K-ras mutace u kolorektálního karcinomu jako prognostický faktor vývoje onemocnění

Úvod:
V České republice je kolorektální karcinom závažným problémem, kdy incidence karcinomu trvale roste a podle některých statistik se řadí na první místo mezi vyspělými státy v celosvětovém měřítku. Je tedy vhodné zařadit do vyšetřovacího a hlavně terapeutického algoritmu nové modality, které povedou ke včasné diagnóze či změně stávajících terapeutických postupů.

Charakteristika K-ras mutace:
K-ras mutace patří do skupiny protoonkogenů a gen bez mutace exprimuje proteiny, regulující buněčné dělení. Mutace ruší regulační vliv těchto proteinů, což vede vzniku tumorů hlavně v oblasti plic, slinivky a kolorekta.

Cíl projektu:
Hlavním cílem projektu je průkaz K-ras mutace u nádorů kolorekta, detekce cirkulujících nádorových buněk s K-ras mutací, dále detekce K-ras mutace u jaterních metastáz a dále ověření hypotézy, že nádory s K-ras mutací mají horší prognózu, vedou častěji k diseminaci hlavně do jater.

Metodika, způsob získávání dat: Celý projekt byl vázán na grant IGA, proběhl podle přesně stanoveného protokolu na Chirurgické klinice KN Pardubice, diagnostická část – PCR analýza probíhá na klinice ÚKBD FN Hradec Králové.

Výsledky:
Projekt proběhl od června 2004 do prosince 2006, v souboru bylo vyhodnoceno 7 6 nemocných s danými parametry. K-ras mutace byla zachycena v tumorózní tkáni u 25 nemocných, což je 33 %. V krevních vzorcích nebyla K-ras mutace zachycena.

Diskuse:
Do vyšetřovacího a terapeutického algoritmu není zatím standardně zařazena genetická analýza daného tumoru. Vyšetření K-ras mutace u kolorektálního karcinomu při potvrzeném předpokladu horšího průběhu a metastazováni hlavně do jater, by mělo vést k úpravě léčby a pooperační dispenzarizace či zařazení chemoterapie, radioterapie ve stadiích, kdy se nevyužívá.

Klíčová slova:
kolorektální karcinom – K-ras mutace – PCR analýza – venózní drenáž tumoru – detekce nádorových buněk v oběhu

_ÚVOD

Kolorektální karcinom (CRC) je ve světě třetí nejčastější nádor a jeho celosvětová incidence je rozdílná v závislosti na vyspělosti země, kdy výrazně vyšší výskyt je ve vyspělých zemích. V USA tvoří druhou nejčastější příčinu úmrtí na zhoubná onemocnění, zaznamenáno 154 000 nových případů za rok, z toho 56 000 pacientů na toto onemocnění zemře. Incidence i mortalita v USA mají mírně sestupnou tendenci, nejvíce případů je zjištěno po 50. roku věku. Situace v České republice je ještě nepříznivější, v rámci věkové skupiny 35–64 let je incidence mužů i žen na 1. místě mezi sledovanými zeměmi světa a to 75 případů na 100 000. Od roku 1989 se počet nových onemocnění zvýšil téměř 3x a počet úmrtí více než 2x [1].

