Sledování dynamiky tvorby protilátek proti viru SARS-CoV-2 po aplikaci mRNA vakcíny BNT162b2

ÚVOD

Onemocnění covidem-19 (Coronavirus Disease 2019) způsobené virem SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) je nadále považováno za globální i individuální zdravotní hrozbu. Podle současného vědeckého poznání nastala introdukce viru z přirozeného zvířecího hostitele do lidské populace v roce 2019 a první humánní případy byly hlášeny v prosinci 2019 v čínském městě Wuhan.

Velmi rychle došlo k rozšíření původce do dalších zemí a na všechny trvale obydlené světadíly. Vyústěním byla pandemie infekce, vyhlášená WHO 11. 3. 2020, která trvala do začátku roku 2023. Do konce roku 2021 bylo v ČR zaznamenáno více než 2,5 milionů případů a 36 000 úmrtí [1, 2], celosvětově se pak odhaduje více než 287 milionů případů a 14 830 000 nadměrných úmrtí v souvislosti s onemocněním covidem-19 [3]. Rychlé šíření v populaci umožňuje kapénkový přenos a masivní přítomnost hlavního receptoru nutného pro vstup viru do buňky (ACE2, angiotenzin konvertující enzym 2) na povrchu buněk sliznice dýchacích cest.

Zásadním problémem je vysoká přenosnost infekce (5 % u blízkých kontaktů, 0,9 % ve zdravotnických zařízeních) [4], výrazná nemocnost v dosud naivní populaci, významné riziko pro ošetřující personál [5] a potvrzený výskyt závažných postinfekčních následků jak u dospělých pacientů se základními komorbiditami (např. diabetes, imunosuprese, kardiovaskulární onemocnění), tak i u malých dětí, u kterých se může rozvinout multisystémový zánětlivý syndrom (MIS-C) [6].

Od počátku pandemie byla jak diagnostice, tak i prevenci a léčbě, věnována intenzivní pozornost zdravotnické i vědecké komunity. Velmi rychle byla vypracována doporučení preventivních opatření, která účinně brání mezilidskému přenosu. Bohužel se v celém světě i v České republice ukázalo, že v této oblasti je kritickým limitem zejména v dlouhodobé funkčnosti nutný podíl lidské spolupráce. Prakticky ihned byly zavedeny protokoly přímého průkazu viru metodou PCR (polymerázové řetězové reakce) a vzápětí se jejich komerční verze staly poměrně dobře dostupné. Následovaly další metody přímého průkazu a již během 1. čtvrtletí roku 2020 se detekce imunitní odpovědi na probíhající a proběhlou infekci přesunula z experimentální roviny do formátu komerčních, dobře validovaných a standardizovaných testů. Imunitní odpověď lze zkoumat prostřednictvím protilátek nebo buněčné imunity. Vzhledem k dosud neexistujícímu kauzálnímu léku (v době začátku pandemie) a kritické morbiditě a mortalitě byl ihned zahájen výzkum možnosti očkování jako primární prevence. Výzkum využívající předchozí zkušenosti s konstrukcí vakcín i zkušenosti z infekcí jinými druhy koronavirů (SARS, MERS, zvířecí onemocnění) vedl k urychlenému vytvoření a emergentnímu schválení očkovacích látek včetně mRNA vakcín. Je odhadováno, že očkování v období od prosince 2020 do března 2023 zabránilo v Evropském regionu WHO celkem 1,6 milionu úmrtí [7].

V návaznosti na tyto snahy jsme zorganizovali neintervenční poregistrační kohortovou observační studii zaměřenou na sledování dynamiky tvorby protilátek IgG proti S proteinu SARS-CoV-2 u probandů vakcinovaných dvěma dávkami mRNA vakcíny Pfizer-BioNTech BNT162b2 (Comirnaty), kteří neměli či měli přirozenou infekci v anamnéze. Podle prvotní klinické studie účinnost vakcíny proti onemocnění covidem-19 byla 91,3 % po dobu 6 měsíců sledování u účastníků bez známek předchozího onemocnění. Účinnost vakcíny byla v rozmezí 86 až 100 % u populací vymezených různým věkem, pohlavím, rasou, etnickou skupinou a rizikovými faktory pro vznik onemocnění [8].

