Příspěvek k hodnocení sérových hladin vybraných bio­logických působků u monoklonální gamapatie nejistého významu a v jednotlivých klinických stadiích mnohočetného myelomu

Overview

Úvod:
Náplní studie bylo vyhodnocení sérových hladin 12 vybraných ukazatelů u monoklonální gamapatie nejistého významu (MGNV) a iniciální, asymptomatické fáze mnohočetného myelomu (MM), a to i z pohledu potenciálního přínosu pro odlišení obou stavů. Soubor a metody: Analyzovanou 131člennou sestavu tvořilo 62 jedinců s MGNV a 69 nemocných s MM splňujících International Myeloma Working Group (IMWG) kritéria. K vyšetření sérových hladin byly použity metody: kvantitativní imunoradiometrie (kostní forma alkalické fosfatázy –  bALP a inzulinu podobný růstový faktor‑ 1 –  IGF‑1), chemiluminiscenční enzymová imunochemická reakce (parathormon –  PTH), kvantitativní sendvičová enzymatická imunoesej (osteopontin –  OPN, endostatin –  ES, makrofágový zánětlivý faktor‑ 1α/ β –  MIP‑1α/ β, angiogenin –  ANG a IL‑17). Statistické šetření bylo provedeno s pomocí Pearsonova χ² testu a U‑ testu dle Manna‑ Whitneye (p < 0,05). Výsledky: Analýza prokázala statisticky významné rozdíly sérových koncentrací mezi MGNV a symptomatickou formou MM (stadium 2– 3 vyhodnocené podle Durieho‑ Salmona –  D‑ S) v případě: albuminu, β₂- mikroglobulinu (β₂- M) a OPN (p = 0,0001 a < 0,0001); v případě stadia 2 u osteokalcinu (p = 0,006) a v případě stadia 3 u MIP‑1α (p = 0,0002). Při použití International Staging System (ISS) byly přítomny statisticky významné rozdíly mezi MGNV a všemi stadii MM (1– 3) v případě albuminu a OPN (p = 0,003, resp. 0,001, resp. 0,0001), oproti stadiím 2 a 3 v případě β₂- M a ES (p = 0,015 a resp. 0,00009), proti stadiu 2 v případě ANG (p = 0,014) a se stadiem 3 v případě MIP‑1α (p = 0,00001). Statisticky významná rozdílnost mezi MGNV a iniciální, asymptomatickou fází MM (stadium 1 dle D‑ S) bylo zjištěno jen v případě bALP (p = 0,01) a při použití ISS i v případě albuminu (p = 0,004) a OPN (p = 0,003). Postižení renální funkce (podstadium B dle D‑ S) se vyznačovalo oproti MGNV signifikantní elevací sérové hladiny β₂- M (p < 0,0001), OC (p = 0,011), IGF‑1 (p = 0,014), OPN (p = 0,003), ES (p = 0,0001), MIP‑1α (p = 0,0004) a ANG (p = 0,005), zatímco vůči podstadiu A pouze v případě albuminu (p < 0,0001), β₂- M (p < 0,0001) a OPN (p < 0,0001). Závěr: Z analyzovaných ukazatelů prokázal použitelný, i když nespecifický diskriminační potenciál mezi MGNV a všemi stadii MM dle ISS pouze albumin a OPN, se stadii 2 a 3 (ISS) β₂- M a ES, ostatní parametry se lišily pouze v případě stadia 2 (ANG), stadia 3 (MIP‑1α) a při použití stratifikace dle D‑ S oproti stadiu 1 (bALP), stadiu 2 (OC) a stadiu 3 (MIP‑1α).

Klíčová slova:
monoklonální gamapatie nejistého významu –  mnohočetný myelom –  klinická stadia –  bio­chemické ukazatele –  bio­logické působky –  osteopontin

Úvod

Přes pokroky, kterých bylo dosaženo v posledních několika letech u monoklonálních gamapatií (MG), zůstává v této problematice stále mnoho nejasného, což omezuje preciznost diagnostiky a zužuje prostor pro nové, účinnější možnosti léčby. I v koncepci „multistep“ etiopatogeneze mnohočetného myelomu (MM), zahrnující postupné změny od normální plazmatické buňky přes monoklonální gamapatii nejistého významu (MGNV) k plně rozvinuté, symptomatické formě MM [1,2] zůstává i nadále mnoho nevyjasněných otázek. I současná, International Myeloma Working Group (IMWG) diagnostická kritéria [3], používaná k odlišení MGNV od MM, nejsou dokonalá, neboť opomíjejí již všeobecně známé vnitřní bio­logické vlastnosti plazmatických buněk a faktory mikroprostředí kostní dřeně, a snad právě proto selhávají v řešení hraničních situací a stavů. Je tedy zcela legitimní snaha o nalezení ukazatelů, jež by zpřesnily možnosti odlišení MGNV od iniciální, asymptomatické fáze MM i včasný záchyt nástupu maligní transformace MGNV.

