Patogeneze infekcí vyvolaných virem SARS-CoV-2

Overview

SARS-CoV-2 je virus, který vyvolává slizniční infekce respiračního nebo střevního traktu. Tento virus se na rozdíl od jiných virů, které vyvolávají podobný typ infekcí, vyznačuje mimořádnou schopností modifikovat imunitní odpověď na několika úrovních, a způsobit tak celou řadu komplikací. Jedním z důsledků těchto manipulací je vytvoření falešného obrazu pyogenní bakteriální infekce. O průběhu nemoci rozhodují především mechanismy přirozené slizniční imunity, které mohou zastavit množení viru v časných fázích infekce, než virus stihne uplatnit svůj vliv.

Covid-19 má dvě hlavní klinické formy: slizniční infekci (respirační nebo střevní) a pneumonii. Pneumonie je asociována s aktivací cévního endotelu a prokoagulačním stavem. Virémie nepatří k standardnímu průběhu onemocnění. Postižení jiných orgánů než plic – ať už v době aktivní infekce nebo později (long covid) – bývá způsobeno imunopatologickými reakcemi nebo poruchami hormonálních regulací.

ÚVOD

V minulém století byly koronaviry v lidské patologii popisovány jako málo zajímavá skupina RNA virů, které se spolupodílejí na vzniku banálních respiračních infekcí (common cold). Během posledních dvaceti let se však objevily tři závažné epidemie způsobené do té doby neznámými druhy koronavirů, které byly pojmenovány akronymy SARS-CoV (Severe Acute Respiratory Syndrome CoronaVirus), MERS-CoV (Middle East Respiratory Syndrome CoronaVirus) a SARS-CoV-2. Posledně jmenovaný virus způsobil dokonce pandemii, při které během tří let onemocnělo více než 676 miliónů lidí na celém světě, a téměř 7 miliónů lidí na tuto infekci zemřelo [1].

Nemoc způsobená virem SARS-CoV-2 se nazývá covid-19, což je opět akronym, odvozený ze slov COro-naVIrus Disease described in the year 2019. Termín „covid-19“ je sice všeobecně známý a rozšířený, ale často je používán nesprávně. Mnozí odborníci a tím spíše i laici si neuvědomují, že jde o název nemoci, čili symptomatické infekce, a nemůže sloužit pro označení bezpříznakově probíhajících infekcí. Zejména v epidemiologických studiích je vždy nutné rozlišovat, jestli udávaný počet pozitivních/prokázaných případů vypovídá o množství infikovaných osob nebo nemocných osob.

Další záludnost se skrývá v otázce, jaké klinické a patologické projevy mají být s pojmem covid-19 spojovány. Kde je hranice (obvyklých) projevů nemoci a co je již nutné hodnotit jako komplikaci? Vyvolává SARS-CoV-2 jednu nemoc (covid-19) nebo několik forem nemoci, které je vhodné posuzovat odděleně jako samostatné jednotky? Na tyto otázky zatím nemáme uspokojivou odpověď. Tento článek je příspěvkem k hledání odpovědí na podobné dotazy; klíčem k řešení by mělo být pochopení patogeneze této infekce.

Vlastnosti viru

SARS-CoV-2 patří mezi koronaviry. To jsou poměrně velké (50–200 nm) obalené RNA viry sférického nebo eliptického tvaru, které na svém povrchu nesou kyjovité výběžky, takže celek připomíná sluneční koronu; odtud se odvozuje název celé této skupiny virů.

Výběžky se skládají vždy ze tří molekul glykoproteinu označovaného jako S (spike) protein. Tyto S proteiny sestávají ze dvou podjednotek: S1 umístěný na špičce výběžku zajišťuje přichycení viru k cílové buňce a S2, který je lokalizován při bazi výběžku, uskutečňuje fúzi viru s buňkou.

