AGEs a RAGE – konečné produkty pokročilé glykace a jejich receptor v otázkách a odpovědích

Konečné produkty pokročilé glykace (advanced glycation end products – AGEs) hrají významnou roli v patogenezi řady chronických onemocnění a jejich komplikací, především diabetických komplikací, aterosklerózy, komplikací chronických onemocnění ledvin a neurodegenerativních onemocnění. Tyto látky vznikají neenzymatickou glykací a jejich tvorba je potencována vlivem karbonylového stresu. AGEs tvoří heterogenní skupinu látek a patří mezi ně např. karboxymetyllyzin, pentozin, metylglyoxallyzin dimer, vesperlyzin, imidazolony a další. AGEs jednak modifikují proteiny a mění jejich fyzikální a chemické vlastnosti, jednak mají účinky zprostředkované přes receptory, z nichž nejznámější, ale ne jediný, je receptor RAGE (receptor pro konečné produkty pokročilé glykace). RAGE je receptor multiligandový, váže také HMGB1 (high mobility group box protein 1), S100 proteiny či amyloidové fibrily. Vazba ligand na tento receptor má za následek aktivaci řady signálních cest včetně indukce oxidačního stresu a aktivace nukleárního faktoru κB a následnou prozánětlivou odpověď v závislosti na buněčném typu. AGEs a RAGE se spolu s dalšími mechanizmy – hexosaminovou cestou, polyolovou cestou, poruchou metabolizmu lipidů, aktivací proteinkinázy C, oxidačním stresem a zánětlivou reakcí spoluúčastní v patogenezi diabetických komplikací. Terapeuticky je možné snižovat endogenní tvorbu AGEs, ovlivnit přísun AGEs do organizmu stravou a jejich absorpci ve střevě či stimulovat jejich degradaci.

Klíčová slova:
AGEs – diabetes mellitus – karbonylový stres – konečné produkty pokročilé glykace – oxidační stres – RAGE – receptor pro AGEs – sRAGE – zánět

Úvod

Konečné produkty pokročilé glykace (advanced glycation end products – AGEs) jsou spojovány s patogenezí diabetických komplikací a dalších patologických stavů. Cílem této práce není podat vyčerpávající přehled o AGEs, ale stručně se zaměřit se na několik aspektů, které jsou v souvislosti s AGEs často diskutovány. Zvolili jsme formu několika otázek a odpovědí na následující téma:

• historie AGEs
• AGEs a glykovaný hemoglobin
• AGEs jako „glykotoxiny“
• receptor pro AGEs
• genetická predispozice k AGE toxicitě
• AGEs jako jeden z hráčů v mechanizmech poškození
• terapeutické možnosti ovlivnění

Otázka 1: Jsou AGEs novinkou 21. století?

AGEs slaví již více než stoleté výročí! Byly poprvé popsány v roce 1912 francouzským chemikem L. C. Maillardem, který pozoroval vznik hnědé substance při zahřívání aminokyselin a cukrů [1]. Podle něj nese také název reakce vedoucí k jejich vzniku – Maillardova reakce, tedy neenzymatická glykace. Maillard byl potravinový chemik a AGEs tak byly nejprve předmětem zájmu této skupiny výzkumníků, jejich zájem trvá doposud.

Teprve později se zjistilo, že se AGEs spolupodílejí na vzniku a rozvoji diabetických komplikací a v 80. a 90. letech minulého století nastartoval intenzivní výzkum těchto látek v diabetologii [2–5] trvající dosud. Později se zjistilo, že se AGEs zvyšují u nemocných se selháním ledvin a byly zařazeny mezi nové uremické toxiny [5–7]. Téměř současně bylo prokázáno, že se AGEs akumulují v nervové tkáni u Alzheimerovy choroby [8] a dalších neurodegenerativních onemocnění. Navíc v roce 1992 M. Neeper et al [9] objevili receptor pro AGEs (RAGE), který zprostředkuje část patologických účinků AGEs. Postupně se zájem o tyto látky rozšířil i do dalších oborů, protože se zjistilo, že AGEs mají vztah k zánětu, kardiovaskulárnímu postižení, revmatickým onemocněním, degenerativním onemocněním kloubů či patologickým stavům v těhotenství, především preeklampsii. V poslední době je v popředí zájmu výzkum AGEs a RAGE u nádorových onemocnění [10,11].

