Genomová terapie – dříve jen sen, dnes realita

Overview

Genová terapie (GT) se postupně stává běžným způsobem léčby. Již není výsadou velkých univerzitních pracovišť, jejichž laboratoře zvládají analytické postupy zaměřené na nukleové kyseliny a jejichž klinické týmy zvládají aplikaci. Původně byla určena pro dědičné choroby, které vzhledem ke svému řídkému výskytu byly označovány jako vzácná onemocnění a GT se dosud uplatňovala jen u dětí, aby působila ještě před rozvojem onemocnění. Nové způsoby léčby začaly být používány i u chorob běžných, jakými jsou např. metabolické poruchy (diabetes), a dokonce u takových, které nás sužují stále častěji, jako nejrůznější malignity a nemoci centrální nervové soustavy (např. Alzheimerova choroba).

Cílem genové terapie jsou geny, jejichž změny v podobě patogenních variant (dříve mutací) vyvolávají poruchy fenotypu. Naší snahou je buď jejich vyřazení z funkce (např. u hemoglobinopatií), nebo jejich nahrazení geny s normální funkcí. Ty lze do genomu vnést pomocí některého z vhodných přenašečů (tzv. vektorů), jakými jsou např. viry nebo lipozomy. Proces GT může probíhat přímo v těle pacienta (in vivo), nebo mimo něj na jeho izolovaných buňkách (ex vivo), kterými jsou obvykle indukované pluripotentní kmenové buňky (iPSC – induced pluripotent stem cell). Po úpravě se tyto buňky vracejí do pacientova těla, aby tak naplnily svůj „úděl“. V širším slova smyslu může být GT namířena i na produkt genové transkripce, kterým je messenger RNA (mRNA), nebo konečný produkt realizace genové funkce, jakým jsou funkční bílkoviny (např. u cystické fibrózy).

U různých chorob se úspěšně používají uvedené přístupy v závislosti na jejich dostupnosti, která je mimo jiné dána i náklady s GT spojenými nebo přístupností cílové tkáně. Nejen ověřování účinnosti a bezpečnosti GT, ale i ekonomické důvody rozhodují o tom, proč se GT rozvíjí jen pozvolna a proč se jí ujímají většinou jen velké a bohaté instituce. Rozhodující je také to, že celý proces vývoje od výchozích experimentálních prací přes klinické zkoušky až ke konečnému přípravku běžně trvá i dekádu či déle.

Klíčová slova:

genová terapie, vzácná onemocnění, běžné choroby, nádory

   

ÚVOD

Termínem genová terapie (GT) dnes rozumíme cílené zásahy do genomu na úrovni nukleových kyselin, tedy takovou editaci (úpravy) genomu, aby byly odstraněny chyby vzniklé přirozenou cestou, nejrůznější patogenní varianty (dříve označované jako mutace). V současném pojetí zatím nejde o mutace na úrovni celých chromosomů nebo jejich částí, ale spíše o mutace jednotlivých genů. A vedle editace genů má GT k dispozici i další možnosti jak zasahovat do procesu „genové realizace“ – do messenger RNA (mRNA) při transkripci a do translace při konečném kroku, kdy vznikají funkční bílkoviny. Proces GT v sobě zahrnuje kromě manipulace s nukleovými kyselinami i vstup do buněk, což je nejčastěji zprostředkováno virovými nebo liposomovými nosiči (1).

Genová terapie je metodou volby především pro tzv. vzácná onemocnění, většinou monogenní povahy, ale dnes i pro nádorová onemocnění. Z dále uvedených léčebných postupů vyplyne, že snaha být prvním, kdo dosáhne klinického použití tohoto způsobu léčby, vede k zintenzivnění všech prací s tímto cílem spojených a také vyvolává zájem výrobců prostředků, jimiž toho může být dosaženo.

Za vzácné onemocnění je obvykle považována nemoc s nízkým výskytem v populaci (v EU méně než 1/2000 jedinců), většinou genetického původu (80 %), s počátkem projevů v dětském věku (70 %) a náročnou celoživotní léčbou, v níž nabývá praktického významu právě GT. Technická náročnost její realizace, tj. editace (zásahu do struktury nukleových kyselin), neměla donedávna velkou naději na využití v lékařské praxi.