Na vzniku CRC se podílejí zevní faktory a genetické predispozice. K zevním faktorům patří špatné dietetické návyky (nedostatek vlákniny, zeleniny, ovoce, vysoký obsah tuků v jídle, abúzus alkoholu, nedostatek vitaminů), nedostatečná fyzická aktivita s vysokým BMI, kouření. Naopak jako protektivní se jeví strava s dostatkem kalcia a vitaminu D, dále s vyšším přísunem kyseliny listové a methioninu, vitaminem C, beta karotenu a selenu. Některé studie uvádějí pokles incidence CRC u pacientů užívajících NSA, naopak méně známým faktorem zvýšeného rizika je předchozí cholecystektomie. Vnitřní faktory jsou podmíněny geneticky – jedná se o nádory sporadické a uplatňuje se zde akumulace mnohočetných mutací a delecí onkogenů a tumor supresorických genů [2]. U pacientů s CRC se ukazuje být častou DNA mutace K-ras genu v 12., 13., nebo 61. kodonu. Je uváděn nález této mutace na 12. kodonu až u 50–60 % pacientů s CRC. Jednoznačně identifikovanými prekarcenózami jsou adenomové polypy (až 80 % CRC vzniká z těchto polypů). Ulcerózní kolitida je dalším jednoznačnýcm rizikovým faktorem vzniku CRC, Crohnova choroba je rizikovým faktorem pro vznik adenokarcinomů tenkého i tlustého střeva, jedná se většinou o značně dediferencované tumory [3]. Významně menši část CRC jsou tumory v rámci hereditárně podmíněných syndromů. Nejznámějším je syndrom familiární adenomatózní polypózy tlustého střeva s podílem asi 1 % – agresivní forma je vyjádřena nálezem více než 100 adenomů s diagnózou okolo 20. roku života, méně častou je méně agresivní forma – nález méně než 100 adenomů s diagnózou okolo 40. roku života. Další je Lynchův syndrom, který se podílí na vzniku asi 5–8 % všech CRC.

Ke klasifikaci CRC je používáno dělení TNM a současně i Dukesova klasifikace: stadium I (Dukes A) – T1-2 N0 M0, stadium II (Dukes B) – T3-4 N0 M0, stadium III (Dukes C) -každé T N1-3 M0, stadium 4 (Dukes D) – každé T každé N Ml [4].

Základním vyšetřením je koloskopie celého tlustého střeva s možným odběrem vzorku tkáně. Z pohledu chirurga je nadále velmi významné doplnění irigoskopického vyšetření. U rektálních karcinomů má nezastupitelnou roli endosonografické vyšetření. Pro další stanovení vstupních stagingů je nezbytné provedení UZ břicha, RS plic event. doplnění CT či NMR břicha a malé pánve, hrudníku. Při dispenzarizaci patří odběr karcinoembryonálního antigenu ke standardu [5], jako nové vyšetření pro časný záchyt recidiv se jeví využití pozitronové emisní tomografie. Mezi vyšetřeni budoucnosti se jeví virtuální CT a NMR, fluoroscenční koloskopie či vyšetření DNA nádorových buněk v krvi, stolici. Mezi prognostické faktory karcinomu rekta patří hlavně stupeň penetrace nádoru přes stěnu rekta do okolí a postižení spádových a vzdálených lymfatických uzlin (dále též histologická diferenciace tumoru, stupeň invaze do krevních a lymfatických cév) [6, 7]. Při pozitivitě těchto faktorů je jedním z hlavních problémů léčby vznik lokálních recidiv [6]. Lokální recidiva samostatná nebo v kombinaci s metastázami se objevuje u 25–50 % pacientů. Při absenci uzlinových metastáz se výskyt lokální recidivy pohybuje u stadia I v rozmezí 5–10 %, u stadia II u 25–30 % a u stadia III až u 50 %. Lokální recidiva bez metastatického postižení je u karcinomu rekta mnohem častější než u karcinomu tlustého střeva. U 30–50 % pacientů s CRC se vyvinou metastázy ve vzdálených orgánech, nejčastěji v játrech [8]. Zda jsou dceřiná ložiska v játrech přítomna ve formě mikrometastáz již téměř od počátku onemocnění, nebo zda k této diseminaci choroby dochází později vlivem přítomnosti či uvolňování nádorových buněk do běhu, není zcela jednoznačně vyřešeno [9, 10]. Znalost přítomnosti diseminace choroby před, během a po operaci výrazně ovlivňuje nejen operační taktiku, ale zejména pooperační adjuvantní terapii. Současné zobrazovací metody (a to i CT, MNR) mají své limity a mikrometastázy neodhalí. Podle literatury tyto metody odhalí metastázy větší než 1 cm [11]. Průkaz přítomnosti tumorózních buněk v krvi pomocí metod genetické analýzy by mohl včas upozornit na nebezpečí vzniku metastatického postižení. Časná detekce přítomnosti tumorózních buněk v krvi u CRC je náplní tohoto projektu.