I přes více než 100 let existence je téma AGEs stále aktuální.

Otázka 2: Pro monitoraci dlouhodobé kompenzace diabetiků běžně stanovujeme glykovaný hemoglobin HbA_1c. Jak souvisí s AGEs?

AGEs vznikají neenzymatickou glykací, která ve své klasické formě začíná vazbou aldehydové skupiny redukujícího cukru, např. glukózy na aminoskupinu proteinu, nejčastěji ε-aminoskupinu lyzinu nebo aminoskupinu argininu. V závislosti na koncentraci cukru je vytvořena reverzibilní Schiffova báze (labilní aldimin). Postupně dochází k přesmyku na stabilnější přechodný produkt glykace Amadoriho produkt (ketoamin). V pozdní fázi, již nezávisle na koncentraci glukózy, řadou chemických reakcí vznikají ireverzibilní konečné produkty pokročilé glykace AGEs. Nicméně glukóza, její metabolity vzniklé v glykolýze, Schiffova báze i Amadoriho produkt mohou dát vznik reaktivním karbonylovým sloučeninám, které jsou prekurzorem AGEs (schéma 1). Hovoříme pak o karbonylovém stresu [12]. Různé možnosti vzniku AGEs jsou podkladem heterogenity těchto látek a také zdrojem problému stanovit AGEs „komplexně“.

HbA_1c je Amadoriho produkt vzniklý vazbou glukózy na β-N-terminální valin globinového řetězce a přeuspořádán na 1-deoxy-N-valyl fruktózu [13]. Glykovaný hemoglobin odráží dlouhodobou hladinu glykemie a koreluje s diabetickými komplikacemi a je tak ukazatelem jejich rizika. V běžné praxi je tedy vhodnou a přijatelnou alternativou AGEs, jejichž stanovení je materiálně-technicky náročné (nejvhodnější je plynová chromatografie spojená s hmotnostní spektrometrií) a v rutinní praxi nemožné.

AGEs vznikají i za fyziologického stavu organizmu a k jejich pomalému nárůstu dochází s věkem. Ani hodnota HbA_1c u zdravého člověka není nulová. Při hyperglykemii je ovšem větší nabídka substrátů pro glykaci a reakce tedy probíhá ve zvýšené míře.

Otázka 3: Tvoří se AGEs jen v organizmu, tedy in vivo?

Glykace probíhá nejen v organizmu. AGEs si jednoduše můžeme připravit i v laboratoři, budeme-li inkubovat nějaký protein s redukujícím cukrem. Můžeme pak pozorovat změnu zbarvení roztoku od bílo-bezbarvého přes světle žluté, tmavší žluté až po hnědavé.

Studium reakcí cukrů a bílkovin bylo původně doménou potravinových chemiků, což ukazuje, že potrava může být dalším zdrojem AGEs a jejich prekurzorů (proto je též někdy užíván pro AGEs název „glykotoxiny“), schéma 2. Množství AGEs v potravě se zvyšuje s teplotou zpracování, tzn. smažení, grilování a pečení je z tohoto hlediska horší než samotné vaření potravin. Za daných okolností ale vznikají i další látky, nejen AGEs, které rovněž mohou mít patologické účinky. Dalším, často zanedbávaným zdrojem AGEs je tabákový kouř.