Celý proces od nápadu přes experimenty na zvířatech až po klinické zkoušky, registraci a povolení užití v klinické praxi mohl trvat mnoho let, někdy až celou dekádu. Ve své první fázi byly klinické zkoušky prováděny na zdravých dobrovolnících a sloužily především k ověření účinku a bezpečnosti daného prostředku. Často je podstupovali pracovníci výzkumu sami na sobě. Následující fáze klinického testování blíže stanovovaly vhodný způsob podávání a dávkování i nežádoucí projevy a snášenlivost, včetně reakcí při podávání dalších léků. V konečné, čtvrté fázi schvalování mohl být způsob léčby zaregistrován a mohla být udělena licence pro používání v klinické praxi. Velmi důležité jsou i postmarketingové studie, které sledují účinnost GT po zavedení do běžné klinické praxe. Obecně bylo žádoucí, aby klinické testy podstoupilo co nejvíce pacientů, což vzhledem k výskytu vzácných onemocnění nezbytně vyžadovalo spolupráci na mezinárodní úrovni, přesto přívlastek „vzácný“ naznačuje, že počty testovaných pacientů nebyly obvykle vysoké. Z těchto důvodů výstupy výzkumu v oblasti GT do doby schválení uváděly při publikování upozornění, že jsou pouze výsledkem výzkumu a nejsou klinicky přímo použitelné.

 

PORUCHY KRVETVORBY A SRÁŽLIVOSTI

Snahy zavést GT mezi léčebné prostředky v hematologii komentoval a velice podrobně popsal již v roce 2019 Donald B. Kohn (2). První GT, která byla schválena v USA pro klinické použití, byla úprava beta-talasémie a srpkovité anémie. O tomto úspěchu referovala v červenci 2023 Jenifer Leeová z Dětské nemocnice ve Philadelphii, která patří celosvětově mezi průkopníky GT. Schválením již také prošla ve Velké Británii a zabývá se jí podrobný článek (3).

Při onemocnění beta-talasémií jde o postižení tvorby hemoglobinových řetězců β. Tvorba hemoglobinových molekul sestávajících ze 4 řetězců, kdy vždy 2 jsou identické, se vyvíjí: Ve fetálním období, přesahujícím do raného dětství, jsou tetramerní hemoglobinové molekuly tvořeny 2 řetězci α a 2 řetězci γ. Syntéza řetězců γ je po narození postupně nahrazena řetězci β, takže v dospělosti obsahují červené krvinky většinu molekul hemoglobinu tvořených 2 řetězci α a 2 β. Pokud se řetězec β nevytváří, vyvine se onemocnění označované jako talasémie, jehož hlavním projevem je chudokrevnost. Cílem terapie je obnovení tvorby fetálního hemoglobinu vyřazením přirozené blokace jeho tvorby způsobené aktivitou specifické sekvence BCL11A. V tomto případě je tedy GT namířena do regulace syntézy hemoglobinových řetězců (4).

Současně s úpravou na úrovni DNA, kterou lze provést mimo tělo pacienta (ex vivo), je nezbytné zasáhnout do celé krvetvorby na úrovni buněčné, kdy v izolovaných pacientových kmenových buňkách po odstranění blokády tvorby fetálního hemoglobinu dojde k uvolnění syntézy řetězců γ a „fetální“ hemoglobin nahradí nedostatek hemoglobinu „dospělého“. Přenesením modifikovaných kmenových buněk zpět pacientovi je tak zajištěna trvalá účinnost této GT. K tomu, aby však bylo pro ně v kostní dřeni uvolněno místo, kde se mohou usídlit, je třeba původní patologickou krvetvorbu mezitím vyřadit pomocí transplantace kostní dřeně.

U srpkovité anémie je postiženým rovněž gen pro řetězec β. V jeho bílkovinném produktu je zaměněna kyselina glutamová za valin. V důsledku toho dochází v krvinkách k polymeraci hemoglobinových molekul, které působí změnu jejich tvaru připomínající srpek Měsíce – odtud název. Životnost takových krvinek se zřetelně zkracuje, nehledě na problém s průchodností kapilárami. U heterozygotů nacházíme spíše jen laboratorní odchylky, kdežto u homozygotů se objevují klinické obtíže v podobě anémie. Princip GT je podobný jako u talasémie, jen pacienta bývá nutné v rámci přípravy terapeutického zásahu „předzásobit“ několika transfuzemi „zdravé“ krve (5). Jistě není třeba zdůrazňovat, že nízký věk pacienta je pro výsledek terapie výhodou.

Mezi schválené GT v hematologii již patří také poruchy srážlivosti, např. hemofilie (6, 7). Dosud dosažené výsledky klinických studií, které probíhaly 5 let pro hemofilii A a 8 let u hemofilie B, potvrdily dlouhodobé (několikaleté) zásadní snížení krvácivých projevů. V některých studiích se však objevily komplikace v podobě zánětlivé reakce, se kterými se budeme setkávat jako s nechtěnou komplikací i v některých dalších případech GT.

