mikroRNA a vnitřní lékařství: od patofyziologie k novým diagnostickým a terapeutickým postupům

Overview

mikroRNA (zkráceně miRNA nebo miR) představují jednu ze skupin malých nekódujících RNA, které se podílejí na negativní posttranskripční regulaci genové exprese. Na podkladě komplementarity bází se vážou na cílové molekuly messengerové RNA (mRNA) a svou vazbou buď brání překladu mRNA do bílkoviny, nebo iniciují degradaci cílové mRNA. Jedna miRNA často cílí více různých mRNA a jedna mRNA je často cílem více různých miRNA – tímto způsobem vznikají rozsáhlé a propletené regulační sítě, jejichž narušení vede k poruchám vývoje tkání a orgánů a které je možné detekovat u řady různých onemocnění. Díky novým postupům, které nám umožňují hladiny miRNA modulovat (ať již navyšovat nebo snižovat) je možné miRNA považovat za novou skupinu terapeutických cílů, přičemž první klinické zkoušky s využitím blokády miR-122 v játrech již přinášejí své ovoce a ukazuje se, že terapie pomocí anti-miR-122 je možné využit v terapii chronické infekční hepatitidy C. Výsledky animálních studií pak dávají dobré předpoklady k tomu, že miRNA bude možné využít i v terapii dalších vnitřních onemocnění, včetně srdečního selhání, bronchiálního astmatu, či nespecifických střevních zánětů. Kromě zapojení miRNA do patofyziologie nemocí a možného terapeutického ovlivnění jejich hladin je intenzivně studován význam tzv. extracelulárních, též cirkulujících, miRNA, tj. miRNA přítomných v extracelulárním prostoru včetně všech známých tělních tekutin, jako je plazma, sérum, moč, sliny či pot. Cirkulující miRNA vykazují značnou stabilitu, jejich hladiny jsou konstantní u jedinců téhož druhu, stanovení těchto hladin je reproducibilní a co je nejdůležitější – hladiny extracelulárních miRNA se liší mezi jedinci zdravými a jedinci trpícími určitou nemocí. Do oběhu se dostávají pasivně při nekróze buněk, nebo jsou do něj aktivně pumpovány a zajišťují mezibuněčnou komunikaci mezi jednotlivými tkáněmi organizmu. Jejich hladiny tak mohou odrážet jak poškození tkání, tak změny ve vnitřním prostředí vyvolané přítomností nemoci. Cílem tohoto souhrnného článku je představit miRNA klinikům, zejména pak internistům. Na jednoduchých příkladech z klinické praxe nebo z klinické patofyziologie článek ukazuje jejich význam v patofyziologii vnitřních nemocí, poukázat na jejich možný léčebný potenciál a také na jejich možné využití v diagnostice vnitřních nemocí.

Klíčová slova:
cirkulující mikroRNA – diagnostika – mikroRNA – terapie – vnitřní nemoci

Malé nekódující RNA, mikroRNA a jejich funkce

Malé nekódující molekuly ribonukleových kyselin (RNA – ribonucleic acid) představují relativně nedávno objevené regulátory genové exprese [1]. Dle dřívějšího schématu, platného po více než 50 let a známého též jako dogma molekulární biologie, je genetická informace člověka uložena v molekulách deoxyribonukleové kyseliny (DNA – deoxyribonucleic acid), odkud jsou její úseky, označované jako geny, přepisovány do podoby přenašečové RNA (mRNA – messenger RNA) a vzniklé mRNA jsou matricí pro vznik bílkovin. Tyto mRNA jsou též známy jako „kódující“ RNA, protože ve své molekule kódují strukturu proteinů, avšak jejich podíl na genomu člověka tvoří pouze 1,5–2 % [2]. V posledních 2 dekádách se však náš náhled na definici slova „gen“ musel změnit, neboť se ukázalo, že velká část lidského genomu obsahuje nejen „protein-kódující geny“, ale také geny pro krátké (tj. dlouhé jen pár desítek nukleotidů) a nekódující (tj. nedávají vznik proteinům) molekuly RNA. Souhrnně se tyto molekuly RNA označují jako „malé nekódující RNA“ (sncRNA – small non-coding RNAs) a představují enormně rozsáhlou skupinu molekul, které se podílejí na regulaci genové exprese, a tím i na vývoji tkání a orgánů, na udržování homeostázy, avšak také na patogenezi řady onemocnění [1–3].