Virový plášť koronavirů je tvořen lipidovou dvouvrstvou pocházející z membrány hostitelské buňky, v níž jsou obsaženy další dva virové proteiny – M (membrane) a E (envelope). Oba tyto proteiny mají transmembránový charakter. M protein má především funkci stavební (udržuje tvar viru) a E protein je nezbytný pro pučení viru z buňky. Nejvnitřnější část viru tvoří vlákno ribonukleové kyseliny sbalené do malého objemu pomocí N (nuclear) proteinu. Kromě uvedených čtyř strukturálních proteinů (S, M, E a N) kóduje virová RNA ještě dalších 16 nestrukturálních bílkovin. Některé z nich řídí replikaci virové RNA, jiné mají schopnost blokovat mechanismy přirozené imunity.

Obecně platí, že obalené viry mají lepší adhezivitu k cílovým buňkám, na druhé straně však lipidový obal zvyšuje citlivost viru k vyšším teplotám, UV záření, vyschnutí, tukovým rozpouštědlům a také iontům mědi a některých dalších kovů [2]. Tyto viry se proto nejlépe přenášejí prostřednictvím aerosolu. Nepravidelně eliptický nebo pytlovitý tvar může být pro viry výhodný, protože usnadňuje přilnutí k výstelce dýchacích cest; naproti tomu dokonale kulovitý virus má tendenci se valit po povrchu sliznice, aniž by se zachytil [3].

RNA koronavirů obsahuje asi 30 000 bazí, a patří tak k nejdelším mezi všemi známými RNA viry. Neobvyklá velikost virového genomu souvisí s nestandardním způsobem transkripce koronavirové RNA na ribozomech: jednotlivé geny nejsou při transkripci čteny souvisle za sebou. Virus obsahuje dva velké čtecí rámce, které se částečně překrývají, a transkripce probíhá nespojitě, s vynecháním části genomu [4, 5]. Tento komplikovaný proces vyžaduje součinnost několika virových proteinů, včetně speciálního enzymu (3‘-5‘ exoribonukleázy), který kontroluje správnost přepisu a opravuje vzniklé chyby [6]. Přesto vzniká prostor pro četné mutace, což se v praxi projevuje značnou variabilitou virů. Dalším důsledkem velkého genomu je pomalejší množení koronavirů uvnitř hostitelské buňky ve srovnání s jinými respiračními viry [7]; z toho vyplývá i pomalejší rozvoj nemoci.

Je zřejmé, že vlastnosti SARS-CoV-2 neodpovídají charakteristikám typickým pro jednoduché slizniční viry, které se řídí strategií „hit and run“. Podstatou strategie „hit and run“ je rychlé pomnožení viru, dříve než se dokážou aktivovat imunitní mechanismy, které další replikaci viru zastaví. Neobvyklá délka RNA a komplikovaná replikace SARS-CoV-2 musí mít pro virus význam, jinak by se uplatnily deleční mutace, přičemž viry s kratší RNA by měly evoluční výhodu vyplývající z rychlejší transkripce nukleové kyseliny. Hlavním smyslem dosavadního uspořádání je zřejmě možnost zablokování klíčové složky přirozené protivirové imunity, tj. interferonůa. Více než třetina genomu SARS-CoV-2 je určena ke kódování proteinů, které mohou přímo nebo nepřímo znemožnit syntézu interferonů nebo jejich účinek na cílové molekuly [8, 9].

Původ viru

Evoluce SARS-CoV-2 není dosud uspokojivě vysvětlena. Porovnání sekvencí nukleotidů v genomu tohoto viru ukázalo některé odchylky proti jiným koronavirům. Ty by bylo možné přisoudit náhodným mutacím, avšak zlomové linie mezi odlišnými úseky genů velmi připomínají sekvence, které vznikají při opracování nukleových kyselin moderními metodami genetického inženýrství [13, 14]. Podezřelá je i skutečnost, že se SARS-CoV-2 na rozdíl od původců předchozích koronavirových epidemií (SARS, MERS) od počátku choval jako příliš dobře adaptovaný na člověka, takže místo epidemie omezeného rozsahu způsobil celosvětovou pandemii [15, 16].