 

CYSTICKÁ FIBRÓZA

Cystická fibróza (CF) je závažné genetické onemocnění, při kterém tvorba vazkého hlenu v průduškách vyvolává opakující se bronchopneumonie a postižení dalších orgánů, jmenovitě pankreatu. Nemocným dětem se i přes veškerou lékařskou snahu nedařilo přežít do dospělosti. Díky pokroku v terapii v posledním desetiletí nastalo značné ulehčení života pacientů i zlepšení jejich prognózy. V současné době jsou k dispozici léky (malé molekuly) přímo působící na modulátor transmembránového regulátoru vodivosti cystické fibrózy – protein CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator), které účinně upravují jeho funkci chloridového kanálu (8, 9). Avšak vzhledem k tomu, že stále 10 % mutací v genu CFTR nereaguje na modulátory CFTR, otevírá se prostor pro GT (10, 11). Úspěchů v léčbě je možno dosáhnout pomocí modulátorů, kdy se doporučuje použít kombinaci několika současně (12), nebo se nemocní mohou podrobit klasické genové terapii, která je však stále ještě ve fázi klinického testování (13).

 

DEFICIT ALFA-1-ANTITRYPSINU

Deficit α₁-antitrypsinu (AATD) se projevuje v řadě orgánů, především v plicích a játrech. K onemocnění stačí přítomnost jedné patogenní alely genu SERPINA1, jehož nefunkční produkt se hromadí v játrech. Současně je onemocnění provázeno nedostatkem funkce hlavně v plicích, kde její produkt reguluje činnost elastázy, přestože druhá alela je neporušená. Nemoc se rozvíjí postupně a s různou intenzitou a její projevy zvláště v plicní tkáni jsou velice ovlivňovány kvalitou vdechovaného vzduchu (kouření, prašné prostředí). Celkově AATD vyniká pestrostí projevů a různou mírou jejich závažnosti. V rámci GT byla zkoušena řada léčebných přístupů, z nichž některé dospěly až do stadia klinických zkoušek. Hlavním problémem však zůstával rozdílný až protichůdný účinek na nejpostiženější orgány. Rozsáhlý přehled o současné situaci uvádějí Pires Ferreirová et al. (14). Zatím se jako nejúčinnější ukázaly přístupy, které se snažily utlumit tvorbu alely patogenní a současně podpořit funkci alely neporušené (15).

 

NEUROLOGICKÁ ONEMOCNĚNÍ

Neurologická onemocnění je z praktických důvodů potřeba rozdělit na onemocnění periferních nervů a na onemocnění centrální nervové soustavy. To rozhoduje o způsobu léčby dané choroby, zda bude přístup k cílovým buňkám neomezený, nebo půjde o situaci specifickou tím, že je od ostatních částí těla oddělena hematoencefalickou bariérou, tj. „přepážkou“ s výběrovou propustností (16). Pro prostředky GT to znamená, že na rozdíl od buněk a bílkovin budou volně procházet jen „malé“ molekuly.

Vedle klasických, většinou monogenních, vzácných onemocnění sem můžeme zařadit i choroby, které jsou „dědičné“ specifickým způsobem. Tato onemocnění jsou podmíněna přítomností repetitivních sekvencí (opakujících se sekvencí nukleotidů), které v podobě opakujících se trinukleotidů mají při generačním přenosu tendenci zvyšovat počet repetic, zřejmě nepřesnou rekombinací a následnou nedokonalou opravou (17). Do této skupiny můžeme zařadit myotonickou dystrofii typ 1 a Huntingtonovu choreu.

Myotonická dystrofie typu 1

Svým vznikem a charakterem dědičnosti představuje tato dystrofie samostatnou jednotku mezi svalovými poruchami, neboť je dominantně dědičná (k jejímu fenotypovému projevu stačí jedna patogenní alela). A nejen to, přerod alel z neporušených na patogenní se děje postupně a při generačním přenosu se obvykle riziko zvyšuje. V genotypu obvykle rozeznáváme několik úrovní s různou mírou pravděpodobnosti, že příští generace může být svalovou dystrofií postižena. Důvod takového chování vyplývá z podstaty změn v DNA, které jsou příčinou poruchy. V odpovědném genu DMPK kódujícím proteinovou kinázu pro myotonickou dystrofii se vyskytují trinukleotidové repetice CUG (cytosin, uracil, guanin), jichž počet do 30 je bez patogenního účinku, avšak jejich nadměrná přítomnost (> 50) vede k poruše funkce kinázy, která je obvyklou součástí mnoha buněčných procesů, např. v metabolismu RNA. Použití metody zinc finger (18), které bylo nasnadě, přinášelo sice omezení velikosti trinukleotidových úseků, bylo však v experimentálních podmínkách často provázeno dalšími změnami v sekvenci nukleotidů, a to nejen v úseku trinukleotidové repetice, ale i v jejím okolí (19). Naproti tomu použití „malých“ molekul, buď chemicky syntetizovaných, nebo přírodních, bylo relativně úspěšnou léčebnou alternativou. Jejich přehled najdeme v práci publikované před 5 lety (20). Tyto prostředky účinkují na různých úrovních, některé snižují transkripci kinázového genu, jiné působí přímo na kinázu v podobě jejích modulátorů.