Základem terapie CRC je léčba chirurgická, doplněná radioterapií či chemoterapií. V paliativní léčbě inoperabilních nádorů se dále může uplatňovat kryoterapie, fototerapie, endoskopické postupy, či zavádění stentů. Bohužel až 20 % pacientů má v době diagnózy již přítomné vzdálené metastázy. Chirurgická radikální terapie je možná pouze asi u 45 % pacientů. Kurativní resekce pro karcinom rekta je taková, při které je odstraněn primární karcinom v dostatečném rozsahu se spádovými lymfatickými uzlinami (en bloc). Své nezastupitelné místo mají dále laparoskopické výkony na tlustém střevě, což je jednoznačný celosvětový trend. Laparoskopické výkony mají naprosto srovnatelné výsledky s otevřenými výkony.

Pětileté přežití CRC celkově je udáváno pro jednotlivá stadia: I – 85 %, II – 50–60 %, III – 25–35 %, IV – 5 %. Procento lokálních recidiv po radikálních operacích je 10–25 %. Recidiva je resekovatelná v 25 % [19, 27].

_{CHARAKTERISTIKA K-ras MUTACE}

K-ras gen (c-Ki-ras 2, Kirsten ras 2 gen, lokalizace 12p12.1) patři do rodiny ras protoonkogenů, poměrně starých a konzervovaných sekvencí eukaryotních genomů. K-ras gen exprimuje protein p21ras (21 kDa) s funkci G proteinu. Jedná se o regulační protein signálů iniciovaných vazbou růstových faktorů na buněčné povrchové receptory. Aktivaci protoonkoproteinu p21ras se rozjíždějí biochemické signální kaskády zahrnující fosforylaci transkripčních faktorů MAP kinázami a následnou indukci exprese časných genů, především genů pro syntézu cyklinu (obzvláště cyklinu D1) a cyklin-dependentnich kináz. Je patrno, že na činnosti p21ras je přímo závislý průběh buněčné proliferace v G1 fázi. K-ras gen má proto klíčové postavení při růstu, proliferaci a diferenciaci buněk.

Změny (mutace) K-ras protoonkogenu v onkogen ruší vnitřní GTPázovou aktivitu p21ras proteinu, vedou ke ztrátě jeho regulační funkce při buněčném dělení a přispívají k rozvoji maligních tumorů, především karcinomů pankreatu, tlustého střeva a plic. Důvodem je konformační změna, která se projevuje změnou fyzikálně chemických vlastnosti a funkčnosti exprimovaného proteinu. Za klíčové jsou považovány somatické bodové mutace v kodonech 12, 13 a 61 K-ras genu. Bodové mutace v kodonu 12 tvoří asi 80 % všech mutací prokazatelných u kolorektálních nádorů.

Velké multi- i monocentrické studie, včetně naší, ukazují, že u kolorektálních karcinomů se bodové mutace v K-ras genu se objevují nezávisle na klinické a histologické klasifikaci kolorektálního nádoru [20, 21], což podporuje hypotézu o relativně časném vzniku mutace při karcinogenezi [22]. Populační výskyt bodových mutaci v K-ras genu je u karcinomů a adenomů větších než 1 cm celosvětově prakticky totožný (30–50 %), což potvrzuje ideu o přítomnosti bodových mutaci v K-ras genu již v benigním stádiu kolorektálních tumorů. Mutace v K-ras genu nebyly nalezeny u FAP, nízké frekvence jsou popisovány u HNPCC a karcinomů vznikajících jako důsledek chronické ulcerativní kolitidy (10–15 %).