Primárním cílem studie bylo sledování dynamiky hladin protilátek po aplikaci dávek vakcíny až do 12 měsíců po aplikaci 2. dávky a stanovení podílu očkovaných, u kterých proběhla sérokonverze do měsíce po aplikaci 2. dávky vakcíny dle schváleného aplikačního schématu. Dále byl zjišťován podíl očkovaných, kteří onemocněli covidem-19 do třinácti měsíců od aplikace 2. dávky vakcíny a došlo u nich tedy k selhání vakcíny.

METODIKA

Vstup do studie předpokládal laboratorní vyšetření protilátek IgG proti S proteinu SARS-CoV-2 před zahájením očkování. Současně s odběrem byla zjišťována anamnestická data o prožití covidu-19, PCR vyšetření, a o výskytu příznaků, které by mohly být indikátorem proběhlé infekce SARS-CoV-2. Na podkladě negativního výsledku vyšetření protilátek a negativní anamnézy byl vytvořen soubor pro sledování dynamiky tvorby protilátek po očkování u imunologicky naivních osob. Tuto kohortu tvořili dobrovolníci, převážně zaměstnanci Státního zdravotního ústavu (SZÚ). V průběhu studie proběhla v očkovacím centru SZÚ vakcinace dvěma dávkami registrované vakcíny mRNA BNT162b2 (Comirnaty). Většina účastníků byla, na základě celosvětově nepříznivého epidemického vývoje, v průběhu studie očkována i třetí dávkou vakcíny. Vakcinace třetí dávkou nebyla v plánu studie a byla provedena individuálně na vlastní žádost účastníků.

Podle protokolu studie byly v průběhu let 2021–2022 odebírány vzorky venózní krve před první dávkou vakcíny (1. odběr), dva až tři týdny po první dávce (2. odběr, nebyl podmínkou účasti ve studii), měsíc po druhé dávce (3. odběr) a tři až čtyři měsíce po druhé dávce (4. odběr), dále půl roku a jeden rok po druhé dávce vakcíny (5. a 6. odběr). Schéma průběhu je znázorněno na obrázku 1.

Doplňkovou kohortu osob po infekci tvořili dobrovolníci s pozitivním nálezem protilátek proti S proteinu SARS-CoV-2 v 1. odběru či s laboratorně, klinicky nebo epidemiologicky potvrzeným onemocněním covidem-19 v průběhu roku 2020. Část tohoto souboru byla posléze očkována a u ní byla rovněž sledována dynamika vývoje protilátek.

Účastníci studie vyplňovali měsíčně elektronicky dotazníky s hlášením symptomů respiračních infektů se zaměřením na průkaz covidu-19 signalizující selhání vakcíny (viz obr. 1). Laboratorně potvrzené onemocnění covidem-19 bylo verifikováno z údajů nahlášených do ISIN (Informační systém infekčních nemocí).

Studie byla schválena Etickou komisí Státního zdravotního ústavu. Všichni účastníci vyjádřili souhlas s účastí ve studii.

Metody stanovení protilátek

Kvantitativní stanovení protilátek IgG proti S proteinu SARS-CoV-2 v séru bylo prováděno testem SARS-CoV-2 IgG II Quant, Architect, Abbott v přístroji Architect i1000 dle návodu výrobce. Výsledek stanovení je vyjadřován v arbitrárních jednotkách AU/ml. Hodnoty nižší než 50 AU/ml jsou podle instrukcí výrobce interpretovány jako negativní, hodnoty 50 AU/ml a vyšší jako pozitivní. Měrný rozsah vyšetření je do 40 000 AU na ml, vzorky s hodnotou větší než 40 000 AU/ml je třeba znova vyšetřit po naředění dvakrát, případně ojediněle i čtyřikrát pro získání hodnoty v měrném rozsahu. V těchto případech je výsledkem zjištěná hodnota vynásobená faktorem ředění. Každý běh testu obsahoval vyšetření pozitivních a negativních kontrol. Validita výsledků je určena výrobcem testu.