mikroRNA (miRNA, miR) jsou jednou z podskupin sncRNA o délce asi 22–24 nukleotidů. Jejich struktura je zakódována v genech, které jsou rozmístěny difuzně po celém našem genomu, ať již v intergenních oblastech (tj. v oblastech mezi známými protein-kódujícími geny) nebo v oblastech intragenních (tj. jsou např. uloženy v intronech již známých genů) [1]. Vznik miRNA je několikastupňový proces (obr. 1.1), který zahrnuje přepis DNA do molekuly primární miRNA (pri-miRNA) s využitím enzymu RNA-polymerázy, následně sestřih takto vzniklé pri-miRNA pomocí enzymu Drosha do podoby prekurzorové miRNA (pre-miRNA), jež je následně přemístěna z jádra buňky do cytosolu pomocí přenašečového systému exportin-5/RanGTP. pre-miRNA má charakteristický tvar vlásenky (obr. 1.2), která je v cytoplazmě rozštěpena pomocí enzymu Dicer – vzniká tak dvouvláknová zralá (maturovaná) molekula miRNA, v níž jedno vlákno (označované jako doprovodné) podléhá ve většině případů degradaci a druhé vlákno (označované jako vedoucí) vytvoří komplex s argonautovými proteiny [4]. Tento komplex nazýváme miRNA-indukovaný tlumící komplex (miRISC – miRNA-induced silencing complex), jehož cílem je utlumit expresi cílových genů. Na podkladě komplementarity bází (adenin-uracil, guanin-cytosin, tj. A-U, C-G) se miRNA váže na cílovou mRNA: je-li komplementarita bází úplná, následuje rozklad cílové mRNA; je-li komplementarita bází neúplná, způsobí vazba miRISC na cílovou mRNA blok translace, tj. takto zablokovaná mRNA nemůže být překládána do bílkovin. V obou případech zajišťuje miRISC tzv. negativní post-transkripční regulaci genové exprese, tj. svou vazbou na mRNA (tj. posttranskripčně) brání vzniku (tj. negativní regulace) cílových proteinů [4].

Regulace prostřednictvím miRNA je vysoce komplexní. Jedna miRNA poměrně často cílí na mRNA více různých proteinů; tyto proteiny mohou být součástí jedné signální/metabolické dráhy, nebo mohou patřit do několika různých drah [5]. Jako příklad uveďme miR-33: jedná se o miRNA důležitou pro metabolizmus cholesterolu, mastných kyselin i glukózy (to znamená, že ovlivňuje hladiny bílkovin/enzymů důležitých pro metabolizmus různých živin). V rámci metabolizmu cholesterolu tato miRNA cílí jak na molekuly důležité pro transport cholesterolu do žluče (např. transportéry závislé na přítomnosti adenozin-trisfosfátu, ABCB11, či ATP8B1), tak na molekuly zapojené do reverzního transportu cholesterolu z tkání do jater (např. ABCA1, ABCG1) [6,7]. Tímto způsobem ovlivňuje miR-33 metabolizmus cholesterolu na několika úrovních, a významně tak ovlivňuje jeho hladiny v krvi. Druhý stupeň komplexnosti vzniká tím, že jedna molekula mRNA je často cílem různých miRNA. Zůstaneme-li u metabolizmu cholesterolu, tak molekula ABCA1, která je kritická při transportu cholesterolu do lipoproteinových částic a pro vznik lipoproteinů o vysoké hustotě (HDL), je cílem nejen miR-33, ale také miR-10, miR-26, miR-27, miR-144, miR-145 a dalších miRNA [5]. S ohledem na výše řečené lze na miRNA nahlížet dvojím způsobem – některé miRNA se podílejí na jemném doladění („fine-tuning“) genové exprese a jiné miRNA představují významné regulátory genové exprese schopné přivést buňky do apoptózy, či naopak iniciovat jejich proliferaci (množení) a diferenciaci směrem k vybranému buněčnému typu.