Náplní předloženého sdělení bylo doplnění předchozích vlastních studií, věnovaných problematice angiogenních cytokinů, markerů kostního obratu, cytoadhezivních molekul a dalších působků s intimním vztahem k patobio­logii MGNV a MM [4– 6] o ukazatele, které se vyznačující známou nebo potenciální rozdílností ve stupni exprese a/ nebo výši sérových hladin u MGNV a v různých fázích pokročilosti MM. Na rozdíl od předchozí studie [4] se nynější analýza zaměřila na vyhodnocení rozdílů sérových koncentrací osteokalcinu (OC), kostní formy alkalické fosfatázy (bALP), parathormonu (PTH), inzulinu podobnému růstovému faktoru  1 (IGF 1), osteopontinu (OPN), endostatinu (ES), zánětlivému makrofágovému faktoru  1α (MIP1α), MIP 1β, angiogeninu (ANG) a interleukinu  17 (IL 17), z klasických faktorů byla pro úplnost pohledu přiřazena analýza sérové hladiny albuminu a β₂- mikroglobulinu (β₂- M). S ohledem na řešení potenciální možnosti praktického využití byly vyhodnoceny hladiny analyzovaných působků u MGNV a v jednotlivých stadiích pokročilosti nemoci (stadium 1– 3) vyhodnocených podle Durieho  Salmona (D  S) [7] a International Staging System (ISS) [8].

Soubor nemocných a použité metody

Analyzovanou sestavu 138 nemocných tvořilo 62 jedinců s MGNV a 69 nemocných s MM splňujících IMWG diagnostická kritéria, nemocní s MM byli vyšetřeni při diagnóze před zahájením indukční terapie [3,9]. Z původní sestavy byla v rámci snahy o nezkreslenou analýzu vyřazena skupina 7 nemocných, u nichž nebylo možno s pomocí stávajících kritérií jednoznačné zařazení mezi jedince s MGNV v transformaci nebo již v symptomatické fázi MM (stadium 1). Věkový medián souboru MGNV byl 67 (31– 84) let, poměr muži/ žena (M/ Ž) byl 0,55, imunochemický typ IgG byl zastoupen v 74 % (n = 46), IgA ve 13 % (n = 8), IgM v 10 % (n = 6), IgD v 1,5 % (n = 1), biklonální v 1,5 % (n = 1), poměr κ/λ byl 1,3. V souboru nemocných s MM byl věkový medián 68 (32– 86) let a poměr M/ Ž byl 1,1, IgG imunochemický typ byl zastoupen v 60 % (n = 41), IgA v 17 % (n = 12), B  J typ v 17 % (n = 12), IgD v 1,5 % (n = 1), biklonální v 1,5 % (n = 1) a nesekreční ve 3 % (n = 2), poměr κ/λ  byl 2,2. Při hodnocení stupně pokročilosti nemoci s pomocí stážovacího systému dle D  S [7] bylo stadium 1 zastoupeno v 9 % (n = 6), stadium 2 ve 37 % (n = 26), stadium 3 v 54 % (n = 37), podstadium A v 84 % (n = 58) a podstadium B v 16 % (n = 11). Při použití ISS (8) bylo stadium 1 zastoupeno ve 36 % (n = 25), stadium 2 ve 33 % (n = 23) a stadium 3 ve 31 % (n = 21).

Hladina albuminu séra byla vyšetřena s pomocí gelové elektroforézy (35– 50 g/ l), k vyšetření hladiny β₂- M (0,1– 2,5 mg/ l) byla použita metoda Immulite 1000 Siemens Medical Solutions Diagnostic. K vyšetření sérové hladiny osteokalcinu (OC > 50 let 14– 46 ng/ ml) byl použit diagnostický kit Cobas 6000, Roche Diagnostic, hladina kostní formy alkalické fosfatázy byla vyšetřena s pomocí kvantitativní imunoradiometrie soupravou Immunotech, Beckman Coulter Company (bALP, muži 7,3– 15,9 μg/ l, ženy 7,8– 17,2 μg/ l), sérová hladina parat­hormonu (PTH, 10– 69 ng/ ml) byla stanovena oboustrannou chemiluminiscenční enzymovou imunochemickou reakcí na analyzátoru IMMULITE 2000, soupravou Siemens, k vyšetření hladiny inzulinu podobnému růstovému faktoru  1 (IGF 1, < 269 ng/ ml) bylo použito imunoradiometrické stanovení kitem Immunotech, Praha. Analýza sérové hladiny osteopontinu (OPN, 49,2– 175,0 ng/ ml), endostatinu (ES, 58– 232 ng/ ml), makrofágového zánětlivého faktoru  1α (MIF  1α, < 46,9 pg/ ml), MIP 1β (< 212 pg/ ml), angiogeninu (ANG, 196 000/437 000 pg/ ml) a interleukinu  17 (IL 17, < 31,2 pg/ ml) byla provedena technikou kvantitativní sendvičové enzymatické imunoeseje, kity Quantikine R§D Systems, Minneapolis, USA. Veškerá měření byla prováděna dle doporučení výrobce, duplikátním způsobem a byla reprodukovatelná. Ke statistickému vyhodnocení byl použit Pearsonův χ² test a neparametrický pořadový U  test dle Manna  Whitneye, případně Studentův dvouvýběrový t test na hranici významnosti p < 0,05.