V odborné literatuře panuje shoda v názoru, že koronaviry mají původ v netopýřích virech. Genom SARS-CoV-2 vykazuje homologii 89–96,3 % s netopýřími koronaviry bat-SL-CoVZC45 a bat-SL-CoVZXC21, zatímco shoda s genomem SARS-CoV-1 činí jen 79–82 % [17, 18]. Netopýří imunitní systém je však jiný než u většiny ostatních savců [19, 20], a proto viry adaptované na netopýry nemohou jednoduše přeskočit do lidské populace a šířit se v ní. Epidemie SARS a MERS se v lidské populaci objevily až poté, co se netopýří koronaviry etablovaly na jiných savčích hostitelích, a i pak vykazovaly jen omezenou nakažlivost (tabulka 1). U SARS-CoV-2 nebyl žádný podobný mezihostitel zjištěn. Hypotéza přisuzující roli mezihostitele luskounům rodu Manis nebyla nikdy prokázána. Mnoho odborníků v této situaci dospělo k přesvědčení, že virus mohl být modifikován uměle, i když spolehlivé důkazy stále nemáme [21–23].

 

a Poznámka: Je pravděpodobné, že tuto schopnost si koronaviry osvojily v průběhu vývoje, při adaptaci na netopýří hostitele, kteří z metabolických příčin nemohou rozvinout imunitní mechanismy ve stejném rozsahu jako nelétající savci, a proto mají akcentovanou interferonovou reakci. Zatímco lidské buňky reagují na virovou infekci syntézou interferonu, v netopýřích buňkách jsou interferonové prekurzory přítomny již v klidovém stavu a mohou být tedy mnohem rychleji aktivovány [10–12].

 

PŮSOBENÍ VIRU NA ÚROVNI BUŇKY

Infekce buňky virem SARS-CoV-2 začíná adhezí některého z S proteinů viru k receptoru na povrchu cílové buňky. Tímto receptorem je ACE2 (angiotensin-converting enzyme 2), což je enzym, pomocí něhož může buňka změnit signály zprostředkované hormonem angiotenzinem (schéma 1). SARS-CoV-2 se váže na ACE2 stejně jako SARS-CoV-1 (viz tabulka 1); jeho vazba je však přibližně 10krát silnější [26]. Vzájemná konkurence mezi jednotlivými variantami viru způsobuje, že každá nová epidemická varianta SARS-CoV-2 musí mít stejnou nebo větší afinitu k ACE2 než varianty předchozí, aby se mohla prosadit.

Po navázání S proteinu na ACE2 odstřihnou tzv. furinové proteázy přítomné na povrchu hostitelské buňky distální konec tohoto proteinu (S1 fragment), čímž se obnaží a aktivuje proximální část, označená S2. Vlivem této molekuly dojde k fúzi membrány viru s membránou hostitelské buňky. Na fúzi membrán se zároveň podílí proteolytický enzym přítomný na buněčné membráně, označovaný TMPRSS2 (transmembrane protease, serine 2). Kromě toho byla popsána i další možná cesta internalizace viru, a sice vchlípením buněčné membrány a vytvořením endosomu obsahujícího virus. V tomto případě není TMPRSS2 potřebný; fúzi membrán obstarává jiný buněčný enzym, katepsin L. Poté, co virus jedním nebo druhým způsobem pronikne do buňky, působí jeho nukleová kyselina jako regulérní mRNA, která je transportována do endoplazmatického retikula a zde kóduje syntézu virových bílkovin, které vytvoří replikační a transkripční komplex (RTC). Tento komplex indukuje v endoplasmatickém retikulu tvorbu váčků (DMV, double membrane vesicles), v nichž pak probíhá replikace virové RNA i tvorba nových virových bílkovin. Virová RNA je takto chráněna před buněčnými ribonukleázami. Z membrány vezikulů se potom stávají obaly vznikajících virionů. Vezikuly obsahující virus jsou mezitím přemísťovány do Golgiho komplexu a zde dochází ke glykosylaci proteinů na povrchu vznikajících virů. Rozsah glykosylace S proteinů může být individuálně odlišný, a přitom tento faktor ovlivňuje afinitu viru k cílovým receptorůmb [5, 27, 28].

Viry se z buňky uvolňují exocytózou. Svým množením tedy nezpůsobují přímo smrt infikované buňky; cytopatogenní efekt nastává jen u části napadených buněk [29]. K usmrcení infikovaných buněk dochází obvykle apoptózou nebo ji způsobí NK buňky či cytotoxické lymfocyty svými perforiny a granzymy.