Je opakovaně diskutováno, zda a jak mohou AGEs z potravy ovlivnit lidské zdraví a názory odborníků se různí [14,15]. V experimentu na laboratorních zvířatech bylo již před několika lety ukázáno, že potrava bohatá na AGEs může vést k akumulaci pigmentových substancí v ledvinách a játrech, k akceleraci vaskulárních změn jako u diabetes mellitus a k poškození ledvin [16]. Také byl prokázán vliv AGEs z potravy na indukci zánětlivých mediátorů [17]. Studie potravinových chemiků ovšem zjistily, že za fyziologických okolností je jen malá část AGEs z požité potravy (asi 10 %, především nízkomolekulární látky) absorbována do cirkulace a z nich asi 30 % je vylučováno močí a stolicí [18]. Osud většiny absorbovaných AGEs stále zůstává nejasný. Je třeba si ale uvědomit, že jinak to může být za okolností patologických v případě zvýšené prostupnosti střevní stěny a že AGEs mohou působit také přímo v zažívacím traktu, i když nedojde k jejich vstřebání.

Otázka 4: Je RAGE specifický receptor pouze pro AGEs?

RAGE (receptor pro AGEs) byl objeven v roce 1992 [9] a AGEs byly popsány jako první ligandy. RAGE je ale receptor multiligandový a může vázat řadu S100 proteinů (nejvíce se hovoří o S100A12 – extracellular newly identified RAGE ligand – EN-RAGE) [19], HMGB1 (amphoterin) [20] či amyloid β-peptid [21].

EN-RAGE je exprimován především neutrofily [22], patří mezi alarminy [23] a je spojován především se zánětlivými stavy [24]. HMGB1 (amphoterin) je nehistonový jaderný protein, který váže dvouvláknovou DNA. V průběhu vývoje nervového systému je nezbytným signálem pro růst neuritů [20]. V případě poškození je uvolňován z buněk a je důležitou signální molekulou. Je spojován se zánětem a nádory [25]. Amyloid β-peptid je molekula, která se spoluúčastní v patogenezi Alzheimerovy choroby.

Na situaci ale musíme nahlížet komplexně (schéma 1 a schéma 2): nejen že RAGE je receptor multiligandový a váže kromě AGEs další molekuly, ale také AGEs a i ostatní RAGE ligandy se mohou vázat na jiné receptory. Dalšími receptory schopnými vázat AGEs jsou např. AGE-R1, AGE-R2, AGE-R3, scavangerové receptory makrofágů či toll-like receptor 4 (TLR 4) [26,27]. Podobně HMGB se může vázat také na TLR 2 a TLR 4 [28]. Navíc AGEs mohou modifikovat proteiny a měnit jejich fyzikální a chemické vlastnosti a mít tak i další patologické účinky než jen zprostředkované přes receptory.

Otázka 5: Stojí za vším genetika?

I když do úvah zahrnujeme vliv prostředí a stravy, neměli bychom opomenout také možnou genetickou predispozici k různým patologickým stavům.

RAGE se uplatňuje při zánětlivé reakci a jeho absence či blokáda snižuje rozvoj patologických stavů spojených se zánětem [29]. Naopak zvýšená exprese RAGE souvisí s cévním poškozením, diabetickou nefropatií a neuropatií [30]. V genu pro RAGE (AGER) lokalizovaném na 6. chromozomu (6p21.3) je popisováno téměř 200 jednonukleotidových polymorfizmů, jejichž význam se různí. Polymorfizmy lokalizované na promotoru (-429 T/C, rs18000625; -374 T/A, rs18000624) mohou zvyšovat transkripci [31]. Další významné polymorfizmy se týkají oblasti, kde dochází k alternativnímu sestřihu RAGE mRNA a tvorbě RAGE bez transmembránové domény [32]. Tato varianta spolu s extracelulární doménou RAGE vzniklou proteolytickým štěpením transmembránového RAGE tvoří tzv. cirkulující či solubilní RAGE (sRAGE) [33,34], schéma 2. Významný je polymorfizmus 557G/A (rs2070600), který vede k záměně aminokyseliny glycinu za serin v pozici 82. To ovlivní N-glykosylaci asparaginu v pozici 81 a má za následek zvýšenou vazbu ligand na RAGE [35,36]. Naše výzkumy ukazují, že v naší populaci jsou mutovaní homozygoti velmi vzácní [11,37]. Přítomnost minoritní alely je spojena s významně nižšími koncentracemi sRAGE [38]. Některé polymorfizmy mají také prognostický význam [39].