Výsledky

Z analýzy vyplynulo, že jedinci s MGNV se vyznačují ve srovnání s nemocnými s čerstvě stanovenou diagnózou MM tendencí k normálním, případně i sníženým hodnotám vyšetřených parametrů. Frekvence výskytu odchylných, vesměs zvýšených hodnot vůči normálnímu rozmezí v souboru 62 jedinců s MGNV a 69 jedinců s MM vyplývá z grafu 1. Jak patrno, žádný z analyzovaných ukazatelů neumožňuje z hlediska pouhé přítomnosti abnormální hodnoty odlišení mezi MGNV a iniciální/ asymptomatickou fází MM (stadium 1 dle D  S), a to ani u tak široce používaných ukazatelů, jakými jsou albumin a β₂- M, na nichž je založen ISS stážovací systém [8]. Hlubší analýza sérových hladin působků majících vztah k intenzitě kostního obratu ukázala, že jak u MGNV, tak i u MM se vyskytují situace se subnormální, ale i zvýšenou hladinou markerů osteoformace (OC a bALP). Ukázalo se, že v případě MGNV mělo 28 % jedinců hodnotu OC pod dolní hranicí normálního rozmezí, zatímco žádný pacient s MM ve stadiu 1 (D  S), avšak 19 % nemocných se symptomatickou formou MM (ve 2. stadiu 15 % a ve 3. stadiu 25 %). Zvýšenou hodnotu OC mělo jen 6 % jedinců s MGNV, ale 17 % s MM (ve stadiu 1 žádný nemocný, ve stadiu 2 25 % a ve stadiu 3 13 % nemocných). Méně rozdílně se chovala hladina bALP, kdy subnormální sérovou hodnotu mělo u MGNV 28 % jedinců, zatímco u MM 39 %, zatímco výskyt zvýšené hodnoty se u MGNV a MM prakticky nelišil (11 % vs 13 %). Je zajímavé, že zvýšení bALP nebylo zaznamenáno u žádného pacienta v 1. stadiu MM (D  S), zatímco sníženou hodnotu měli 4 z 5 nemocných. Sérové hladiny PTH byly zvýšeny obdobně u MGNV a u MM (28 % a 31,5 %), snížení hladin pod normální rozmezí bylo častěji zaznamenáno u MM nežli u MGNV (10,5 % vs 2 %). V souboru MGNV byla zaznamenána snížená hladina OSP u 35 % jedinců, zatímco elevace pouze ve 3 %, což je výrazně odlišné od nemocných s MM, u nichž bylo snížení zaznamenáno jen u 10,5 % (ve stadiu 1 ve 34 %, ve stadiu 2 u 17 % a ve stadiu 3 v 15 %), zatímco zvýšení sérových hladin u MM ve 31,5 % (stadium 1 v 16 %, stadium 2 ve 25 % a stadium 3 ve 49 %). Při hodnocení působků majících přednostní vztah k angiogenezi byl v souboru jedinců s MGNV zaznamenán nižší výskyt zvýšené hladiny ES (13 %) nežli v souboru s MM (30 %; stadium 1 dle D  S ve 20 %, stadium 2 ve 21 % a stadium 3 v 37,5 %). Sérová hladina ANG byla zvýšená u MGNV u 20 % jedinců, snížená ve 4 %, zatímco u MM byly zjištěny zvýšené hodnoty u 42 % pacientů (ve stadiu 1 dle D  S u 40 %, ve stadiu 2 u 39 % a ve stadiu 3 u 49 %). Jak vyplývá z grafu 1, frekvence zvýšených sérových hladin IGF 1, MIP 1α, MIP 1β a IL 17 byla vesměs nízká a v souborech MGNV a MM se podstatně nelišila.