Sbalení dlouhé virové RNA je poměrně komplikovaný proces, při němž se tvoří virová RNA i N protein v nadbytku. Při rozpadu infikovaných buněk se tyto komponenty mohou dostávat do lymfy a poté do krevního řečiště. Tím je možné vysvětlit přítomnost N-antigenu v krvi nemocných osob, která je využívána v diagnostice infekcí způsobených SARS-CoV-2 [30]. Dalším důsledkem tohoto vývoje mohou být nálezy virové RNA v různých tkáních po prodělané koronavirové infekci. Z tohoto výkladu vyplývá, že nález RNA není možné automaticky považovat za průkaz virémie, tj. přítomnosti kompletního/aktivního viru v krvi nebo ve tkáních.

Buňky vybavené ACE2 receptory se v lidském těle nacházejí v různých orgánech. Patří mezi ně řasinkové a žlázové buňky v dýchacích cestách, alveolární buňky II typu v plicích, enterocyty v celém rozsahu tenkého střeva (a v menší míře i v tračníku a jícnu), cholangiocyty vystýlající žlučové cesty, epitel proximálních tubulů v ledvinách, urotel močového měchýře, Sertoliho buňky varlat, endotelové buňky v tepnách, žilách i lymfatických cévách, svalové buňky myokardu, buňky hladkých svalů v arteriích, trofoblasty v tkáni placenty, makrofágy, epitelové buňky potních žláz, buňky endokrinních žláz (nadledvin, příštitných tělísek, hypofýzy, ostrůvků v pankreatu, Leydigových buněk varlat) a buňky rohovky [31]. Všechny tyto buňky lze tedy označit za potenciálně permisivní pro koronavirovou infekci. Naopak ACE2 receptory nebyly nalezeny na krevních elementech, hepatocytech a retikulárních buňkách sleziny a lymfatických tkání.

Molekulární struktura, a tedy i antigenní složení ACE2 receptorů se může u různých jedinců mírně lišit; tím je možné zčásti vysvětlit různou vnímavost jednotlivých osob k infekci, včetně rozdílu ve vnímavosti vůči jednotlivým antigenním variantám SARS-CoV-2 [32].

 

Tabulka 1. Charakteristiky covid-19 ve srovnání s epidemiemi SARS a MERS [1, 24, 25]
Table 1. COVID-19 characteristics compared to SARS and MERS epidemics [1, 24, 25]

Nemoc	Objev	Původce	Taxonomické zařazení	Cílový receptor	Zdrojový hostitel	Sekundární hostitel	Interhumánní přenos	Počet infikovaných	Počet zemřelých	Smrtnosta
SARS	2002	SARSCoV-1	betakoronavirus (sarbekovirus)	ACE2	netopýr	cibetka palmová	nízká nakažlivost	8098	774	9,6 %
MERS	2012	MERS-CoV	betakoronavirus (merbekovirus)	DPP-4	netopýr	velbloud jednohrbý	nízká nakažlivost	2538	871	34,3 %
covid-19	2019	SARSCoV-2	betakoronavirus (sarbekovirus)	ACE2	netopýr	?	vysoká nakažlivost	> 676 milionů	> 6,8 miliónů	1,0 %

SARS – severe acute respiratory syndrome; MERS – Middle East respiratory syndrome; ACE2 angiotensin-converting enzyme 2; DPP – dipeptidyl peptidase
^aU všech zmíněných koronavirů závisí smrtnost na okolnostech: je velmi nízká u dětí a naopak velmi vysoká u seniorů a polymorbidních jedinců.

SARS – severe acute respiratory syndrome, MERS – Middle East respiratory syndrome, ACE2 – angiotensin converting enzyme 2, DPP – dipeptidyl peptidase
^aAn average mortality rate of infections caused by these coronaviruses varies with the age of the patients; it is very low in children but very high in the elderly and in polymorbid individuals.

 

 

IMUNITNÍ REAKCE PROTI KORONAVIROVÉ INFEKCI

Imunitní reakce proti (korona)virové infekci probíhá jako postupný děj, ve kterém se nejprve zapojují nástroje nespecifické (přirozené) imunity a teprve v dalším kroku přicházejí na řadu složitější mechanismy, které jsou zacíleny proti konkrétním antigenům viru (tabulka 2).

