Stanovení chimérismu pomocí polymerázové řetězové reakce v reálném čase. Přehled a první vlastní zkušenosti

Metoda polymerázové řetězové reakce v reálném čase (RQ-PCR) představuje v současnosti jednu z nejcitlivějších kvantitativních metod stanovení chimérismu po alogenní transplantaci krvetvorných buněk. Tato metoda je minimálně desetkrát citlivější než běžně používaná metoda fragmentační analýzy (FA) s fluorescenční detekcí. Aplikace metody umožňující stanovení mikrochimérismu, tj. smíšeného chimérismu (SC) na hladině menší než 1 %, dovoluje zachycení relapsu onemocnění signifikantně dříve a ve větším počtu případů, než je tomu u méně senzitivních metod. U pacientů s náhlým znovuobjevením autologní krvetvorby, odhalilo použití RQ-PCR SC také u předchozích odběrů, pomocí FAjiž klasifikovaných jako chimérismus kompletní (KC). Rovněž retrospektivní RQ-PCR analýza vzorků s pozitivní minimální zbytkovou chorobou, dle FA klasifikovaných jako KC, opakovaně potvrdila přítomnost autologní krvetvorby na hladině menší než 1 %. Použití metody stanovení chimérismu s lepší mezí detekce tedy umožňuje dřívější klinickou intervenci, avšak absolutní význam chimérismu i mikrochimérismu musí být dále hodnocen.

Klíčová slova:
chimérismus, mikrochimérismus, PCR v reálném čase, fragmentační analýza

Úvod

Alogenní transplantace kostní dřeně, a později i periferních kmenových buněk krvetvorby, se stala léčebným zákrokem u řady maligních i nemaligních hematologických onemocnění (1). Následné stanovení chimérismu, tedy určení podílu vlastní a dárcovské krvetvorby, je velmi důležitou součástí posttransplantačního sledování pacientů (2).

Smyslem analýzy chimérismu a jeho dynamiky v čase je, vedle počáteční informace o úspěšnosti nahrazení krvetvorby, nenahraditelná pomoc při hledání optimálního léčebného přístupu, jako je především úprava imunosuprese nebo podání infuze dárcovských lymfocytů (DLI) (3, 4).

Během éry transplantací se k analýze chimérismu používala řada metod (pro souhrn viz např. naše předcházející review (5). V posledním desetiletí byla za zlatý standard považována metoda fragmentační analýzy (FA) s fluorescenční detekcí polymorfních úseků genomové DNA (6). Konkrétně se jedná o oblasti obsahující repetitivní sekvence (VNTR – variable number of tandem repeat, STR – short tandem repeat), jejichž variabilní počet určuje délku dané oblasti (2). Jejich amplifikace pak umožňuje porovnání a odlišení jednotlivých jedinců, v případě chimérismu odlišení dárce a příjemce, a sledovat tak podíl krvetvorby po transplantaci. Mez stanovitelnosti se u FA pohybuje v rozmezí 1–5 % (6), ovšem ani hranice 1 % se nejeví jako dostatečná (2). Naopak se ukazuje, že použití metody s možností detekce mikrochimérismu, tzn. autologní krvetvorby na úrovni menší než 1 %, umožňuje dřívější odhalení relapsu onemocnění (7–14). Takovou metodou je polymerázová řetězová reakce v reálném čase (RQ-PCR).

V předkládaném článku uvádíme přehled dosud publikovaných prací využívajících RQ-PCR pro monitorování chimérismu po alogenní transplantaci krvetvorných buněk, diskutujeme aspekty spojené s jejím používáním, a to zvláště v konfrontaci s metodou FA, včetně vlastních zkušeností a prvních výsledků.

Přehled použití RQ-PCR

První práce zabývající se možností aplikace RQ-PCR pro účely monitorování chimérismu po transplantaci hematopoetických buněk byla publikována v roce 2000 (15). Úspěšně byl tehdy testován komerčně dostupný kit pro detekci jediného polymorfismu jednoho nukleotidu (SNP, single nucleotide polymorphism).