K molekulárně biologické analýze mutaci v K-ras genu se dnes používá jak DNA extrahovaná přímo z postižené tkáně, tak ze stolice nebo z krve. Při amplifikaci sledované oblasti genu se využívá polymerázová řetězová reakce (PCR) jako nástroj pro velmi citlivý záchyt genetických změn, zvláště, je-li aplikována dvoukolová PCR (nested PCR nebo seminested PCR). Detekce je založena na fyzikálně-chemických rozdílech mezi normální či mutovanou sekvencí PCR produktu (např. na různé teplotě tání dvouřetězce DNA), na hybridizaci DNA sekvence s alelově specifickým primerem či s komplementární značenou sondou nebo na štěpitelnosti PCR produktu v klíčových pozicích restrikčními enzymy (analýza restrikčních fragmentů RFLP). Konfirmační metodou je sekvenování PCR produktu, kterou lze díky citlivosti použít i jako metodu základní (přímé sekvenování).

_{CÍL PROJEKTU}

Zjistit nebo vyloučit přítomnost tumorózních buněk u pacientů s CRC v periferní krvi před plánovanou operací a v tříměsíčním odstupu od operace, dále během operace v drenážní venózní krvi tumoru. K této detekci byla použita metoda genetické analýzy – detekce K-ras mutace metodou PCR. Do studie byli zařazeni pacienti s CRC bez prokázaných metastáz. Na základě jejich další dispenzarizace byl sledován rozvoj metastatického postižení jater. Byl vyhodnocen vztah K-ras mutace k rozvoji jaterních metastáz Průkaz kauzálního vztahu přítomnosti tumorózních buněk v oběhu s K-ras mutací k rozvoji diseminace onemocnění by v budoucnosti mohl vést k aplikaci agresivní celkové či regionální chemoterapie i u pacientů v ranných stadiích CRC. Tím by měl být redukován rozvoj metastáz či zlepšena celková prognóza onemocnění.

Přítomnost K-ras mutace vede k horší prognóze onemocnění s rozvojem hlavně jaterních metastáz. Buňky se do oběhu dostávají jednak vlastním „chováním“ tumoru, další možnost je jejich uvolnění během operačního výkonu. Vhodnou operační technikou lze významně redukovat možnost diseminace tumorózních buněk během operačního výkonu [23]. Protože tumory tlustého střeva a proximálního rekta jsou drénovány portální krvi do jater, budou tumorózní buňky hledány nejenom v periferní krvi, ale též zejména během operačního výkonu v žilní krvi drenážní oblasti – krev portální nebo krev z oblasti dolní mezenterické žíly. Aby se vyloučila možnost přítomnosti tumorózních buněk v krvi již před operací, byla prováděna detekce v periferní krvi již před začátkem léčby. K vyloučení přítomnosti metastáz před operací a ke stanovení stagingu CRC byla vyjma standardních vyšetření u každého pacienta zařazeného do studie provedena předoperačně MNR jater. Z následné dispenzarizace pacientů vyplynul vztah mezi přítomnosti tumorózních buněk v krvi, pozitivitou K-ras mutace a rozvojem diseminace onemocnění především do jater. Vzhledem ke stále stoupající incidenci CRC (zejména v naši republice) jsou hledány stále nové postupy a typy léčby, které by snížily možnost rozvoje diseminace po radikální operaci tohoto onemocnění, zvýšily celkové přežití na tuto diagnózu a zlepšily prognózu pacientů. Vhodným postupem se ukazuje kombinace chirurgického radikálního výkonu s efektní a včasně indikovanou onkologickou léčbou. Právě vlivem této multimodální terapie dochází ke snížení počtu lokálních recidiv, metastatického postižení. U části pacientů, u kterých na základě předoperačního a pooperačního stagingu není dnes indikována chemo- či radioterapie přesto dochází k rozvoji metastáz. Pokud by přítomnost K-ras tumorózních buněk v periferní nebo portální krvi měla jasný vztah k následné diseminaci tumoru, byl by průkaz cirkulujících tumorózních buněk v krvi indikaci k podání chemoterapie. Tím by došlo k zlepšení prognózy pacientů s CRC.