Imunitní systém je aktivován přítomností PAMPs (pathogen-associated molecular patterns), případně DAMPs (damage-associated molecular patterns). Typickým projevem RNA-virové infekce je přítomnost dvojvláknové RNA (dsRNA, double strand RNA), která se vytváří při kopírování RNA ® RNA. Na přítomnost dsRNA a dalších známek virové infekce reagují signální molekuly přítomné v cytoplazmě i v buněčných organelách, z nichž hlavní jsou RIG-I (retinoic acid-inducible gene I), MDA5 (melanoma differentiation-associated protein 5) a toll-like receptory (TLR) 3 a 7. Aktivace těchto signálních molekul indukuje v napadené buňce tvorbu interferonů a současně vytváří podnět pro apoptózu [33–35]. Rozsah činností, které jsou v důsledku této signalizace aktivovány, ukazuje tabulka 3.

Interferony vzniklé v postižených buňkách se dělí na interferony typu I (IFNα, IFNβ) a interferony typu III (IFNλ). Interferony prostřednictvím Janus kinázy 1 (JAK 1), tyrozin kinázy 2 (TYK 2) a dalších mezistupňů aktivují stovky genů a mění celý metabolismus cílových buněk [33]. Buňky ovlivněné působením interferonů tedy brání množení viru na několika úrovních, ovšem za tu cenu, že mají zablokovanou proteosyntézu, a proto nemohou vykonávat různé své fyziologické činnosti. Účinek interferonů proto nesmí trvat déle než několik dní. Úkol likvidovat infekci pak přechází na adaptivní imunitu. Tento dvoustupňový systém antivirové obrany je vysoce účinný, předpokládá ale dobrou koordinaci mezi útlumem působení interferonu a navazujícím rozvojem specifické imunitní odpovědi. Jestliže oba děje nejsou dobře propojeny, může vzniknout okno, ve kterém se virus začne množit.

 

bPoznámka: Je možné, že choroby související s metabolismem cukrů (diabetes, obezita), které patří k nejvýznamnějším stavům disponujícím k těžkému průběhu covidu-19, ovlivňují prostřednictvím glykosylační aktivity membránové interakce, které jsou pro průběh infekce zásadně důležité.

 

Tabulka 2. Hlavní složky imunity, které se uplatňují při koronavirové infekci
Table 2. Major components of immunity triggered by coronavirus infection

Interakce viru s lidským organismem	Postižená tkáň	Stadium infekce	Typ imunitní odpovědi	Hlavní složky imunitní odpovědi	Klinické projevy
Inaparentní infekce	sliznice (respirační, střevní)	časné (první dny)	přirozená	interferon λ a α, NK buňky	žádné
Nemoc (covid-19)	sliznice (respirační, střevní)	časné (první dny)	přirozená	interferon λ a α, NK buňky	rýma, kašel, horečka, slabost, poruchy čichu a chuti; nebo průjem, střevní diskomfort, horečka
		pozdější	adaptivní (získaná)	cytotoxické lymfocyty, slizniční protilátky (sIgA)
	plíce	pozdější	adaptivní (získaná)	cytotoxické lymfocyty, sérové protilátky (IgM, IgG)	horečka, kašel, dušnost, hypoxie
	krevní řečiště, různé orgány	pozdější	adaptivní (získaná)	sérové protilátky (IgM, IgG), fagocyty, cytotoxické lymfocyty	horečka, cévní komplikace, postižení ledvin, srdce a dalších orgánů
Post-covid syndromy	krevní řečiště, různé orgány	stav po prodělání infekce	adaptivní (získaná)	sérové protilátky, různé subsety T lymfocytů	únava, cévní komplikace, postižení různých orgánů

 

 

Tabulka 3. Činnosti, kterými napadená buňka prostřednictvím interferonů typu I a III reaguje na koronavirovou infekci
Table 3. Interferon I and III mediated actions in coronavirus infected cells