Polymorfismy jednoho nukleotidu se v genomu vyskytují zhruba každých 1,9 kb (16). Zpravidla jsou bialelické, vyskytují se v kódujících i nekódujících oblastech DNA, a představují hlavní část genomické diversity (16).

Pro kvantifikaci chimérismu pomocí RQ-PCR byla dále využita detekce sekvencí lidského chromozomu Y (14). Tohoto přístupu bylo, u dvojic dárce-žena příjemce- muž, využito také v řadě jiných publikovaných prací; pro ostatní dvojice pak bylo použito buďto SNP, nebo polymorfismu typu (krátké) inserce/delece, existence tzv. nulových alel, případně HLA (viz tab. 1) (7–15, 18–31).

Využití skupiny 19 polymorfismů, náležejících 12 bialelickým lokusům na 9 chromozomech, publikovali pro stanovení chimérismu v roce 2002 Alizadeh a kol. (7). Vybírali přitom sekvence lišící se alespoň dvěma za sebou jdoucími nukleotidy (krátké inserce/delece) s vysokým stupněm informativity. Z této publikace o tři roky později přímo vychází Masmas a kol. (26). Kromě úpravy podmínek amplifikace byly navrženy nové primery a sonda pro detekci pohlavně specifického polymorfismu.

Obě tyto práce využívají metodu dvojitě značených TaqMan® sond. Tato technologie je založená na měření fluorescenčního signálu sondy, která specificky hybridizuje do oblasti kvantifikovaného úseku DNA. Mezi první cyklem, kdy množství uvolněné próby excituje detekovatelný fluorescenční signál, a logaritmem počátečního množství DNA existuje lineární závislost. Tento cyklus je označován jako Ct („cycle treshold“). Dosazením Ct do vzorce

QU=QCx(1+E)-(ΔCtU- ΔCtC), kde

QU... (normalizované) množství DNA v neznámém vzorku

QC......(normalizované) množství DNA kalibrátoru (vzorek DNA příjemce před transplantací)

ΔCtU.....rozdíl hodnot Ct u neznámého vzorku

ΔCt = Ct cílové sekvence – Ct referenční sek.) Δ CtC...... rozdíl hodnot Ct kalibrátoru

E..... efektivita reakce (je-li efektivita reakce 100 %, pak E = 1),

nebo použitím kalibrační křivky standardů o známé koncentraci, může být také určeno množství sledované DNA v neznámém vzorku (7, 26). Principiálně velmi podobné TaqMan® sondám je použití dvojic jednoduše značených sond pro LighCycler® (Roche) (12).

Odlišný princip kvantitativní RQ-PCR je naproti tomu založen na detekci fluorescenční látky nazývané SYBR Green. Tato látka emituje fluorescenční záření až po interkalaci do dvouvláknové DNA. Při PCR tak lze kontinuálně měřit množství vznikajícího produktu. Nevýhodou této metody je, že se SYBR Green váže i na primerové dimery a jiné nespecifity, jež se mohou během reakce tvořit, což může zkreslit kvantifikaci vlastní amplifikované DNA. Naopak výhodou jsou nízké náklady a univerzální použití – odpadají vysoké náklady na syntetizování značených specifických sond (18, 30–31).

RQ-PCR versus FA

Hlavním přínosem metody RQ-PCR je lepší mez stanovitelnosti i detekce. Zatímco u FA s fluorescenční detekcí je nejmenší udávané detekovatelné množství minoritní populace s určením exaktní hodnoty 1–5 % (6), je tato hranice u RQ-PCR posunuta minimálně desetkrát (4).

V závislosti na typu používaného polymorfismu a postavení informativní alely, je možné mikrochimérismus detekovat i pomocí FA (6). Úrovně detekčního limitu srovnatelné s RQ-PCR lze dosáhnout analýzou chimérismu v jednotlivých buněčných liniích krve (4, 6).