_METODIKA

Projekt proběhl na Chirurgické klinice Nemocnice Pardubice, zpracování genetických analýz na ÚKBD Fakultní nemocnice Hradec Králové. Každý pacient zařazený do studie prodělal standardní předoperační vyšetření, navíc ještě MNR jater k vyloučení jinak nezachytitelných metastáz. Vyjádření souhlasu se zařazením do projektu pacient vyjádřil podpisem přiloženého Informovaného souhlasu. Krevní i tkáňové vzorky byly po zpracování patologem a další kryoprezervaci odeslány ke zpracování genetických analýz na pracoviště ÚKBD Hradec Králové. Pacienti jsou dispenzarizováni řešiteli projektu na Chirurgické klinice KN Pardubice.

_{ZPŮSOB ZÍSKÁVÁNÍ DAT}

Před operaci bylo provedeno standardní předoperační interní vyšetření včetně RS plic. Dále koloskopie s odběrem biopsie, endosonografie, UZ břicha, MNR jater. Byla zjištěna hladina CEA. Den před operaci byl proveden odběr periferní krve (vzorek č. 1) k provedeni genetické analýzy (detekce tumorózních buněk s K-ras mutaci v krvi). Tento odběr vyloučil ze studie pacienty, kteří mají tumorózní buňky v cirkulaci již před operací. Dále byl proveden standardní operační výkon (RO resekce s příslušnou lymfadenektomií). Před ukončením výkonu byla odebrána krev z venózní drenáže tumoru (2. vzorek krve). V případě operace karcinomu rekta nebo sigmatu byla krev odebírána z příslušné spádové oblasti (dolní mezenterická žíla), protože odběr krve přímo z porty by narazil na etický problém nutnosti rozšíření laparotomie proximálně. Pacienti s nádory distální třetiny rekta nebyli do studie zařazováni, protože žilní drenážní oblast této lokalizace nádoru je realizována i dolní rektální žilou (ústící do ilických žil, nikoliv do žíly portální). Dále byl odeslán vzorek tumoru k provedení zmrazovacího histologického vyšetření patologem. Část tohoto vzorku, byla později odeslána s krevními vzorky ke stanovení přítomnosti DNA mutace K-ras genu na 12. a 13. kodonu v tumoru. Za 3 měsíce po operaci jsme provedli klinickou kontrolu pacienta, koloskopické klinické vyšetření, UZ břicha a MNR jater, hladina CEA. Provedli jsme odběr periferní krve ke genetické analýze (vzorek č. 3). Další klinické a paraklinické kontroly probíhaly v odstupu 6 měsíců od operace, 1, 2 a 3 roky od operace.

Pro molekulárně biologickou analýzu přítomnosti mutace v K-ras genu v kodonech 12 a 13 byly použity dva typy biologického materiálu: tkáň odebraná patologem ze středu kolorektálního tumoru a krev (venózní periferní a portální o objemu 10 ml, v obou případech nesrážlivá, upravená EDTA). Tkáň byla po odběru uložena do mrazicího boxu na teplotu -20 °C. Krev bezprostředně centrifugována (1500 g po dobu 10 minut při 4 °C) a odebraná plazma taktéž uložena do mrazicího boxu na teplotu -20 °C. Transport vzorků do laboratoře byl proveden v chladicím boxu. DNA byla extrahována pomoci DNA afinitních kolonek dodávaných komerčně (pro zpracováni plazmy) nebo metodou fenol/chloroformové extrakce (v případě vyšetření tkáně). DNA byly zabankovány a uloženy do mrazicího boxu (-70 °C). Pro amplifikaci části exonu 1 a intronu 1 K-ras genu byla použita dvoustupňová polymerázová řetězová reakce (PCR) s následným restrikčním štěpením získaného PCR produktu (PCR/RFLP). Navržené primery, reakční objemy a teplotní profil PCR jsou detailněji popsány v našich předchozích publikacích [21, 24]. Účinnost amplifikace byla kontrolována elektroforeticky na 2% agarózovém gelu. Pro štěpení PCR produktu bylo použito restrikčního enzymu MvaI (pro kodon 12) a Bg1I (pro kodon 13). Hodnocení restrikčních fragmentů bylo provedeno elektroforeticky v horizontálním provedení na 3,5% MetaPhor agaróze (FMC BioProducts, Rockland, USA). Neštěpené PCR produkty byly purifikovány, koncentrovány a sekvenačně identifikovány automatickým kapilárním sekvenátorem ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, USA) na Přírodovědecké fakultě MU, Brno.