mikroRNA v patofyziologii lidských onemocnění

Byť malé svou velikostí, jsou miRNA velké svým potencionálním významem. Zcela první miRNA, nazvaná lin-4, byla objevena v roce 1993 při studiích hlístice – háďátka obecného, Caenorhabditis elegans [8]. Na háďátku se ukázalo, že jsou miRNA nezbytné pro jeho zdárný vývoj a pro přechody z jednotlivých larválních stadií do stadia dospělého. Uplynulo pak asi 10 let a ukázalo se, že miRNA tvoří evolučně starou a vysoce zakonzervovanou skupinu molekul (jejich geny se v průběhu evoluce jen minimálně měnily a člověk má podobné geny kódující miRNA jako třeba laboratorní potkan, makak či zmiňované háďátko) a je možné je detekovat i u člověka [9]. Podobně jako u háďátka pak bylo i u dalších organizmů popsáno, že zvýšení, či snížení hladin určitých miRNA během embryogeneze či organogeneze vede k opoždění, či naopak urychlení diferenciace nebo množení buněk a může vyústit v řadu vývojových abnormalit [3]. Jedním z nejznámějších pokusů v této oblasti bylo vygenerování tzv. double knock-out myší, u nichž byla zcela vyřazena funkce Diceru (enzymu nezbytného pro zpracování miRNA, viz výše), což vyústilo v časnou embryonální letalitu, zřejmě na podkladě poruchy expanze žloutkového váčku a narušení vaskulogeneze [10].

První studie, které asociovaly změněnou expresi miRNA s lidskými onemocnění, pocházely z oblasti hematoonkologie. Calin et al prokázali, že u jedinců s chronickou lymfocytární leukemií (CLL) dochází ke snížení exprese miR-15 a miR-16 [11]. Již dlouhodobě je známo, že u jedinců s CLL dochází často k deleci genového lokusu 13q14. Právě v tomto krátkém úseku se nachází geny pro obě zmiňované miRNA, a tím že u jedinců s CLL dochází ke ztrátě jejich genů, dochází i ke snížení hladin miR-15 a miR-16, které se za běžných okolností chovají jako nádorové supresory. Jejich absence vede k odolnosti nádorových buněk vůči apoptóze (mj. proto, že tyto miRNA cílí antiapoptotický gen BCL2, jehož hladiny jsou v postižených buňkách zvýšeny) a urychluje proliferaci postižených buněk, což se následně projeví vznikem CLL [12]. Stejná skupina také prokázala, že zhruba 50 % genů pro miRNA se nachází v oblastech, které jsou deletovány nebo amplifikovány u různých typů rakoviny [13] a další práce v oblasti onkologie na sebe poté nedaly dlouho čekat – ukázalo se, že u různých typů nádorů dochází k dysregulaci hladin celých skupin miRNA, což může u postižených jedinců korelovat s přežitím, rychlostí růstu nádoru, či odezvou na terapii, neboť byly postupně popsány miRNA nezbytné pro procesy metastazování, apoptózy, či nádorové neoangiogeneze. Pro detailnější přehled miRNA zapojených do rozvoje nádorů odkazujeme na českou monografii O. Slabého a kolektivu, mikroRNA v onkologii [14].

Další nemoci, včetně všech oblastí vnitřního lékařství, na sebe nenechaly dlouho čekat a v dnešní době lze s nadsázkou říci, že se miRNA podílejí na patogenezi všech vnitřních nemocí, od problematiky plicní (např. chronická obstrukční plicní nemoc či asthma bronchiale [15]), gastroenterologické (např. vředová choroba gastroduodena [16], nespecifické střevní záněty [17]), hematologické (anémie a hematologické malignity [18]) přes problematiku kardioangiologickou (ischemická choroba srdeční a infarkt myokardu [19], srdeční selhání [20], hypertenze [21], arteriální aneuryzmata [22]), metabolických onemocnění (diabetes mellitus či dyslipidemie [23], osteoporóza [24]) či nefrologickou (tubulointersticiální poškození či chronická ledvinná nedostatečnost [25]) až k problematice infekčních a kožních onemocnění (např. hepatitida C [26], psoriáza [27]).

mikroRNA v terapii vnitřních nemocí

Z odstavců výše jasně vyplývá, že hladiny miRNA se u různých onemocnění mění, jak vlivem nemoci samotné, tak působením rizikových faktorů, léčiv nebo jiných vnějších vlivů. Otázkou nyní zůstává, zda by bylo možné tyto hladiny nějakým způsobem ovlivnit k našemu prospěchu, tedy zda je možné miRNA využít v terapii onemocnění. Odpověď není zatím zcela jednoduchá, avšak výsledky řady preklinických a pilotních klinických studií ukazují, že jednoho dne se terapie s pomocí nekódujících RNA možná dočkáme [28].