Další výhodou RQ-PCR je rychlejší provedení kvantitativní analýzy – pouze příprava a provedení PCR plus výpočet – tedy bez dalšího zpracovávání (odpadá příprava PCR produktů na FAa především její déletrvající provedení). Rovněž univerzální podmínky amplifikace šetří čas tím, že se dají analyzovat všechny polymorfismy najednou.

Je ovšem třeba mít na paměti limitaci v kvantitativní přesnosti metody RQ-PCR: rozdíl jediného cyklu tvoří ve výsledku dvojnásobný kvantitativní rozdíl. To ovšem znamená koeficient variace až 56 % (26). Reprodukovatelnost FA se naproti tomu pohybuje v rozmezí 4–8 % (3). Z toho plyne, že použití RQ-PCR je přesné pouze pro vzorky s podílem vlastních buněk do 5 % (3, 4) a nemůže tedy zcela nahradit FA. Zatímco u FA lze najít informativní STR či VNTR polymorfismus hypoteticky u všech dvojic příjemce-dárce, u RQ-PCR existuje tato možnost asi jen u 90 % dvojic (4).

Nevýhodou RQ-PCR zůstává také vyšší cena výsledku jednoho stanovení – kromě skutečnosti, že se vyšetření provádí vždy ve dvou paralelách, je rovněž třeba připočíst náklady na amplifikaci referenčního „house-keeping“ genu (včetně negativní a pozitivní kontroly).

RQ-PCR – naše zkušenosti

Na našem pracovišti jsme pro detekci chimérismu pomocí RQ-PCR převzali 11 polymorfismů krátkých insercí a delecí z publikace Alizadeh a kol. (7) a marker vázaný na chromozom Y (26). Podmínky reakce jsme modifikovali použitím jiného reakčního objemu a délkou denaturace a změnili jsme rovněž množství templátu, typ značení sond a použité reagencie, což znamenalo především příznivější finanční dopad. 100 ng DNA bylo smícháno s 12,5 μl univerzálního mixu (2x ABsolute QPCR ROX Mix, ABgene), 600 nM primery a 200 nM sondou (BHQ1-FAM, Generi Biotech), v reakčním objemu 25 μl. Na přístroji RG-3000 (Corbett Research) byla reakce iniciována inkubací 15 minut při 95 ºC, po které následovalo 50 amplifikačních cyklů (95 °C/20 s a 60 °C/60 s). Jako referenční gen sloužil albumin (32). Treshold analýzy reakce byl standardně nastaven na 0,005 a výpočet podílu minoritní DNA byl proveden podle výše uvedeného vzorce.

Do září 2005 výhradně používaná metoda FA byla postupně nahrazována nejprve u pacientů, kde podíl vlastní krvetvorby vycházel menší než jedno procento. Dále u těch, kteří měli pozitivitu na minimální zbytkovou nemoc (MRD), ale vykazovali přitom kompletní chimérismus (KC). Retrospektivní analýza těchto vzorků metodou RQ-PCR opakovaně potvrdila mikrochimérismus (obr. 1).

Rovněž retrospektivní RQ-PCR analýza vzorků pacientů s akutní myeloidní leukemií (AML), předcházejích náhlému znovuobjevení se autologní krvetvorby, odhalila smíšený chimérismus (SC) i u těch odběrů, pomocí FA již klasifikovaných jako KC (obr. 2).

Přechod na RQ-PCR se dosud uskutečnil u 82 našich pacientů, z toho 24 tvoří skupina, u které detekujeme pohlavně specifický marker. Informativní polymorfismus nebyl nalezen u čtyř z 62 genotypizovaných pacientů (6,5 %).

Jak již bylo řečeno, metoda RQ-PCR nemůže zcela nahradit metodu FA. U nově transplantovaných pacientů začínáme s analýzou chimérismu pomocí FA, a teprve když u nich podíl autologní krvetvorby klesne pod jedno procento, přecházíme na RQ-PCR. Pokud přetrvává SC na vyšší úrovni, je u daného pacienta používána metoda FA s fluorescenční detekcí i dále.