Při statistické analýze, zaměřené na srovnání naměřených hodnot u MGNV s hodnotami u MM, byly zjištěny pouze u ně­kte­rých parametrů narůstající rozdíly související se stupněm pokročilosti nemoci (stadium 1– 3). Při použití klinického stážovacího systému dle D  S [7] byl zjištěn statisticky významný rozdíl mezi MGNV a stadia 1 pouze v případě hladiny bALP, ostatní parametry se v této asymptomatické fázi MM od MGNV neodlišovaly. Při srovnání MGNV se stadiem 2 byl zjištěn statisticky vysoce významný rozdíl v případě sérové koncentrace albuminu, β₂- M, OC a OPN, při porovnání se stadiem 3s hladinami albuminu, β₂- M, OPN a MIP 1α, zatímco v případě sérových koncentrací PTH, IGF 1, ES, MIP 1β, ANG a IL 17 nebyly jakékoliv rozdíly zjištěny (tab. 1). Při porovnání podstadia A (bez poruchy renální funkce) a B (hladina S- kreatininu > 170 μmol/ l) oproti MGNV bylo zjištěno, že nemocní v podstadiu A se statisticky významně lišily pouze nižší hodnotou albuminu séra a vyšší hodnotou β₂- M a OPN (tab. 2). Podstatně častější rozdílnost byla zaznamenána u podstadia B,kde statisticky významné rozdíly byly zjištěny navíc i v případě sérových hladin OC, IGF 1, ES, MIP 1α a ANG, zatímco v případě albuminu, bALP, PTH, MIP 1β a IL 17 nebyla významná odlišnost vyjádřena (tab. 2). Nutno vzít ale v potaz, že početní zastoupení nemocných ve stadiu 1 (D  S) bylo velmi nízké, a výsledky statistické analýzy je nutno proto přijímat značně obezřetně.

Analýza vycházející z prognostické stratifikace MM podle ISS [8] prokázala při srovnání MGNV se stadiem 1 MM statisticky významně nižší hladinu albuminu v séru a vyšší hladinu pouze v případě OPN. Ve stadiu 2 byla zaznamenána rozdílnost vedle odchylné hladiny albuminu, β₂- M a OPN i v případě ES a ANG. Při porovnání MGNV se stadiem 3 MM byla zaznamenána rozdílnost sérových koncentrací v případě albuminu, β₂- M, OPN, ES a MIP 1α (tab. 3). Žádný statisticky významný rozdíl nebyl zjištěn při porovnání MGNV se stadii 1– 3 MM (ISS) v případě sérových hladin OC, bALP, PTH, IGF 1, MIP 1β a IL 17.

Podrobnější rozbor ukázal, že v případě sérové hladiny OC > 49,9 ng/ ml, OPN > 288 ng/ ml a ES > 328 ng/ ml je nutno pomýšlet s vysokou naléhavostí na MM, neboť hodnoty nad tuto mez nebyly v námi analyzovaném souboru s MGNV zachyceny (tab. 1– 3). Uvedený závěr se ale týká poměrně nízkého počtu jedinců s MM (v případě OC 13 %, u OPN 16 % a u ES 11 % nemocných s MM).

Diskuze

Je všeobecně známo, že pro spolehlivé odlišení MGNV od MM není v klinické praxi k dispozici stále žádný, jednoznačně platný a všeobecně dostupný ukazatel, který by oba typy MG s tak diametrálně odlišnou prognózou a přístupem k léčbě spolehlivě odlišil [6,10]. Zatímco MGNV je pouze potenciálně maligní, diskrétní klonální expanze plazmocelulárních elementů vyznačující se stabilitou a klinicky bezpříznakovým průběhem nevyžadujícím aktivní léčbu, je MM i v současnosti vesměs progresivním, stále nevyléčitelným onemocnění, a to i přes významné pokroky v transplantační léčbě a zejména v moderní chemo  imunoterapii. V patobio­logii MM hraje stěžejní roli nukleární faktor κB (NF  κB) podílející se na výsledném poměru osteoklastické kostní resorpce a osteoblastické kostní formace i intenzitě neoangiogeneze, tj. procesů, které mají dalekosáhlý dopad na průběh, klinický obraz a prognózu MM [11,12]. Mezi používané, i když nepříliš spolehlivé předpovědní faktory přechodu MGNV v MM patří vedle vysoké hodnoty M  proteinu v séru a/ nebo v moči snížená hladina normálních imunoglobulinů, pokles hodnoty hemoglobinu, nárůst počtu a morfologické atypie plazmocytů v kostní dřeni (KD), výskyt cirkulujících monoklonálních plazmocytů v obvodové krvi, abnormální imunofenotyp plazmocytů, zvýšená proliferační, případně i snížená apoptotická aktivita plazmocytů, nález vysoce patologického poměru volných lehkých řetězců κ/λ v séru a zejména známky zvýšené kostní remodelace dokumentované vzestupem ukazatelů kostního obratu nebo patologickým nálezem při použití celotělové formy MRI a/ nebo ¹⁸F- FDG- PET/ CT [10]. Molekulární mechanizmy, uplatňující se v transformaci MGNV v MM zůstávají stále přes dílčí pokroky do značné míry neobjasněny, takže klinická praxe je i v současnosti v podstatě odkázána na dlouhodobé monitorování změny klinicko laboratorního obrazu [1,9,10].

Přestože sérové hodnoty albuminu a β₂- M jsou u MM vysoce významnými faktory, které byly na podkladě multivariační analýzy více než 11tisícového souboru nemocných s MM vybrány za ukazatele, na nichž je založen v současnosti již nejpoužívanější, ISS stážovací systém u MM, vypovídají především o stupni pokročilosti a prognóze MM nežli o rozdílnosti MGNV a MM [3]. I z naší analýzy vyznělo, že jak z hlediska výskytu patologických hodnot, tak i na podkladě výsledku statistické analýzy nepřispívá hodnocení sérových hladin albuminu a β₂- M k použitelnému rozlišení MGNV od asymptomatické fáze (stadium 1 dle D- S) MM.