Statistické metody

Spojité veličiny jsou charakterizovány pomocí mediánů a geometrických průměrů. Kategoriální veličiny jsou prezentovány pomocí absolutních četností a procent.

Obr. 1. Schéma aplikace vakcín, odběrů krve na stanovení protilátek proti S proteinu SARS-CoV-2 a dotazníků o prodělaném respiračním onemocnění
Figure 1. Schematic of the application of vaccines, blood sampling for the determination of antibodies against the S protein of SARS-CoV-2 and questionnaires about the respiratory disease experienced

VÝSLEDKY

Do studie hodnocení protilátek po očkování bylo přijato 166 dobrovolníků, kteří při vstupu do studie před první dávkou očkování (1. odběr) neměli protilátky proti S proteinu SARS-CoV-2 a neprodělali onemocnění covid-19. Ve studii bylo 48 (28,9 %) mužů a 118 (71,1 %) žen (tabulka 1). Věk účastníků se pohyboval od 22 do 84 let, medián byl celkově 52 let, u mužů 48 a u žen 53 let.

Tabulka 1. Popisné charakteristiky základního souboru imunologicky naivních účastníků studie (n = 166)
Table 1. Descriptive characteristics of immunologically naïve study participants (n = 166)

n – počet osob
n – number of persons

První odběr krve byl proveden před očkováním, druhý odběr byl v rozmezí 11 až 24 dnů po první dávce vakcíny (medián odstupu 15 dní). Druhá dávka vakcíny byla podána v odstupu 20 až 29 dní po první dávce. Většině dobrovolníků (120 osob, 72,3 %) byla druhá dávka podána po 21 dnech po první dávce. Interval mezi druhým odběrem a druhou dávkou očkování byl v rozpětí 0 až 14 dnů (medián 6 dní). Třetí odběr následoval po druhé dávce očkování v rozmezí 28 až 52 dnů (medián 35 dní). Čtvrtý kontrolní odběr byl proveden v rozmezí 92 až 121 dnů po druhé dávce vakcíny (medián 106 dní). Medián odstupu 5. a 6. odběru od podání druhé dávky vakcíny byl 218 a 365 dní. První a třetí odběr krve podstoupili všichni účastníci studie, druhý a čtvrtý odběr 150 účastníků. Pátý odběr byl proveden u 156 účastníků, šestý odběr u 140 účastníků.

V průběhu studie byla na základě celosvětově nepříznivého epidemického vývoje doporučena očkovaným osobám aplikace třetí (posilující) dávky vakcíny, při plánování studie tato možnost nebyla známa. Toto očkování individuálně podstoupilo v době mezi 5. a 6. odběrem 127 účastníků studie, u nichž je k dispozici 6. odběr. Jejich protilátková odpověď a celkové vyhodnocení 6. odběru byly touto skutečností ovlivněny.

Charakteristiky rozložení hodnot protilátek IgG proti S proteinu SARS-CoV-2 v rámci jednotlivých odběrů jsou uvedeny v tabulce 2. Vývoj protilátek v čase v celém souboru vykazuje statisticky významný vzestup mezi prvním a druhým odběrem (p < 0,001) i mezi druhým a třetí odběrem (p < 0,001), statisticky významný pokles mezi třetím a čtvrtým odběrem (p < 0,001) a mezi čtvrtým a pátým odběrem (p < 0,001). Mezi pátým a šestým odběrem došlo v důsledku očkování třetí dávkou ke statisticky významnému vzestupu hladin protilátek (p < 0,001).

V intervalu 21 dní po aplikaci 1. dávky vakcíny proběhla sérokonverze u 98,7 % ze 150 účastníků (viz tabulka 2), u nichž je k dispozici 2. odběr, dva účastníci měli ve druhém odběru nulovou hodnotu hladiny protilátek. Do 28 dní po aplikaci 2. dávky vakcíny dle schváleného aplikačního schématu proběhla sérokonverze u 99,4 % účastníků, tj. u všech s výjimkou jednoho účastníka, který je imunosuprimovaný, s transplantací ledviny v anamnéze. V čase 3, 6 a 12 měsíců po aplikaci 2. dávky vakcíny byly na základě výsledků ze 4., 5. a 6. odběru detekovatelné anti SARS-CoV-2 protilátky u všech účastníků, přičemž u zmíněného jednoho účastníka byly při 4. a 5. odběru zjištěny hodnoty nižší než 50 AU/ml, tedy negativní, a sérokonverze u něj byla prokázána až v 6. odběru, po aplikaci 3. dávky.

