmenovosti a diferenciace buněk. U sarkomů byla již dříve prokázána častá deregulace proteinů signální dráhy p53, a proto by tyto proteiny mohly představovat vhodné terapeutické cíle. Cílem této práce je ověřit možnou korelaci mezi fenotypem CSCs a deregulací dráhy p53 u sarkomů dětského věku. K tomuto účelu byl využit screening exprese známých faktorů kmenovosti (SOX2, OCT4, NANOG, KLF4 a C-MYC) a proteinů dráhy p53 u 20 buněčných linií derivovaných z osteosarkomů (OS) a rabdomyosarkomů (RMS) pediatrických pacientů a dále 4 referenčních buněčných linií (3 OS linie: MNNG/ HOS, HuO-3N1 a SAOS-2; 1 RMS linie: RD). Exprese vybraných markerů a proteinů rodiny p53 byla sledována na úrovni proteinů metodou western blotting. Na základě těchto analýz byly dále provedeny testy tumorigenicity vybraných linií v podmínkách in vivo v myším modelu. Získaná data ukazují, že referenční linie MNNG/ HOS a RD, obsahující mutaci p53, vykazují zvýšenou expresi alespoň 2 vybraných markerů (SOX2 a OCT4, resp. OCT4 a KLF4) oproti průměrné hodnotě exprese daného markeru u všech zkoumaných linií konkrétního typu sarkomu. OS linie SAOS-2 s delecí p53, se vyznačuje vyšší expresí OCT4. U linií derivovaných z OS pediatrických pacientů byla navíc pozorována negativní korelace exprese transkripčního faktoru SOX2 a proteinu p53. U linií derivovaných z pacientských RMS byla nalezena korelace mezi expresí negativního regulátoru p53, MDM2, a faktorů C-MYC a KLF4. Získané poznatky tedy naznačují existující vztah mezi kmenovostí sarkomů a proteiny dráhy p53. V další fázi budou tyto výsledky validovány s využitím buněčných linií se stabilně sníženou či zvýšenou expresí vybraných faktorů kmenovosti.

Podpořeno z programového projektu MZ ČR s reg. č. NU20J-07-00004 a stipendiem programu Brno Ph.D. Talent financovaným statutárním městem Brno.

XXVI/ 268. ANALÝZA MIKRORNA U PACIENTŮ S ATYPICKÝM MENINGEOMEM – NOVÉ POTENCIÁLNÍ DIAGNOSTICKÉ BIOMARKERY

AL TUKMACHI D.¹, NAAR O.², RUČKOVÁ M.¹, FADRUS P.³, VYBÍHAL V.³, SLABÝ O.⁴, ŠÁNA J.⁵

¹CEITEC, MU, Brno, ²MU, Brno, ³Neurochirurgická klinika LF MU a FN Brno, ⁴CEITEC, MU, Brno; Ústav patologie, FN Brno, ⁵CEITEC, MU, Brno; Klinika komplexní onkologické péče LF MU a MOÚ Brno

Východiska: Meningeomy představují asi třetinu všech primárních intrakraniálních malignit a většina z nich je charakterizována asymptomatickým průběhem a pomalým růstem. U meningeomů se stupněm malignity II a III však často dochází k rozvoji invazivního onemocnění a jsou spojeny s významně vyšší pravděpodobností rekurence po chirurgické resekci, případně adjuvantní terapii, a tedy i s horší prognózou. I přesto, že u atypického meningiomu (AM) dochází k relapsu do 5 let od zákroku u 40 % pacientů, nebyl dosud nalezen žádný konsenzus ohledně adjuvantní léčby a je komplikované identifikovat pacienty, kteří by z této léčby mohli mít benefit. Z tohoto důvodu je nezbytné najít prognostické biomarkery, které by byly schopny rozlišit tyto pacienty v klinické praxi. Velmi nadějnou skupinou biomarkerů představují mikroRNA (miRNA), krátké nekódující RNA regulující většinu biologických procesů včetně buněčné proliferace, diferenciace a apoptózy. Již několik retrospektivních studií analyzovalo účinek adjuvantní radioterapie u AM s nekonzistentními výsledky a také byly popsány významně dysregulované miRNA v nádorové tkáni meningiomu a jejich účast na procesech spojených s radiorezistencí. Cílem této studie je identifikace tkáňových miRNA schopných predikovat pacienty s AM, kteří by těžili z adjuvantní radioterapie. Materiál a metody: Tato studie zahrnuje 80 pacientů s atypickým meningeomem v explorativní fázi a 400 pacientů s meningeomem ve validační fázi. Pomocí mirVana miRNA Isolation Kit (Thermo Fisher Scientific) byla z tkání fixovaných ve formalinu a zalitých v parafinu vyizolována totální RNA, vč. miRNA. Následná kontrola kvantity a kvality RNA proběhla pomocí přístrojů NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific) a Qubit 2.0 (Thermo Fisher Scientific). Pro globální analýzu exprese miRNA byla použita vysokokapacitní technologie TaqMan Array Human MicroRNA Cards (Thermo Fisher Scientific), která funguje na principu PCR a umožňuje detekci až 754 miRNA současně. Data získaná z vysokokapacitní analýzy byla zpracována a pomocí bi informatických algoritmů integrována s klinicko-patologickými daty pacientů s AM. Výsledky a závěr: Tato studie identifikovala 22 významně dysregulovaných miRNA mezi pacienty s recidivou a bez recidivy (p < 0,05). Dále byl stanoven prognostický panel miR-142-5p (p = 0,0079, log2FC ≥ 2) a miR-338-5p (p = 0,0079, log2FC ≤ −2) schopný predikovat rekurenci u pacientů s AM. Výsledky pomohou přesněji predikovat prognózu chirurgicky intervenovaných pacientů.