Vyšetřování sérových hladin OC u MM se doposud setkalo s rozporuplnými výsledky. Je známo, že snížení funkce osteoblastů (OBL) je u MM ve srovnání s MGNV a zdravými jedinci provázena poklesem OC [13,14], takže hladina OC je považována za předpovědní faktor kostního obratu [15]. Hladina OC koreluje s histomorfometricky prokázaným paralelním zvýšením resorpčních a osteoidních povrchů u MM ve stadiu 1 [16]. Bylo rovněž zjištěno, že hodnoty OC jsou ve stadiích 1 a 2 oproti stadiu 3 zvýšené [17] a koncentrace OC korelují s postižením skeletu citlivěji nežli vyšetření konvenční radiografií [18]. Nebyl shledán význam OC pro hodnocení progrese a výskytu kostních zlomenin [13,14], zatímco však jiné studie v rámci nárůstu osteolytických lézí vzestup koncentrace OC v séru zaznamenaly [19]. Bylo zjištěno, že nemocní s osteoporózou mají obdobný medián hladiny OC jako jedinci s MGNV a MM [20]. Osteokalcin není vzhledem k pozdnímu snížení kostní novotvorby u MM vhodným markerem v odlišení MM od MGNV, neboť hodnoty OC v séru jsou u pacientů ve stadiu 1 MM obdobné jako u MGNV [21]. I z naší studie vyplynulo, že v hladinách OC nebyl mezi MGNV a stadiem 1 (D  S) statisticky významný rozdíl, byla však odhalena statisticky významná rozdílnost oproti stadiu 2 a podstadiu B (D  S). Zajímavým nálezem je častější snížení hodnoty OC jedinců s MGNV oproti nemocných s MM (28 % vs 19 %). I námi ověřená nespolehlivost praktického využívání OC u MM zřejmě vyplývá z ložiskového charakteru MM, kdy normální novotvorba kosti může pokračovat v nepostižených oblastech a/ nebo skutečností, že případné mikrofraktury skeletu jsou doprovázeny lokální stimulací osteoblastické funkce [22]. Osteokalcin produkují nejen OBL, ale je uvolňován rovněž při mineralizaci kostní matrix, avšak jeho sérová hodnota je zvýšena i při poruše funkce ledvin, a to již při nevelkém snížení glomerulární filtrace, což bylo patrno i v našem souboru [22]. Všeobecně je ale přijímán názor, že OC je u MM s pokročilou formou nemoci snížen v důsledku potlačení kostní novotvorby, zatímco v iniciální fázi nemoci s mírným nebo chybějícím postižením skeletu jsou hodnoty OC normální, nebo dokonce zvýšeny [14,19,20,23,24].

Hladina bALP je u MM často snížena s výjimkou hojení kosti v důsledku kostních fraktur, neboť jeho hladina je výrazem osteoblastické kostní formace [24]. Stejně jako OC, tak i bALP není vhodným ukazatelem pro odlišování MGNV od MM, poněvadž k jeho alteraci dochází u MM pozdně, a to formou poklesu v rámci pokročilé myelomové kostní nemoci (MKN) [21]. Hladina bALP byla shledána u MGNV vyšší nežli u MM [13], bALP rovněž významně koreloval s přítomností kostní bolesti, rozsahem osteolytických lézí a zlomeninami skeletu [14]. V souladu se závěry ojedinělých předchozích studií byl i v naší analýze zaznamenán statisticky významný rozdíl ve stupni poklesu hladiny bALP ve stadiu 1 MM oproti MGNV, kdy medián jeho hodnoty byl prakticky poloviční (4,4 ng/ ml vs 9,9 ng/ m), což ale platilo pouze pro stážování dle D  S, nikoliv ISS. V souladu s předchozími studiemi jsme rovněž zaznamenali častější pokles bALP u MM nežli u MGNV [13,22], což naznačuje určitý potenciál bALP v odlišení MGNV od velmi časné, asymptomatické fáze MM [22]. Poměrně častý vzestup bALP v naší studii, a to zejména ve stadiích 2 a 3 (dle D  S), lze vysvětlit možným zvýšením osteoblastické aktivity v rámci hojení kostních fraktur v rámci pokročilé MKN. Analýze chování sérových hladin PTH nebyla u MM věnována soustavnější pozornost. Je ale známo, že v případě hyperkalcemie dochází k poklesu hodnoty PTH, k jeho vzestupu naopak v případě hypokalcemie navozené terapií bisfosfonáty [25]. V případě dlouhodobé terapie bisfosfonáty dochází k lehkému vzestupu hladin PTH. V naší studii byl medián sérové hladiny PTH v iniciální fázi MM (ve stadiu 1 dle D  S i ISS) nevýznamně vyšší nežli ve stadiu 2 a stadiu 3a velmi obdobný hladinám u MGNV, a to i z hlediska frekvence výskytu zvýšené i snížené hodnoty. Vyšetřování sérové hladiny PTH tedy nemá kromě speciálních situací, např. podezření na současnou primární hyperparatyreózu, u MM význam.