Huntingtonova chorea

Huntingtonova chorea je progresivní onemocnění centrální nervové soustavy s autozomálně dominantní dědičností, způsobené nadměrnou délkou repetitivní sekvence CAG (cytosin, adenin, guanin) v genu IT15 (21). Ikenoshita et al. zjistili, že cyklický pyrrol-imidazolový polyamid (cPIP), sloučenina vážící se na postiženou DNA, omezuje její patogenitu, ať se jedná o triplety umístěné v kódující či nekódující oblasti. CWG-cPIP navázaný na smyčku utvořenou v místě špatného párování (mismatched CWG DNA) interferuje s prodlužováním transkripce (RNA polymerázou), která by preferovala řetězec s větším počtem repetic DNA.

Spinální muskulární atrofie

Spinální muskulární atrofie (SMA) je způsobena nedostatečnou tvorbou proteinu SMN (survival motor neuron), který je nezbytný pro správnou funkci neuronů. Cílem GT je zvýšení jeho produkce. Odpovědný gen SMN1 obvykle postrádá exon 7. Tato delece činí gen nefunkčním, což by sice mohlo být kompenzováno genem SMN2 (jeden ze zkoušených postupů se proto snažil zvýšit produkci právě těchto genů), ale to bývá pro plnou kompenzaci funkce SMN1 nedostatečné. Lepšího léčebného účinku je dosahováno vnesením plně funkčního genu SMN1. Genová léčba spočívá v jednorázovém injekčním podání onasemnogen abeparvoveku-xioi, GT je však třeba uskutečnit před dosažením 2. roku věku dítěte.

Duchenneova muskulární dystrofie

Úspěch léčby Duchenneovy svalové dystrofie (DMD) je do značné míry způsoben tím, že do výroby prostředků pro GT u této formy svalové dystrofie vstoupil biotechnologický průmysl. Příslušné technologie byly zavedeny a ověřeny již před 8 lety. Přesvědčivě se ukázalo, jak velice jsou nové postupy GT výhodné z hlediska nákladů. V principu jde o namnožení buněčné linie HEK293T (human embryonic kidney) infikované rekombinovaným adenovirem (rAAV), do něhož je vkládána příslušná k terapii určená nukleotidová sekvence. V roce 2022 bylo reaktorů vyvinutých pro výrobu produktů schválených pro genovou terapii vyrobeno již přes 200.

Hned několik GT bylo uvedeno pod názvem Gene Therapy Engine. Pro léčbu muskulární dystrofie Duchenneova typu, pletencové svalové dystrofie (limb-girdle muscular dystrophy) a Charcotovu–Marieovu–Toothovu chorobu byly připraveny potřebné virové nosiče, promotory a editované geny.

Zatím jsou ještě procedury používané v průmyslové výrobě vesměs velice nákladné, objevily se však již práce, které naznačují, že to tak již v nedaleké budoucnu být nemusí (26).

Pozadu nezůstali ani farmaceutičtí giganti, jako společnost Eli Lilly, která ve spolupráci s Precision BioSciences také nabízí léčbu DMD na základě tzv. mikrodystrofinu, což je na účinné minimum zkrácená verze přirozené dystrofinové molekuly, která je přenášena na AAV. Ke klinickému použití tak byl FDA schválen delandistrogen moxeparvovek-rokl neboli SRP-9001) jako první genová terapie DMD. Jednorázovou infuzí virového nosiče (vektoru) se do těla vpraví genetická informace umožňující tvorbu mikrodystrofinu. Podání léčby není možné opakovat, jelikož tělo si vytvoří proti virovému nosiči imunitu; opakované podání by vyvolalo zánětlivou reakci a bylo by neúčinné. Přípravek byl v USA schválen pro léčbu chlapců ve věku od 4 do 5 let, u kterých byla diagnostikována Duchenneova svalová dystrofie a kteří splňují určitá kritéria – musejí být schopni samostatné chůze a nesmějí mít protilátky proti používanému virovému vektoru AAVrh74.