_{STATISTICKÉ ZPRACOVÁNÍ}

Metoda statistického hodnocení, kterou hodláme využít, je určení vzájemné závislosti kvalitativních alternativních vlastnosti (čtyřnásobní tabulka, konsignační tabulka). Takováto vzájemná závislost bude ověřena testy významnosti adekvátně formulovaných hypotéz a hodnoceni při použiti vhodných hodnot závislosti (2-test, Fisherův test, výpočty korelačních koeficientů nebo, jak v tomto případě může být, další testy, které se mohou ukázat nezbytné nebo užitečné).

_VÝSLEDKY

V naší experimentální skupině 76 pacientů s kolorektálním karcinomem sporadického charakteru byla prokázána u 25 osob (33 %) přítomnost mutace v K-ras genu. Nejčastějším typem mutace jsou záměny GCT-GTT a GGT-GAT v kodonu 12 a záměna GGC-GAC v kodonu 13.

Porovnáním různých extrakčních procedur byla jako optimální metoda extrakce zvolena DNA z plazmy mikrolonková metoda firmy Qiagen. Rozhodujícími kritérii pro volbu byla fluorescenční intenzita integrální DNA na elektroforetickém gelu a schopnost amplifikace.

Porovnáním různých amplifikačních technik byla díky své citlivosti a specifičnosti zvolena pro detekci bodových změn v kodonu 12 a 13 metoda LNA-clamping PCR s následným sekvenováním PCR produktu u všech pozitivních vzorků.

Vyšetřením přítomnosti mutace K-ras genu v nádorové tkáni, v plazmatické DNA z periferní žilní krve a v plazmatické DNA pocházející z krve ze spádových žil v okolí nádoru nebyl potvrzen předpoklad pozitivity mutace ani v jednom z 76 vyšetřených extraktů plazmatické DNA.

Ve sledovaném souboru zemřelo 6 pacientů, to je (2x příčinou úmrtí byla plicní embolie, 1x profuzní krvácení při MOF, 3x byla příčinou smrti progrese nádorového onemocnění).

Dehiscence anastomózy byla zaznamenaná v 6 případech (6,12 %). K progresi onemocnění došlo u 13 pacientů bez prokázané K-ras mutace (v 17,8 %) a u 11 pacientů s prokázanou K-ras mutací (v 44,0 %). Ve sledovaných hodnotách nádorových markerů (CEA, CA-19.9) odebíraných předoperačně a pooperačně nebyly shledány žádné významné statistické rozdíly při porovnávání odpovídajících stadií tumorů.

_ZÁVĚR

K-ras mutace v klinickém souboru pacientů byla zjištěna v tumorózní tkáni u 33 % nemocných. U těchto pacientů v periferní krvi odebírané předoperačně, peroperačně a pooperačně nebyly detekovány tumorózní buňky s přítomnou K-ras mutací. Původní předpoklad, že metodou PCR analýzy by bylo možné zjistit přítomnost tumorózních buněk v periferní krvi nebyl naplněn.

Ze sledování pacientů klinického souboru byla zjištěna a statisticky potvrzena horší prognóza nemocných s přítomnou K-ras mutací v tumoru. Standardní stanovení přítomnosti K-ras mutace v tumoru by mohla v klinické praxi vést k obměně chemoterapeutických protokolů tak, aby u takto postižených pacientů byla její aplikace posunuta i k nižším stadiím nádorového onemocnění.

Grant IGA NR /7884-3.

MUDr. M. Šácha

Chirurgická klinika KN

Kyjevská 22

Pardubice