IGF 1 je parakrinní růstový faktor myelomových buněk indukující jejich proliferaci, inhibici apoptózy, invazi a migraci, případně i lékovou rezistenci, podílí se i na ovlivnění afinity myelomových plazmocytů ke kostní dřeni [26,27]. Interakce IGF 1/ IGF 1R hraje důležitou úlohu v patogenezi MM a účinek IGF 1 je stejně jako účinek IL 6 zprostředkován aktivací ras  MAPK a P13K/ Akt  1 signální kaskády se setrvalou aktivací NF  κB [27]. Imunohistochemická analýza prokázala aktivaci AKT  kinázy v plazmatických buňkách u MM, nikoliv u MGNV [28]. V předchozí studii bylo prokázáno významné snížení IGF 1 v séru u MM a MGNV oproti zdravým jedincům, přičemž nemocní s MM měli podstatně nižší hladiny nežli jedinci s MGNV [29]. Do tohoto pilotního zjištění zapadá i námi pozorované pouze sporadické zvýšení sérové hladiny IGF 1 u MGNV a u MM i chybějící rozdílnost úrovně sérových hladin v jednotlivých stadiích pokročilosti MM. Nutno ale upozornit na vyšší, vůči nálezu u MGNV statisticky odlišnou hladinu IGF 1 u nemocných v podstadiu B (s poruchou funkce ledvin) patrné v našem souboru. Je zřejmé, že vyšetřování sérových hladin IGF 1 není pro klinickou praxi přínosné, což je vysvětlitelné známým nesouladem mezi sérovou hladinou a stupněm exprese na myelomových plazmocytech u řady působků.

Osteopontin, tento fosfoglykoprotein chovající se jako multifunkční vytokán, se vyznačuje širokou škálou bio­logických účinků, včetně zásahu do angiogeneze, imunitních funkcí, kostní homeostázy a progrese MM. Je exprimován a secernován myelomovými buňkami, osteoklasty, osteoblasty a dalšími elementy kostní matrix i mikroprostředí KD [30,31], přičemž sekrece OPN koreluje s intenzitou exprese maf transkripčních faktorů [30]. Uplatňuje se v procesu adheze, chemotaxe, migrace, růstu a inhibice apoptózy nádorových buněk, byla popsána i jeho úloha v regulaci signálních buněčných drah v rámci neoplastické transformace a jako mediátoru nádorové progrese [32]. OPN je zapojen do procesu osteoklastogeneze a osteoklastické resorpce, podílí se na zvýšené expresi MMP  9 (matrixové metaloproteinázy  9) v neoplastických elementech, které mají úzký vztah k nádorové progresi [32]. Při analýze angiogenního potenciálu myelomových buněk byl zjištěn vztah exprese OPN k aktivaci NF  κB [33], OPN spolu s IL 6 hraje stěžejní úlohu v růstu a přežití myelomových buněk a v rozvoji MKN [30]. Imunocytochemická analýza prokázala výraznou pozitivitu OPN v plazmocytech u rozvinuté formy MM, nikoliv ale u MGNV. Kultury plazmocytů nemocných s pokročilou formou MM produkovaly více OPN nežli kultury plazmocytů od nemocných s doutnající formou MM nebo MGNV a hladina OPN v séru byla u pacientů s MM rovněž významně vyšší nežli u jedinců s MGNV [34,35]. Zvýšené hladiny OPN v séru byly zjištěny v případě přechodu MGNV v MM [34], ovšem vysoké titry OPN ne vždy korelují se známkami maligní progrese a tíží MKN, takže prognostický potenciál tohoto ukazatele musí být vždy posuzován ve spojení s molekulární maf subtypizací, jež představuje jednotku s odlišnou bio­logií [30]. Při srovnání sérových hladin OPN mezi MGNV a různými stadii pokročilosti nemoci vyzněly naše výsledky odlišně při použití D  S a ISS stážovacího systému. V případě D  S stratifikace byla zjištěna statisticky významná odlišnost mezi MGNV a stadii 2, 3, substadii A a B, avšak na rozdíl od zkušenosti Saekiho [34] nikoliv vůči iniciální/ asymptomatické fázi MM (stadium 1), což může být ale podmíněno nízkým počtem vyšetřených nemocných. Při použití stážovacího systému dle ISS byl ovšem zjištěn statisticky významný rozdíl mezi MGNV a všemi třemi stadii MM (stadia 1– 3). Za přínosné považujeme rovněž zjištění, že jedinci s MGNV měly zvýšeny hodnoty OPN pouze ve 3 % oproti 31,5 % u nemocných s MM, a s navyšující se hodnotou mediánu OPN s pokročilostí MM, tj. od stadia 1– 3 (dle D  S i ISS) a významně vyšší hodnoty u nemocných s poruchou renální funkce, tj. v podstadiu B. Naopak hodnoty pod dolní hranicí normálního rozmezí byly zjištěny v souboru s MGNV u 1/ 3 jedinců, zatímco v souboru s MM pouze u 1/ 10 nemocných. Podstatná odlišnost sérových hladin OPN u MGNV přináší navíc v případě výrazně zvýšené hodnoty (v naší studii > 288 ng/ ml u 16 % pacientů s MM) i další diferenciálně diagnostický potenciál.