Tabulka 2. Charakteristiky hodnot protilátek IgG proti S proteinu SARS-CoV-2 v jednotlivých odběrech (n = 140–166)
Table 2. Characteristics of IgG antibody levels against the SARS-CoV-2 S protein in individual samples (n = 140–166)

n – počet osob se zjištěnými údaji v daném odběru
n – number of persons with ascertained data in the given sample

Obr. 2. Dynamika vývoje protilátek IgG proti S proteinu SARS-CoV-2 v závislosti na čase
Figure 2. Dynamics of IgG antibodies against the S protein of SARS-CoV-2
Poznámka: Čas 0 je čas třetího odběru krve pro stanovení protilátek IgG proti S proteinu SARS-CoV-2, který proběhl jeden měsíc po 2. dávce očkování.
Note: Time 0 is the time of the third blood collection for the determination of IgG antibodies against the S protein of SARS-CoV-2, which took place one month after the 2nd dose of vaccination.

Obr. 3. Rozdělení protilátek IgG proti S proteinu SARS-CoV-2 v séru v jednotlivých odběrech podle věku u účastníků, u nichž proběhla sérokonverze po první dávce vakcíny
Figure 3. Distribution of serum IgG antibodies against the SARS-CoV-2 S protein in samples by age of participants who seroconverted after the first dose of vaccine

Graf na obrázku 2 znázorňuje individuální časové průběhy hladin protilátek. Z důvodu přehlednosti je uspořádán tak, že všechny průběhy jsou ukotveny k času 3. odběru (označen jako čas 0), který byl proveden měsíc po druhé dávce a který je klíčový pro posouzení dosažených hladin protilátek po úplném očkování dvěma dávkami, a ostatní odběry jsou časově vztaženy k tomuto času.

Pro potřeby porovnání tvorby protilátek v závislosti na věku vakcinovaných byly stanoveny čtyři věkové skupiny do 40 let, 41 až 50 let, 51 až 60 let a nad 60 let. Vývoj hladin protilátek podle věku je zobrazen v krabicovém grafu na obrázku 3. Při 2. odběru se hladiny protilátek u věkových skupin lišily statisticky významně (p < 0,001), ve vyšších věkových kategoriích byly dosaženy nižší hladiny protilátek. Při 3. až 6. odběru byly rozdíly mezi věkovými skupinami malé a statisticky nevýznamné. Z důvodu přehlednosti nejsou v grafu na obrázku 3 zahrnuty údaje výše zmíněných dvou účastníků, u nichž neproběhla sérokonverze po 1. dávce vakcíny. Hladina protilátek ve třetím odběru, zásadním pro posouzení situace po úplném očkování, se lišila mezi muži a ženami (p = 0,028), medián hodnot u mužů byl 8 178,0 AU/ml a u žen 11 250,5 AU/ml. Statisticky významné rozdíly přetrvávaly i při 4. a 5. odběru.

U podskupiny 8 osob byly hladiny protilátek stanoveny častěji. Průběh nárůstu a následného poklesu IgG protilátek v závislosti na čase je znázorněn v grafu na obrázku 4, kde v čase 0 je opět znázorněna hodnota protilátek ve třetím odběru, tj. měsíc po druhé dávce. Vložené odběry jsou označeny body, jedná se o odběry 14 dní po druhé dávce (oranžové body) a 2 měsíce po druhé dávce (modré body). V porovnání s grafem na obrázku 2 je zde jasně patrné, že hladiny protilátek 14 dní po druhé dávce jsou výrazně vyšší než hladiny po 1 měsíci (přechod mezi oranžovou a modrou čarou). Mezi těmito dvěma odběry došlo již ke statisticky významnému poklesu hladin protilátek (p = 0,014). Dále je zřejmé, že pokles hladin protilátek v čase se postupně zpomaluje, probíhá v podstatě exponenciálně. V grafu je, stejně jako v jiných grafech, užito logaritmické měřítko a exponenciální pokles hodnot v čase se v tomto měřítku zobrazuje v podobě lineárně klesajících přímek.