Obecně je možné na terapii s využitím miRNA nahlížet následovně: jsou-li hladiny miRNA vlivem nemoci sníženy, je nutné tyto hladiny substituovat/navýšit, a naopak jsou-li hladiny miRNA zvýšeny, je nutné tyto amplifikované miRNA zablokovat. Doplnění chybějících miRNA je značně složitější proces a zahrnuje v sobě využití demetylujících agens (léky, které demetylují ty části DNA, které kódují miRNA a tím umožní jejich vyšší expresi), virových vektorů (s využitím adenovirů lze do genomu buňky vpravit sekvenci miRNA, kterou chceme doplnit a zvýšit tak její expresi) nebo lze využít léky, které zefektivní biogenezi miRNA (např. látka enoxacin zvyšuje účinnost enzymu Dicer, a tím tvorbu miRNA) [1,28]. Zablokování zvýšeně exprimovaných miRNA pak lze dosáhnout s využitím tzv. „anti-miRNAs“ nebo „miRNA-inhibitorů“ – základem těchto molekul je sekvence RNA, která přesně odpovídá sekvenci miRNA, jejíž hladiny chceme snížit. Na podkladě komplementarity bází a s využitím jevu tzv. RNA-interference se podaný miRNA-inhibitor spojí s cílenou miRNA, čímž zablokuje její funkci. Molekula miRNA-inhibitorů jako taková je však málo stabilní (např. hrozí její štěpení vlivem lytických enzymů přítomných v plazmě) a je nutné ji modifikovat (např. napojením na molekuly cholesterolu), čímž je dosaženo větší stability, delšího eliminačního poločasu a dalších výhodných vlastností [28]. V preklinických zkouškách se setkáme s oběma výše popsanými postupy, do klinické praxe se však v současné době jeví jako slibnější využití miRNA-inhibitorů [29].

Přehled studií využívajících anti-miRNA v terapii různých vnitřních nemocí je uveden v tab. 1. Z této tabulky si dovolujeme upozornit na klinickou studii NCT01200420 (clinicaltrials.gov), která již proběhla ve fázi IIa v roce 2013 [26]. Tato studie zahrnovala 36 jedinců s chronickou hepatitidou C infikovaných virem HCV1. Postiženým jedincům byla po dobu 5 týdnů subkutánně aplikována léčivá látka zvaná miRavirsen, což je miRNA-inhibitor cílený proti jaterně specifické miR-122. Tato miRNA kromě toho, že plní řadu fyziologických funkcí v hepatocytech, je „zneužívána“ virem hepatitidy C a její přítomnost je nezbytná pro jeho efektivní replikaci. Blokáda miR-122 s využitím miRavirsenu způsobila signifikantní redukci v celkové náloži virové RNA a tento efekt přetrval i po ukončení aktivní terapie. U 5 jedinců dokonce virová RNA nebyla detekována vůbec [26]. Výsledky této první studie jasně poukazují na potenciál, který by miRNA mohly znamenat jako nové terapeutické cíle v léčbě vnitřních nemocí.

mikroRNA jako diagnostické a prognostické markery

Další přelomový objev týkající se možného využití miRNA v medicíně přišel v roce 2008. Ukázalo se, že krom výše popsaných intracelulárních funkcí je možné miRNA detekovat i v extracelulárním prostoru, ať již se jedná o krevní deriváty (sérum či plazmu), moč, sliny, pot, nebo třeba mateřské mléko [30–33]. Hladiny miRNA je možné stanovit reproducibilně a jsou stabilní u jedinců jednoho druhu, jsou nenáhodné a mění se vlivem různých patologických stavů [30,31]. O některých miRNA se dokonce hovoří jako o „tkáňově specifických“, což znamená, že jejich exprese je v určité tkáni 40krát vyšší než v ostatních tkáních [34] a přítomnost takových miRNA v krvi by mohla odrážet poškození jednotlivých orgánů. Význam cirkulujících miRNA se nyní jeví trojí – mohou sloužit jako biomarkery nemoci či poškození orgánu; mohou predikovat další vývoj nemoci a v neposlední řadě představují nové mediátory mezibuněčné komunikace [35].