Mezi nálezy odlišující MGNV od MM patří i hustota kapilární sítě v KD, neboť MGNV je považována za stav „preangiogenní“, zatímco MM za stav „vaskulární“, v němž stupeň angiogeneze je kritickým mechanizmem v patogenezi MM [11,36]. Endostatin (ES), C  koncový proteolytický fragment kolagenu XVIII, je specifický endogenní inhibitor angiogeneze nacházející se v bazální zóně membrány cév, který vstupuje do interakce s různými molekulami endoteliálních buněk, což vede v důsledku inhibice anti apoptotických proteinů Bcl  2 a Bcl  XI k jejich apoptóze. ES je vytvářen endotelovými buňkami a s ostatními proangiogenními a antiangiogenními faktory se podílí na udržování angiogenní rovnováhy s přiměřenou tvorbou cévních struktur [37,38]. ES inhibuje novotvorbu cév, což vede spolu se stabilizací cévní stěny k útlumu nádorového růstu, je proto považován za negativní bio­marker nádorové progrese [38]. Úloha ES u MM je doposud nejasná, neboť této problematice byla věnována doposud jen nedostatečná pozornost [12]. I když hodnoty ES v séru byly u MGNV poněkud nižší nežli ve 2. a 3. stadiu MM (dle D  S i dle ISS), vyznělo srovnání statisticky nevýznamně, přičemž medián ES ve stadiu 1 (asymptomatická fáze MM) byl s hodnotou u MGNV téměř totožný. Frekvence výskytu zvýšených hodnot ES byla u MGNV podstatně nižší nežli u MM, přičemž u 1/ 10 nemocných s MM převyšovala naměřená hodnota ES nejvyšší hodnotu zjištěnou u MGNV (328,4 ng/ ml). Rozbor naší sestavy prokázal vysoce význačně zvýšenou hodnotu mediánu ES u jedinců s MGNV oproti nemocným s myelomem podmíněnou poruchou renální funkce (podstadium B dle D  S).

MIP 1α a MIP 1β jsou pluripotentní chemokiny mající významnou roli v bio­logii, patogenezi a klinickém obraze MM [24,39]. Uplatňují se v diferenciaci OKL z preosteoklastických buněk stromatu, a tím i na osteoklastické resorpci a rozvoji MKN, podílejí se i na útlumu syntézy imunoglobulinů. Zatímco MIP 1α je potentní inhibitor erytropoézy, MIP 1β indukuje apoptózu pre B buněk [40,41]. Biologické účinky MIP 1α jsou regulovány prostřednictvím FGFR3 (receptor č. 3 fibroblastového růstového faktoru) a spojeny s aktivací RAS  MAPK signální dráhy, což mj. ovlivňuje proliferaci a přežití myelomových buněk, rychlost nádorového růstu a celkové přežívání nemocných [42]. Vysoká exprese MIP 1α v myelomových buňkách byla prokázána u 59 %, střední u 13 % a chybějící u 28 % nemocných s MM, a to s dobrou korelací k hladině v séru i k denzitě kapilární sítě v KD [43]. Chemokiny MIP 1α i MIP 1β mají úzký vztah k tíži MKN (24,40,41), projevující se mj. i vysokou sekrecí MIP 1α a MIP 1β. V určitém souladu se závěry Terpose [44], který zaznamenal chybějící expresi MIP 1α v plazmocytech u MGNV vyznělo i naše zjištění, že u žádného jedince s MGNV nebyla zjištěna zvýšená hodnota v séru a prokázána statisticky významně nižší hodnota MIP 1α u MGNV nežli ve stadiu 3 (dle D  S i dle ISS), nikoliv ale ve stadiích 1 a 2. Významně odlišná, prakticky 2krát zvýšená byla rovněž hladina mediánu MIP 1α u nemocných s projevy myelomové renální choroby (podstadium B dle D  S). Zcela nepřínosně ale vyznělo hodnocení sérové hladiny MIP 1β, jehož hladiny se u MGNV a v jednotlivých stadiích i podstadiích MM nelišily, a zvýšené hodnoty byly zaznamenány pouze u velmi nízkého počtu nemocných.