Než opustíme část věnovanou vzácným onemocněním, všimneme si ještě jedné zvláštní skupiny chorob, kterou bychom neměli opominout, byť jejich příčiny neleží v mutačních změnách genů (ve změnách jejich nukleotidové sekvence), ale přesto významně ovlivňují genovou funkci. Této skupině se věnuje epigenetika a jejím předmětem jsou chemické změny některých nukleotidů, které sice zůstávají na svém místě, ale mění svou funkci. Takové změny jsou prováděny enzymy (např. metylázou) a mohou být také enzymaticky odstraňovány. Genovou funkci mění pouze kvantitativně, mohou ji tlumit až zcela zrušit a opět spouštět. Z poruch či onemocnění, která tímto procesem vznikají, uveďme jednu z tzv. ribosomopatií, jejíž neurodegenerativní fenotypový projev je označován jako syndrom UBTF E210K (upstream binding transcription factor) (27). Za další poruchou z této skupiny, jaterní fibrózou, jejíž prvotních příčin může být velice mnoho (virová infekce, intoxikace), je pak samotný epigenetický proces. Je projevem metylace určitých bází v řetězci DNA – obvykle (CpG – cytosin-fosfát-guanin) dinukleotidů, ve kterých je metylován cytosin (28). V citovaném přehledu jsou uvedeny geny a jejich vzájemné vztahy, které se uplatňují v procesu fibrotizace jaterní tkáně a které v případě metylace jejich DNA mění svou aktivitu a jaterní hvězdicovité buňky vedou k myofibrotizaci. Zároveň také odhalují cíle, na něž lze zaměřit prostředky k demetylaci.

Alzheimerova nemoc

Jednou z poruch mozku, jež se v současnosti bohužel vymykají termínu „vzácné“, je Alzheimerova choroba (AD). Její prevalence se neustále zvyšuje a postihuje i nižší věkové skupiny. Byť AD byla popsána před více než sto lety, není stále dostatečně prozkoumána. Částečně se však již podařilo identifikovat genetický podíl na jejím vzniku a způsob jakým zasahuje do činnosti mozku (30). Na postupném odumírání mozkových buněk, k němuž dochází v průběhu onemocnění, se nepochybně podílí aktivita některých genů, např. genu MAPT (microtubule associated protein τ), jehož expresí se tvoří bílkovinný produkt τ, nebo genu APP, odpovědného za tvorbu bílkoviny, z níž štěpením vzniká amyloid beta (Aβ). Přestože se použití protilátek u AD zpočátku v klinických testech nezdálo příliš účinné, v několika testech se ukázalo, že po jejich podání mizely plaky amyloidu z mozků postižených pacientů. Proto FDA zvažuje schválení adukanumabu jako poslední možnosti s nadějí na zmenšení rozsahu amyloidních plaků.

Zdá se, že přítomnost amyloidních plaků spouští patogenezi celého procesu připojením fibrilárního proteinu τ, což pak společně hraje rozhodující roli v procesu rozvoje choroby. Z tohoto hlediska považují Mummeryová et al. (31) užití inhibice exprese MAPT (MAPT_Rx – tau-targeting antisense oligonucleotide), které by vedlo k omezení míry fibrilových chomáčů proteinu τ, za účinný prostředek k potlačení chorobného procesu v rámci AD.

Alzheimerova nemoc je příkladem toho, jak moderní lékařství směřuje k personalizované medicíně a vychází z poznatků o genomu pacienta a o vnějších vlivech, jimž byl vystaven. Prostředků, jak tohoto cíle dosáhnout, neustále přibývá. V tom v poslední době významnou měrou napomáhá umělá inteligence svou nebývalou schopností zpracovávat v neskutečně krátkém čase hromadící se obrovská množství dat, byť je zatím u některých lékařů přijímána s nedůvěrou.

 

 

I v mnoha dalších lékařských oborech se léčba vzácných onemocnění zaměřila na vyvolávající změny genomu a začala s přípravou GT, ať už na její základní úrovni v podobě genových manipulací či jejich alternativách na úrovni mRNA nebo bílkovin.

 

OČNÍ CHOROBY

V očním lékařství se genová terapie rozvíjí u Leberovy kongenitální amaurózy (LCA) a retinitis pigmentosa (RP).

Leberova kongenitální amauróza je zrak ohrožující dystrofie sítnice počínající již v raném dětství, na jejímž vzniku se podílí různé mutační změny v genu RPE kódujícím ribulóza-fosfát 3-epimerázu. Mutace v genu RPE65 (gene-encoding retinoid isomerohydrolase) představuje jednu z patogenních mutací u LCA. V genotypu zdravých osob bývá mutací postižena jen jedna z alel, postižené děti fenotypově zdravých rodičů jsou tedy homozygoty. Experimentálně se s úspěchem zkoušela GT nahrazující plnohodnotný gen subretinálním podáním rekombinantního adeno-asociovaného vektoru (AAV) obsahujícího kódující sekvenci RPE65 a v experimentu na zvířeti se ukázalo, že došlo ke zlepšení elektrofyziologické odpovědi a obnově zrakové funkce (23).