Za zmínku stojí také genetické varianty týkající se enzymů, které odstraňují prekurzory AGEs. Jedním z enzymů je glyoxaláza I (GLO1), která metabolizuje metylglyoxal. AA varianta polymorfizmu rs4746 419A/C, která obsahuje glutamát, je hyperglykozylovaná a má sníženou aktivitu [40].

Otázka 6: Mohou AGEs opravdu za všechno?

AGEs jsou jedním ze spolupůsobících mechanizmů a na jejich význam v patogenezi různých patologických stavů musíme pohlížet vždy komplexně (schéma 1 a 2). V úvahu je třeba brát také vliv prostředí a genetické faktory.

V případě diabetických komplikací je nutné zmínit také hexosaminovou cestu, polyolovu cestou, poruchu metabolizmu lipidů, aktivaci proteinkinázy C, oxidační stres a zánětlivou reakci [41]. Na komplikacích chronického onemocnění ledvin se rovněž podílí řada změn, mezi něž patří poruchy acidobazické rovnováhy, objemové přetížení, poruchy kalciofosfátového metabolizmu, zánět, oxidační stres či proteinoenergetická malnutrice. Své místo zde má také efekt různých uremických toxinů, které se u těchto nemocných akumulují. Mezi ně patří nejen AGEs, ale také např. guanidiny (ADMA a SDMA – asymetrický a symetrický diametylarginin, guanidinosukcinát), indoxylsulfát, p-kresylsulfát, faktor D komplementu, β₂-mikroglobulin, parathormon či FGF-23 (fibroblastový růstový faktor 23) [42]. Podobně v případě Alzheimerovy choroby musíme kromě AGEs, které jsou zvýšeny v mozku a likvoru, hovořit také o amyloid β-peptidu, který se rovněž může vázat na RAGE, alteraci energetického metabolizmu, oxidačním stresu, apo E4, snížení aktivity proteinkinázy C či redistribuci redoxně aktivního železa [41].

Otázka 7: Co můžeme v souvislosti s AGEs udělat?

AGEs vznikají jednak přímo v organizmu, jednak se do těla mohou dostat z exogenních zdrojů. Cílem je tedy snížit nejen endogenní tvorbu, tedy ovlivnit jejich prekurzory, především koncentraci cukrů – snížení glykemie, ale také ovlivnění jejich tvorby vlivem oxidačního stresu antioxidanty či ovlivnění dalších metabolických cest deriváty vitaminu B pyridoxaminem [43] či benfothiaminem [44]. Ke snížení množství exogenních AGEs je pak na místě nutriční intervence (omezit smažená či grilovaná jídla) a snažit se inhibovat vstřebávání AGEs ve střevě. Byly prokázány pozitivní účinky sevelameru [45] či AST 120 [46].

Pokud již dojde k akumulaci AGEs v organizmu, je třeba si uvědomit, že většina AGEs je vázána na proteiny, tzn., že jejich odstraňování není zcela jednoduché. Je možné stimulovat degradaci proteinů modifikovaných AGEs (ALT-711) [47] a otázkou je také blokáda účinku na specifických receptorech. Specifickou problematikou jsou pak AGEs u pacientů s onemocněním ledvin, u nichž jsou ve hře také různé metody náhrady funkce ledvin.

Závěr

Závěrem můžeme shrnout, že AGEs jsou významnými látkami, které spolupůsobí v mechanizmech poškození. Na jejich vznik, metabolizmus, působení i možnosti ovlivnění je třeba se dívat vždy v širším kontextu.

Výzkum autorů na problematice AGEs a RAGE byl podpořen výzkumnými záměry PRVOUK UK P25/LF1/2 a RVO-VFN 64165.

prof. MUDr. Tomáš Zima, DrSc., MBA

zimatom@cesnet.cz

Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky 1. LF UK a VFN, Praha

ulbld.lf1.cuni.cz

Doručeno do redakce 26. 6. 2014

Přijato po recenzi 17. 7. 2014