Angiogenin, tento neglykosylovaný polypeptid patřící do skupiny ribonukleáz s angiogenní aktivitou, se uplatňuje v procesu nádorového růstu, hojení kostí i u dalších patologických stavů, je exprimován buňkami endotelu cév, fibroblasty, lymfocyty i ně­kte­rými nádorovými buňkami. V procesu angiogeneze se prostřednictvím stimulace aktivátoru tkáňového plazminogenu s tvorbou plazminu podílí na degradaci membránového lamininu a fibronektinu, což vede k narušení bazální membrány cév s následnou migrací endoteliálních buněk v průběhu neovaskularizace. U primární makroglobulinemie koreluje výše ANG v séru s klinickým obrazem. Prakticky jediné předchozí sdělení věnované poměrům u MM prokázalo jeho zvýšenou hladinu (spolu s vaskulárním endotelovým růstovým faktorem a angiopoetinem) u nemocných s MM s významným poklesem po absolvování léčby [44]. V námi analyzovaném souboru byla sérová hladina ANG zvýšena u 42 % nemocných s MM, avšak i u 20 % jedinců s MGNV, přičemž mediány a rozmezí naměřených hodnot byly velmi blízké a lišily se pouze při srovnání MGNV se stadiem 2 (dle ISS) a podskupinou nemocných s poruchou renální funkce (podstadium B dle D  S).

Interleukin 17, tento disulfidický homodimer vytvářený aktivovanými paměťovými T buňkami, je považován za prostředníka mezi imunitním a hematopoetickým systémem. Stimuluje tvorbu IL 6, ICAM a dalších působků v elementech mikroprostředí KD, přičemž produkce IL 17 v KD nemocných s MM T pomahačskými lymfocyty je zprostředkována dendritickými buňkami. Kostní dřeň nemocných s MM obsahuje na rozdíl od jedinců s MGNV vysoký podíl Th  17- 1 buněk s koexpresí IL 17 a IFN  γ [45], vstupujících do interakce s apoptotickými myelomovými elementy. Přes tyto vztahy naše analýza neodhalila žádné zřejmé odlišnosti v sérových hladinách u MGNV a MM, a to jak z hlediska frekvence zvýšených hodnot, tak i z hlediska sérových koncentrací u obou srovnávaných stavů a mezi jednotlivými stadii pokročilosti MM.

Závěr

Z provedené analýzy vyplývá, že rozšíření IMWG kritérií o ukazatele, které by obohatily diagnostiku MGNV a iniciální stadia MM, zůstává i nadále problém, a to zřejmě i proto, že mezi MGNV a iniciální fází MM existuje plynulá linie přechodných stavů s různou mírou neoplastické transformační proměny. Z 10 analyzovaných ukazatelů neprokázal žádný s výjimkou osteopontinu klinicky použitelnou míru rozdílnosti, použitelnou v diferenciální diagnostice mezi MGNV a asymptomatickou formou MM. Nadějný diskriminační potenciál prokázaly výsledky hodnocení osteopontinu s významně zvýšenými hodnotami u 31,5 % nemocných s MM oproti 3 % s MGNV, a to ve všech stadiích MM dle ISS, nikoliv ale mezi MGNV a stadiem 1 dle D  S. K diferenciaci přispívá i výskyt subnormálních hodnot OPN u 35 % jedinců s MGNV oproti 10 % pacientů s MM. Jistým přínosem pro odlišení MGNV od MM je rovněž i přítomnost vysokých hodnot OC (> 49,9 ng/ ml), OPN (> 288 ng/ ml) a ES (> 328,4 ng/ ml), tj. hodnot převyšujících nejvyšší naměřenou sérovou koncentraci v souboru s MGNV, uvedený nález se ovšem týká pouze úzkého, asi 10% počtu nemocných. Za přínosné nutno považovat potvrzení úlohy OPN, MIP 1α a ES v patobio­logii MM, jejichž sérové hodnoty byly v pokročilých stadiích MM významně vyšší nežli u MGNV a v iniciální, asymptomatické fázi MM. Nelze pominout ani zjištění, že u nemocných s projevy renálního postižení s retencí dusíkatých látek (podstadium B) byly význačně vyšší sérové koncentrace IGF 1, OPN, ES, MIP 1α a ANG. Ze studie tedy vyplynulo, že analýza poměrně snadno analyticky dostupných sérových ukazatelů není z hlediska diskriminačního potenciálu mezi MGNV a iniciální fází MM příliš perspektivní, neboť jde o ukazatele odvozené, nevystihující zásadní rozdíly mezi MGNV a MM. Budoucí studie se musí orientovat na analýzy založené na použití molekulárně bio­logických metod, techniky genové expresní analýzy či proteomiky.

Podpora IGA MZ ČR NR 9500, NR 9489, VVZ 6198959205.

prof. MU Dr. Vlastimil Ščudla, CSc.
www.fnol.cz
e-mail: vlastimil.scudla@fnol.cz

Doručeno do redakce: 30. 4. 2010