Obr. 4. Vývoj protilátek IgG proti S proteinu SARS-CoV-2 v závislosti na čase u podskupiny 8 osob s častějšími odběry krve
Figure 4. Dynamics of IgG antibodies against the SARS-CoV-2 S protein in a subgroup of 8 subjects with more frequent blood sampling
Poznámka: Čas 0 je čas třetího odběru krve pro stanovení protilátek IgG proti S proteinu SARS-CoV-2, který proběhl jeden měsíc po 2. dávce očkování.
Note: Time 0 is the time of the third blood collection for the determination of IgG antibodies against the SARS-CoV-2 S protein, which took place one month after the 2nd dose of vaccine.

Tabulka 3. Sledování pacientů po vakcinaci prostřednictvím kontrolních dotazníků v jednotlivých měsících po aplikaci 2. dávky vakcíny
Table 3. Follow-up of vaccinated participants through control questionnaires by month after the second dose of vaccine

V tabulce 3 jsou údaje o výskytu respiračních infektů u účastníků studie získané z pravidelně měsíčně vyplňovaného on-line dotazníku a údaje o výskytu laboratorně potvrzeného covidu-19. Jeden účastník onemocněl covidem-19 do 6 měsíců od aplikace 2. dávky vakcíny dle schváleného aplikačního schématu, 21 účastníků onemocnělo v 8. až 12. měsíci od aplikace 2. dávky, dalších 11 ve 13. měsíci. Podíl očkovaných, u kterých došlo k selhání vakcíny do 12 měsíců, byl 13,3 %. Proběhlá onemocnění covid-19 jsou vedle třetí dávky očkování další skutečností, kterou nebylo možno zohlednit při plánování studie a která přitom výrazně ovlivnila zjištěné hladiny protilátek v 6. odběru.

Druhá kohorta zahrnovala 60 dobrovolníků, 22 (36,7 %) mužů a 38 (63,3 %) žen (tabulka 4), kteří vstoupili do studie s anamnézou předchozí infekce SARS-CoV-2. Věk účastníků v této skupině se pohyboval od 12 do 78 let (medián 49 let). Infekci prodělali v rozmezí 1–10 měsíců před 1. odběrem. Přítomnost viru byla u 33 osob laboratorně potvrzená PCR testem a u zbývajících osob bylo prodělané onemocnění covidem-19 prokázáno epidemiologickým šetřením a dále přítomností protilátek proti proteinům N, S1 a RBD viru SARS-CoV-2. Hladina hodnot protilátek proti S proteinu SARS-CoV-2 z prvního odběru krve byla u většiny (55 osob) v rozmezí 50–2000 AU/ml. V jednom případě byl výsledek negativní, maximální zjištěná hodnota byla 12 569,6 AU/ml a medián byl 750,9 AU/ml. Hladiny protilátek v tomto souboru s mediánem 10 230,5 AU/ml byly statisticky významně nižší v porovnání s hladinami v souboru naivních očkovaných osob po druhé dávce očkování (p < 0,001).

Tabulka 4. Popisné charakteristiky skupiny osob s anamnézou předchozí infekce SARS-CoV-2 (n = 60)
Table 4. Descriptive characteristics of participants with a history of previous SARS-CoV-2 infection (n = 60)

n – počet osob
n – number of persons

DISKUSE

V této studii analyzujeme vývoj protilátkové odpovědi, která je považována za klíčový aspekt přirozené clearance viru i účinnosti očkování, po kompletním očkování mRNA vakcínou BNT162b2 (Comirnaty). Kromě hlavní skupiny naivních očkovaných osob byly analyzovány hladiny protilátek i ve skupině osob po prodělaném onemocnění následně vakcinovaných.