Potencionální využití miRNA jako biomarkerů různých nemocí je nyní intenzivně studováno ve všech oborech vnitřního lékařství – tento zájem odstartovalo v již zmiňovaném roce 2008 zjištění, že miR-141 je zvýšena v séru u pacientů s rakovinou prostaty [30], dále že miRNA důležité pro funkci placenty jsou zvýšeny v cirkulaci u těhotných žen [32] a že u pacientů s rakovinou plic, kolorekta a u pacientů s diabetem dochází ke změnám hladin specifických miRNA oproti zdravým osobám [31]. Cirkulující miRNA se v cirkulaci nacházejí v komplexu s proteiny nebo uschované uvnitř apoptotických tělísek (tělísek vznikajících při zániku buňky apoptózou), exozomů a mikrovezikul nebo dokonce uvnitř lipoproteinových částic (HDL či LDL) [35]. Bylo prokázáno, že po infarktu myokardu se do oběhu dostávají srdečně specifické miRNA (např. miR-1, miR-208, či miR-499) a jejich hladiny se mění podobně, jako hladiny srdečně specifických troponinů [36]. Celé skupiny miRNA jsou v krvi dysregulovány u pacientů s diabetem a jsou asociovány s rozvojem jednotlivých skupin diabetických komplikací [37]; z nich uveďme např. miR-126, která byla prokazatelně snížena u diabetiků s preklinickým i klinickým postižením tepen dolních končetin [38], nebo např. miR-375, jejíž hladiny na myším modelu streptozocinem indukovaného diabetu korelovaly s odumíráním B-buněk pankreatu [39]. Jiné studie ukazují, že se hladiny miRNA mění u kuřáků, u nichž odrážejí vznik plicní fibrózy, jiné cirkulující miRNA jsou v krvi zvýšeny u jedinců s CHOPN či astmatem [40]. Přehled zmíněných a dalších příkladů možného využití miRNA v diagnostice vnitřních nemocí udává tab. 2. Obecně lze na základě doposud provedených studií říci, že hladiny cirkulujících miRNA citlivě odrážejí patologické změny v organizmu, jejich hladiny odrážejí nejen přítomnost, ale i aktivitu onemocnění a je možné je reprodukovatelně stanovit z tělních tekutin. Další studie zaměřené na precizní stanovení specificity a senzitivity na větších kohortách pacientů s různými onemocněními nebo studie cílící na nalezení vhodné vnitřní kontroly (tj. konkrétní miRNA, jejíž hladiny se nemění vlivem žádné z nemocí) jsou potřebné k tomu, aby se doposud zjištěné informace mohly převést do klinické praxe.

Kromě diagnostického potenciálu přinášejí změněné hladiny cirkulujících miRNA i řadu dalších informací o dalším možném vývoji onemocnění, tj. mají i prediktivní význam. U již zmiňovaných pacientů po infarktu myokardu predikují přetrvávající zvýšené hladiny miR-1 vznik časného srdečního selhání (do 1 roku od prodělání infarktu) nebo vznik závažných arytmií [41]. Již zmiňovaná miR-126 patří do panelu 5 miRNA (spolu s miR-15a, miR-320, miR-223 a miR-28–3p), jejichž změněné hladiny predikují budoucí vznik diabetu u jedinců, kteří jsou ještě normoglykemičtí – s využitím 10 let zamražených vzorků séra a dat z následného 10letého sledování vzorkovaných pacientů to ukazují data od Zampetaki et al [38]. U pacientů s různými typy rakoviny korelují hladiny cirkulujících miRNA s prognózou, přežitím pacientů či mohou predikovat odezvu nádoru na léčbu [42]. S ohledem na možný prognostický potenciál, který by cirkulující miRNA mohly mít ve všech oblastech vnitřního lékařství, jsou nyní potřeba dlouhodobé studie na velkých kohortách, které tento potenciál potvrdí, či vyvrátí.