Projekt byl uskutečněn za podpory MZ ČR grantu AZV s reg. č. NV19-03-00559.

XXVI/ 284. ANALÝZA METALOTHIONEINU POMOCÍ BRDIČKOVY REAKCE U PACIENTŮ SE ZHOUBNÝM NÁDOREM PROSTATY

SKOTÁK V.¹, HOSNEDLOVÁ B.², DUNOVSKÁ K.³, KLAPKOVÁ E.⁴, JAKUBEK M.², PARÁK T.⁵, KIZEK R.⁶

¹CONEM Metallomics Nanomedicine Research Group, ²BIOCEV, 1. LF UK v Praze, ³Ústav vědeckých informací, FN Motol, Praha, ⁴Ústav lékařské chemie a klinické biochemie 2. LF UK a FN Motol, Praha, ⁵Oddělení klinických laboratoří, Nemocnice Milosrdných bratří, Brno, ⁶Ústav lékařské chemie a klinické biochemie 2. LF UK a FN Motol, Praha

Metalothionein (MT) je malý, na cystein bohatý, protein obsahující ve své molekule 20 cysteinových zbytků. Hlavní biologickou úlohou MT je homeostáza iontů kovů. Pravděpodobně je začleněn do regulačních drah řady významných transkripčních faktorů. Cílem práce bylo ověřit elektrochemickou analýzu MT v moči. Získané voltametrické křivky byly hodnoceny jako plocha pod křivkou (AUC). Byla provedena studie přídavků methalothioneinu (0; 0,5; 1; 2; 5; 10; 25; 50; 100 μg/ ml) v aplikovaných množstvích vzorku pro analýzu (10; 20; 40; 60; 120 μl). U získaných voltamogramů byla vyhodnocena AUC ve 4 zónách (zóna od –0,6 do –1,0 V, druhá od –1,0 do –1,3 V, třetí od –1,3 do –1,6 V a čtvrtá zóna od –1,6 do –1,95 V). Získané AUC pro jednotlivé zóny ukázaly nejlepší závislost pro zónu 2 a 3. Zaznamenané AUC odezvy jednotlivých zón narůstaly v závislosti na množství aplikovaného vzorku, AUC RSD se pohybovaly mezi 20–40 %. Získaný vzorek moči byl nejprve denaturován a následně elektrochemicky analyzován. Kromě uvedené elektrochemické analýzy byly vzorky také podrobeny chemické analýze. Chemická analýza moči (kontrolní skupina): kreatinin 9,18 ± 3,1 mmol/ l; kys. močová 1,96 ± 0,62 mmol/ l; močovina 88,15 ± 34,01 mmol/ l; osmolalita 81,92 ± 49,37 mmol/ l. Pacienti s CaP: kreatinin 9,53 ± 2,68 mmol/ l; kys. močová 2,84 ± 0,83 mmol/ l; močovina 49,83 ± 9,18 mmol/ l; osmolalita 236,76 ± 160,73 mmol/ l. Bylo provedeno porovnání signálů voltamogramů vzorků močí kontrol a pacientů s CaP. Průměrná AUC kontrolní skupiny (n = 14) byla 101,02 ± 12,61 a RSD = 21,62 %. Průměrná AUC CaP skupiny (n = 10) byla 154,89 ± 19,06 a RSD = 19,2 %. Rozdíl mezi kontrolní skupinou a skupinou CaP byl statisticky průkazný (p = 5,53×10–4). Byla provedena pilotní studie zaměřená na analýzu MT v moči. Podařilo se ukázat, že by hladina MT mohla být u pacientů s CaP zvýšená. Pro ověření bude potřebné provést vyhodnocení na větším souboru pacientů.

Práce byla realizována za podpory projektu JCMM Nadáči a organizace Liga proti rakovině Praha.