V době zahájení očkování proti covidu-19 v ČR bylo v SZÚ zřízeno očkovací centrum, kde se očkovalo výhradně uvedenou vakcínou. Naskytla se tím možnost provést dlouhodobou studii povakcinační protilátkové odpovědi u souboru zaměstnanců SZÚ a dalších dobrovolníků. Protilátková odpověď na spike protein ve třídě IgG po očkování v kohortě 166 naivních osob očkovaných dvěma dávkami byla vysoká, po první dávce 98,8 %, po druhé dávce dosáhla 99,4 %, což je podobné hodnotám zjištěným v jiných publikovaných studiích, např. 98,4 % v [10] a 99,8 % v [11]. Vysoká úspěšnost sérokonverze může být ovlivněna věkovým složením souboru (jen necelá čtvrtina osob byla ve věku nad 60 let). Protilátky IgG po vakcinaci dvěma dávkami dosáhly signifikantně vyšší hladiny než u kohorty osob po přirozené infekci před očkováním.

Systematický přehled publikací [12] ukázal, že vrcholu protilátkové odpovědi bylo zpravidla dosaženo 21 až 28 dní po druhé dávce. Ale na základě kompartmentového modelu byla doba do dosažení maximální hladiny odhadnuta na 36 ± 3 dny po první dávce [13], což při intervalu 21 dní mezi dávkami znamená 15 dní po druhé dávce. Tomu spíše odpovídají i naše výsledky na malé podskupině 8 původně imunologicky naivních osob s častějšími odběry krve naznačující, že již po měsíci od druhé dávky dochází k poklesu hladin protilátek v porovnání s hladinami po dvou týdnech od vakcinace, takže vrcholná protilátková odpověď nastává spíše dříve, než až za 28 dní.

Obr. 5. Vývoj protilátek IgG proti S proteinu SARS-CoV-2 v závislosti na čase u podskupiny 17 osob, které byly po předchozí infekci SARS-CoV-2 následně očkovány
Figure 5. Dynamics of IgG antibodies against the SARS-CoV-2 S protein in a subgroup of 17 persons vaccinated after previous infection with SARS-CoV-2
Poznámka: Čas 0 je čas třetího odběru krve pro stanovení protilátek IgG proti S proteinu SARS-CoV-2, který proběhl jeden měsíc po 2. dávce očkování.
Note: Time 0 is the time of the third blood collection for the determination of IgG antibodies against the SARS-CoV-2 S protein, which took place one month after the 2nd dose of vaccine.

V kohortě naivních osob jsme pozorovali poměrně jasný nepřímo úměrný vztah mezi hladinami protilátek a věkem, statisticky významný při druhém odběru. Dále byly zaznamenány nižší hladiny protilátek u mužů v porovnání se ženami ve třetím až pátém odběru. Obdobné výsledky byly i v jiných studiích, které ukázaly, že ženy mají tendenci vyvíjet silnější protilátkovou odpověď než muži [10, 14]. Vysvětlením mohou být hormonální vlivy nebo rozdíly ve funkci imunitního systému [15]. Vyšší protilátková odpověď u žen přetrvávala i po třech měsících po druhé dávce. V závislosti na vzrůstajícím věku byla zjištěna nižší protilátková odpověď, což odpovídá publikovaným údajům, jak po vakcinaci, tak po prožitém onemocnění [16, 17]. Rozdíly mezi věkovými skupinami byly patrné zejména po první dávce vakcíny, což podtrhuje důležitost podání druhé dávky zejména u starší populace. Pokles protilátek byl nejvýraznější ve vyšších věkových skupinách, což zdůrazňuje potřebu přeočkování nebo posilující dávky u starší populace, aby byla zachována dostatečná ochrana proti závažnému průběhu infekce. Nicméně i po 6 měsících od druhé dávky přetrvávaly hladiny vyšší než 50 AU/ml, tedy pozitivní, u 99,4 % účastníků studie, což je obdobné jako např. ve slovenské studii, v níž mělo 36 týdnů po druhé dávce pozitivní hladinu protilátek 99,6 % účastníků [18]. Slabá odezva u jedné imunosuprimované osoby v naší studii je v souladu se zjištěními jiných studií, že nižší hladiny protilátek jsou dosahovány u osob se specifickými komorbiditami a také s imunosupresí [10].