V neposlední řadě je nutné u cirkulujících miRNA zmínit i potencionální význam v mezibuněčné komunikaci. Zde hrají roli zejména miRNA uschované v apoptotických tělíscích, exozomech a lipoproteinových částicích; ukazuje se, že takto uschované miRNA jsou do extracelulárních tělísek aktivně pumpovány při jejich vzniku a mohou z nich být aktivně předány do cílových buněk, což následně vede k ovlivnění genové exprese v těchto buňkách [35]. V rámci této práce uvedeme 3 zajímavé příklady umožňující náhled do patofyziologie vnitřních nemocí.

miR-126

miR-126, již zmiňovaná v kontextu biomarkerů postižení cév u pacientů s diabetem, je uvolňována do cirkulace buňkami, které vlivem aterosklerotického poškození a ischemie vstupují do apoptózy; miR-126 je uschovaná v apoptotických tělíscích a v této podobě je následně vychytána v okolních endotelových buňkách (parakrinní komunikace), v nichž navozuje odolnost vůči apoptóze a ovlivňuje infiltraci cévní stěny tkáňovými makrofágy [43]. miR-126 se tak významným způsobem podílí na ochraně endotelu před aterosklerózou.

miR-150

Další miRNA, miR-150, je aktivně uvolňována do oběhu makrofágy [44]. miR-150 produkovaná makrofágy je uschovaná do exozomů (malých membránových váčků), v této podobě se dostává k buňkám cévní stěny a zde podporuje neoangiogenezu, tedy tvorbu nových cév. Jedna ze signálních molekul, která by se tohoto procesu mohla účastnit je vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF), jehož hladiny jsou pomocí miR-150 nepřímo navyšovány [45]. Aplikace miR-150 by tak jednoho dne mohla být potencionálně užitečná u onemocnění spojených s ischemií.

miR-223

Jako poslední, avšak neméně důležitou, uvádíme roli miR-223; tato miRNA představuje nejvíce zastoupenou miRNA v lipoproteinových částicích [46] a recentní studie ukazují, že miR-223 je možné z HDL transportovat do endotelových buněk, v nichž se tato miRNA normálně nenachází, a přítomnost miR-223 v endotelových buňkách snižuje expresi intracelulární adhezní molekuly (ICAM1), která je důležitá pro rozvoj aterosklerózy. Extracelulární přenos miRNA pomocí HDL nám tak částečně osvětluje dlouhodobě známý fakt, že HDL je považován za „hodný cholesterol“.

Závěr

Z výše uvedeného jasně vyplývá, že mikroRNA představují potencionálně velice významnou skupinu biomolekul, jejichž zapojení do patofyziologie řady onemocnění již nemůže být v současnosti zpochybňováno. Animální i humánní studie modulující hladiny miRNA v organizmu, tkáni či jen na buněčných kulturách pak ukazují na jejich terapeutický potenciál v léčbě různých nemocí. Využití panelů (vybraných skupin) cirkulujících miRNA pak představuje nový atraktivní způsob jak zjednodušit diagnostiku některých onemocnění a jak zefektivnit sledování pacientů s cílem vytvoření terapie na míru toho či onoho konkrétního pacienta a splňuje předpoklady pro budoucí využití v rámci personalizované medicíny. Nutno podotknout, že stále zůstává řada nevyřešených otázek, ať již se jedná o možné nežádoucí vedlejší účinky terapie pomocí miRNA nebo o přesné určení senzitivity a specifity cirkulujících miRNA v diagnostice; rovněž není možné zanedbat fakt, že pro stanovení hladin miRNA jsou stále využívány technicky náročné metody izolace a časově náročné metody stanovení založené na polymerázové řetězové reakci v reálném čase (tzv. real-time PCR) – i zrychlení, standardizace a vylepšení těchto metod bude časem nezbytné pro zavedení miRNA do běžné klinické praxe. Po překonání všech těchto technických obtíží však mají miRNA velký předpoklad stát se novými pomocníky v péči o pacienty s vnitřními onemocněními.

Vznik této studie byl podpořen z projektu „Kardiovaskulární systém: od modelu přes terapii k prevenci“ číslo MUNI/A/1365/2015 podpořeného z prostředků účelové podpory na specifický vysokoškolský výzkum, kterou poskytlo MŠMT v roce 2016.

MUDr. Jan Novák

jan.novak@fnusa.cz

II. interní klinika LF MU a FN u sv. Anny v Brně

www.fnusa.cz

Doručeno do redakce 19. 11. 2015

Přijato po recenzi 21. 5. 2016