Na vzniku LCA se mohou vedle RPE65 podílet také mutace v genu kódujícím guanylátcyklázu 2D (GUCY2D) a v genu pro retinitis pigmentosa (RPGRIP1). Adeno-asociovaným vektorem zprostředkované přenesení RPGRIP1 cDNA nebo genu GUCY2D obnovovalo v myším modelu retinální funkce. Rovněž nitrobuněčné umístění přenášeného genu RPGR bylo odpovídající. Voretigen neparvovek-rzyl je první GT povolenou americkým Úřadem pro kontrolu léčiv a potravin (FDA) ke klinickému použití. Úspěšnost zásahu pochopitelně závisí na rozsahu dosud funkční retiny. Tento požadavek, častý u dědičných poruch, opět zvýhodňuje mladší pacienty, což zvyšuje význam včasné diagnostiky. Jakmile je diagnóza potvrzena, může být potřebný zákrok bez prodlevy proveden.

Je však třeba mít na paměti, že na fenotypu retinitis pigmentosa, která je častější formou dystrofie sítnice, se mohou podílet i další geny: RHO (gen kódující rhodopsin), ale i MERTK (kódující tyrosinkinázový receptor MER) či USH2A (kódující usherin). A právě tak na stejném principu lze zkusit genovou terapii u dalších poruch sítnice, jako jsou choroiderémie, Stargardtova choroba, Leberova hereditární neuropatie optiku, achromatopsie a X-vázaná retinoschíza. Proto se rozhodování o použité léčbě musí odvíjet od precizní oftalmologické diagnostiky.

 

PORUCHY SLUCHU

Vrozené formy hluchoty jsou obvykle výsledkem poruch genové funkce, z nichž nejčastější bývá mutace v genu pro gap junction protein beta 2 (GJP2). Experimentálně se na myším modelu podařilo pomocí AAV zprostředkovaným přenosem neporušeného genu navodit potřebná mezibuněčná spojení v hlemýždi.

Dalším genem odpovědným za ztrátu sluchu postižením kochleárních vlasových buněk se ukázal být gen ATOH1 umožňující jejich diferenciaci. Injekční přenos tohoto genu virovými nosiči a jeho následná exprese se ukázal jako slibná možnost navození regenerace vlasových buněk. Jinou cestou k regeneraci vlasových buněk bylo použití mikroRNA (miRNA) zkoušené na kuřatech.

Samostatnou záležitostí je ochrana před postupným úbytkem kochleárních buněk, ke kterému běžně dochází s přibývajícím věkem. V tomto případě se účinným prostředkem ukázala virová transdukce genů pro růstové faktory: BNDF pro mozkový neurotrofický faktor a NT3 pro neutrotrofin-3, která významně podporovala životnost neuronů spirálního ganglia, což naznačuje cestu ke genové terapii ochranou kochleárních buněk před jejich odumíráním (24). Nejčerstvější pohled na tuto problematiku přináší Amariuteiová (25). Je však poněkud skeptická, protože dnes je známo okolo 150 různých genů spojovaných s hluchotou. To ovšem znamená, že dva neslyšící rodiče mohou mít slyšící dítě, pokud jsou heterozygoty pro různé geny podmiňující hluchotu. Některé experimentální práce přinesly sice nadějné výsledky, ale zatím se dostatečně nerozvinulo klinické testování.

 

DIABETES MELLITUS

DM 1. typu

Jednou z prvních úvah o možnostech použití GT k potlačení destrukce pankreatických ostrůvků autoreaktivními T buňkami, byla práce Wongové et al. (32), která objasnila příčinu nedostatku inzulinu poškozením beta-buněk Langerhansových ostrůvků pankreatu. Ještě v publikaci z roku 2021 (33), v níž byly kriticky hodnoceny výsledky prací zveřejněných po roce 2015, byly vysloveny pochyby o použitelnosti GT v klinické praxi. V roce 2023 se však objevily 2 práce vycházející ze zcela odlišného pojetí, založeného na kmenových buňkách. Po transplantaci nezralých buněk Langerhansových ostrůvků primátům se ukázalo, že v potransplantačním období postupně stoupalo množství C peptidu (34). V případě popsaném Keymeulenem et al. (35) byly použity embryonální kmenové buňky, uzavřené ve speciálních kapslích. Množství C peptidu se postupně zvyšovalo v souladu s množstvím podaných buněk.