Vzhledem k výše zmíněné variabilitě mezi jednotlivými PCR reakcemi se nám, u vzorků se SC, osvědčilo provádět současně s novým odběrem analýzu chimérismu i u odběru předcházejícího. Pokud se pak takovýto kontrolní výsledek liší od výsledku vydaného, je tento „rozpor“ zohledněn či komentován při klasifikaci chimérismu nového odběru. V tomto ohledu se jeví výhodnější vydávat výsledek SC v určitém intervalu, získaného výpočtem více rovnic (nejlépe z různých polymorfismů) u FA, respektive amplifikací vzorků ve dvou paralelách u RQ-PCR.

Výsledky pod mezí stanovitelnosti, ale v rámci meze detekce (bez udání exaktní hodnoty), jsou pak vydávány intervalem SC < 1 % respektive SC < 1 % u FA resp. SC < 0,1 % respektive SC < 0,1 % u RQ-PCR. U výsledku KC je vhodné vždy použitou metodu uvést. Diskuse Znovuobjevení se autologní krvetvorby či nárůst smíšeného chimérismu zpravidla souvisí s vyšším výskytem relapsu onemocnění, jež patří mezi časté příčiny selhání transplantace krvetvorných buněk a to především u akutních leukemií (pro přehled viz např. 4, v rámci naší republiky práce 33–35). Prediktivní význam samotného SC zůstává nicméně nadále nejednoznačný (36–37). Jinými slovy, není možné stanovit obecně platnou hladinu SC, jejíž dosažení by pro všechny pacienty znamenalo vyšší riziko relapsu (12). Pokud navíc uvažujeme o významu mikrochimérismu, stane se situace jenom komplikovanější. Řada prací však už nyní jasně ukazuje, že aplikace citlivější metody, kterou RQ-PCR představuje, umožňuje zachycení signifikantně většího množství relapsů, než pomocí FA, případně jiných, běžně používaných metod. Jiménéz-Velasco a kol. pomocí RQ-PCR, ve srovnání s FA VNTR oblastí, zachytili signifikantně větší množství relapsů (88,2 vs. 44,4 %), s mediánem předpovědi 58 dní (21). Obdobné výsledky byly publikovány i při srovnání RQ-PCR a STR či FISH (8–11, 13–14) – viz tabulka 1. Naše první výsledky ukazují totéž – analýza vzorků pomocí metody RQ-PCR odhalila SC dříve, než bylo znovuobjevení autologní krvetvorby před relapsem zaznamenáno metodou FA s fluorescenční detekcí (viz také obr. 2).

Použití RQ-PCR dále umožnilo objasnění situace u MRD pozitivních pacientů s KC. Ve všech těchto případech bylo potvrzeno, že tato diskrepance je zapříčiněna pouze horší mezí detekce původně použité metody. Naproti tomu v případech, kdy vychází SC, avšak pacient je MRD negativní, pochází autologní populace z nemaligního klonu, u myeloidních leukemií tedy z lymfocytární řady (38–40). Zdá se tedy, že stanovení chimérismu pomocí RQ-PCR, zvláště v kombinaci s analýzou v jednotlivých buněčných liniích krve, může být použita k monitorování MRD u těch pacientů, kde jiný molekulární marker (např. fúzní gen) není k dispozici (41).

Závěr

Mezí detekce metoda RQ-PCR velmi přispívá k časnému odhalení relapsu u pacientů transplantovaných pro malignity krevních buněk, a umožňuje tak včasnou klinickou intervenci. Klinický význam absolutních hodnot chimérismu, a zvláště pak mikrochimérismu, však musí být dále hodnocen.

Mgr. Ondřej Horký

Centrum molekulární biologie a genové terapie, IHOK,

FN Brno

Černopolní 9

25 00 Brno

Došlo do redakce: 23. 11. 2006

Přijato: 12. 3. 2007