DM 2. typu

V experimentu se prokázalo, že odpovědným genem může být kostní morfogenní protein (BMP7 – bone morphogenic protein 7) (36), neboť jeho transdukce virovým nosičem byla schopna dlouhodobě upravit citlivost na inzulin a energetickou rovnováhu ve smyslu snížení otylosti. Přitom došlo k přeměně bílé tukové tkáně na hnědou, což bylo spojeno se zvýšením energetického výdeje a souviselo s úpravou energetické rovnováhy. Tyto výsledky naznačily, že genová terapie tohoto onemocnění je již na dosah.

 

NÁDOROVÁ ONEMOCNĚNÍ

Nádorová onemocnění se stávají nejen svým častým výskytem, ale i využitelností GT nejčastějším případem užití genové terapie.

Na uplatnění nejčastější metody manipulace s nukleovými kyselinami metodou CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) upozorňuje ve svém příspěvku Ledfordová (37). Protinádorová léčba (radioterapie, chemoterapie) používá prostředky namířené obecně proti dělícím se buňkám, kdy hlavní charakteristikou odlišení nádorové tkáně od nenádorové je schopnost množit se nezávisle. Prostředky, které nabízí GT, lze zacílit na specifické odlišnosti genotypu nádorových buněk, kterými se liší od zdravých buněk pacienta (38). V rámci individuální variability může být tato léčba vysoce personalizovaná a pro každého pacienta specifická a mnohem přesněji nasměrovaná.

Možnosti, které GT k léčení nádorů přináší, je řada (39, 40). Nejde jen o klasické cíle GT, jako je DNA, její produkt RNA a bílkoviny, ale i o samotné nádorové buňky. Aktivními činiteli této terapie mohou být buňky (buněčná terapie – jak již bylo naznačeno u poruch krvetvorby) nebo viry se svým onkolytickým účinkem (41). Buněčnou terapii lze úspěšně využít v podobě imunoterapie prostřednictvím T lymfocytů nebo NK buněk (přirozených zabíječů) upravených pomocí chimérického antigenního receptoru (CAR – chimeric antigen receptor), tj. CAR-T lymfocyty nebo CAR-NK (natural killer) (42).

Lymfocytové leukémie

Metoda úpravy vlastních buněk pacienta byla využita již v roce 2017 v léčbě lymfocytové leukémie pod označením isagenlekleucel (43). Dětská refrakterní B-akutní lymfocytová leukémie (B-ALL) se již také dočkala klinického testování první fáze (44). U 4 ze 6 pacientů, kteří obdrželi upravené buňky, došlo k remisi. A podobně u chronické lymfocytové leukémie, (CLL), kdy genová terapie byla založena na provokaci imunitní reakce proti antigenům (CD154) vneseným transdukcí adenovirovým vektorem (45).

Lymfomy

Genová terapie nádorových onemocnění krvetvorby, ač tušená již před 10 lety (46), dospěla k reálnému použití teprve nedávno – celý postup, včetně používaných přípravků, je podrobně popsán v přehledu z roku 2020 (47). I v Česku, na Interní hematologické a onkologické klinice LF MU a FN Brno, se podařilo úspěšně vyléčit pacienta s velkobuněčným B lymfomem, kdy genovou manipulaci provedla americká společnost Kite na lymfocytech odebraných pacientovi. Metodou CAR-T jsou pacientovy T lymfocyty upraveny tak, že se navazují na nádorové buňky, které následně lyzují. Podání přípravku vedlo k zásadnímu zlepšení stavu.

Nádory plic

Vůbec nejčastějším mechanismem nádorového zvrhnutí jsou patrně mutace genu pro bílkovinu p53 coby nádorový supresor, která se proto stala cílem mj. protinádorové léčby nemalobuněčných karcinomů plic (48). Proti této formě plicního nádoru lze také zaměřit monoklonální protilátky omezující angiogenezi, např. bevacizumab či ramucirumab; v případě nádorů asociovaných s mutací KRAS jsou to potom jeho inhibitory jako sotorasib a adagrasib.

Melanom

Do zorného pole vědců se použití manipulace s DNA v rámci GT tohoto závažného onemocnění dostalo poměrně záhy a první zprávy o preklinických a i klinických testech se objevily již v roce 2013 (49). Po technické stránce se novou perspektivou zdá být použití nukleových kyselin v nanofarmaceutické úpravě jako nový antimelanomový terapeutický přístup. Vylepšením podmínek GT zlepšujících její úspěšnost se zabývá práce zmiňující pozitivní vliv hypertermie na genovou transdukci (50). V souladu s ostatními aplikacemi GT i léčba melanomu dospěla ke zkoušení vhodných virových přenašečů vybavených onkolytickými schopnostmi (49). Zdá se, že znovuobjevenou oblastí biologické protinádorové léčby se stává použití onkolytických virů, které mají výhodu v možnosti specifického nasměrování na genotyp nádorových buněk. Jejich možnostmi a výhledy se zabývá přehled (50).

I onkogeneze je procesem, na jehož začátku můžeme najít epigenetické změny v DNA. Rozbor situace a klinický význam epigeneze z hlediska genů, které při ní mění svou aktivitu, najdeme v práci z roku 2010 (51). Autoři zároveň rozebírají možnosti takovým změnám bránit potlačením aktivity metyltransferáz (DNMT) a demetylací. Jako účinný se ukázal azacitidin, používaný v léčbě myelodysplastického syndromu a myeloidních leukémií. Také i zde se zmiňují „malé molekuly“ účinné na všechny typy epigenetických změn – nejen na metylace ovlivněním aktivity metyltransferáz, ale týkající se i histonů nebo miRNA a dalších. Bližší současnosti této stránky kancerogeneze se věnuje práce (52), kde najdeme pochopitelně i bohatší přehled „malých molekul“ namířených proti nádorovým procesům. Z 5 tam uvedených cílů lze jmenovat inhibitor histonové deacetylázy (HDAC) a inhibitor poly(ADP-ribóza)polymerázy (PARP) používaný k léčbě karcinomu ovarií.

 

ZÁVĚR

Byť je GT tak lákavá a zřejmě schopná příznivě ovlivnit řadu dosud jinak těžko řešitelných problémů, neměli bychom se spokojit s jejím zvládnutím po technické stránce. Zvláště kliničtí genetici by se měli ve svých úvahách věnovat jejímu možnému populačnímu významu. V tomto směru nejde jen o nechtěné zásahy do funkce genomu mimo vytčený cíl, čemuž se snažíme zabránit mnohastupňovým procesem její přípravy, ale o uvědomění si, co všechno se dovídáme a jaký význam mají naše informace o pacientovi pro jeho příbuzné.

Snad první schválenou GT byla v roce 1990 léčba 2 dětí trpících deficiencí adenosindeaminázy. Od té doby naše schopnosti manipulovat s geny zřetelně pokročily a přibývá oblastí medicíny, do nichž se GT pokouší vstoupit.

Genová terapie je principiálně namířena výhradně na somatické buňky a její účinek se do dalších generací nepřenáší. Avšak pokud nejde o mutace de novo, vypovídá diagnóza vzácného onemocnění též o genomech rodičů postiženého. Tomu tak ale nebude v případech, kdy se uplatňují epigenetické faktory (55).

Vedle klasické genové terapie založené na úpravách genů technikou CRISPR nebo TALEN (transkripční aktivátorová efektorová nukleáza), případně zinc finger, existují alternativní přístupy, např. v přímém působení na informační RNA pre-mRNA syntetickými molekulami, v nichž je pentózový spoj nahrazen morfolinovým. To zajišťuje odolnost těchto molekul proti působení enzymů rozkládajících přirozenou buněčnou RNA. Řada experimentálních prací využívá RNA jako samotného terapeutického činitele (56, 57) nebo k jeho nasměrování na místo účinku (58).

Použití dané formy GT nelze bohužel oddělit od ekonomického hlediska, které zatím představuje zásadní překážku rozšíření některých forem GT, byť jistou nadějí je jejich industrializace. Klinicky důležitou skutečností vymezující použití GT je věk pacienta. K tomu, aby GT mohla být úspěšná, musí se realizovat dříve, než se účinek patogenního genu plně realizuje. Takovou dobou je u vzácných onemocnění rané dětství, a proto je nezbytné stanovit diagnózu co nejdříve.

Záviděníhodným příkladem pro nás může být britský projekt analýzy 100 000 genomů novorozenců Newborn Genomes Programme (www.genomicsengland.co.uk/initiatives/newborns). Genová terapie se však začíná úspěšně uplatňovat i u chorob, které se rozvíjejí v dospělosti a na jejichž příčinách se náš genom podílí sice významně, ale někdy jen částečně. Proto má uvedený projekt dalekosáhlý význam stejně jakákoliv vyšetření genomu, kdy získané poznatky lze využít preventivně. Nezanedbatelnou roli má prevence u všech chorob (59, 60), zejména pak u nádorových onemocnění. V tomto směru přispěli i naši vědci do oblasti nádorové diagnostiky vytvořením celosvětově používaného panelu Czecanca.

 

Poděkování

 

Seznam použitých zkratek

  

Adresa pro korespondenci:
prof. MUDr. Radim Brdička, DrSc.
nezávislý konzultant
e-mail: radim.brdicka@gmail.com