Cílené protivirové aktivity	syntéza bílkovin, které rozpoznají virovou RNA podle chybějící metylace její koncové části a zabrání jejímu spojení s ribozomem syntéza enzymů rozkládajících RNA (RNAázy) syntéza inhibitorů virové RNA-dependentní-RNA-polymerázy (RdRp)
Další činnosti omezující množení viru	celkové omezení transkripce v napadené buňce změna vlastností buněčné membrány, které omezí vchlípení viru, ale také vylučování nových virionů změna membrán tvořících endoplazmatické retikulum, zabraňující tvorbě výchlipek
Aktivace buněk v okolí	indukce podobných dějů v sousedních buňkách aktivace NK buněk podpora zánětlivé reakce v místě infekce vznik horečky
Likvidace napadené buňky	aktivace apoptózy v napadené buňce důsledkem poruchy buněčných regulací je vystavení nesprávných signálních molekul na buněčné membráně; buňky s nesprávnými povrchovými znaky jsou vyhledávány a ničeny NK buňkami a cytotoxickými lymfocyty vystavení specifických virových antigenů na membráně infikované buňky; takto označená buňka je rozpoznána protilátkami a/nebo cytotoxickými lymfocyty a poté zničena

 

 

Chování infekce SARS-CoV-2 je ve srovnání s jinými slizničními RNA viry poněkud zrádné, protože tento virus se množí pomaleji a zároveň disponuje řadou mechanismů ke zmatení imunitní reakce, viz níže. Imunitní systém proto může závažnost infekce zpočátku podcenit a aktivovat specifické imunitní mechanismy opožděně.

IFNλ byl popsán teprve v roce 2003. Od interferonů typu I se liší tím, že se váže na jiné receptory, které jsou přítomny jen na epitelových buňkách, a také tím, že působí méně intenzivně, ale zato déle. Další významný rozdíl spočívá v tom, že interferony typu I podporují rozvoj zánětlivé reakce obecně čili včetně aktivace makrofágů a polymorfonukleárů, zatímco IFNλ má selektivnější funkci: podporuje jen antivirové mechanismy a současně inhibuje pyogenní zánětlivou odpověď. Podle posledních výzkumů se zdá, že role IFNλ v obraně proti SARS-CoV-2 je významnější [36–38].

NK buňky (natural killers) jsou velké lymfoidní buňky, které dokážou identifikovat napadené buňky a zničit je. Rozpoznání cílových buněk je založeno buď na výskytu aktivačních signálů (přítomnost tzv. lektinových bílkovin na buněčné membráně v neobvykle vysoké hustotě), anebo naopak na nepřítomnosti inhibičních signálů (patologicky změněné buňky nenesou na svém povrchu správné identifikační molekuly). Význam NK buněk v počáteční fázi virové infekce je zásadní [39]: NK buňky jsou schopné vyhledat a usmrtit i ty defektní buňky, které v důsledku virové manipulace nebo z jiné příčiny nerespektovaly podněty k apoptóze. Při takovémto násilném usmrcení však lýza napadených buněk probíhá pod obrazem pyroptózy, čili rozpadu, který podporuje rozvoj purulentní zánětlivé reakce [40]. Makrofágy, které jsou působením interferonů také aktivovány, poté dokončují úklidové procesy a následně může probíhat regenerace. NK buňky stejně jako interferony mají i signalizační funkci: tvoří IFNγ a interleukin 12, které aktivují T lymfocyty a usměrňují jejich vyzrávání. Tím se do dalších dějů začíná zapojovat adaptivní imunita. Kromě toho produkují IFNα, čímž vzniká pozitivní zpětná vazba, která zesiluje počáteční signál (schéma 2).

Ačkoli přirozená imunitní odpověď probíhá podle předprogramovaného scénáře, neznamená to, že je neměnná. V poslední době byly publikovány práce ukazující, že jednotlivé epizody stimulace imunitního systému mohou přechodně zvýšit nebo naopak snížit reaktivitu přirozené imunity. Po prodělané virové infekci tak může po dobu několika týdnů až měsíců přetrvávat zvýšená pohotovost signálních a transkripčních drah, které vedou k aktivaci celého komplexu imunitních mechanismů. Pro tento děj byl zaveden termín trained immunity [41]. Toto uspořádání uděluje organismu zvýšenou odolnost proti časné reinfekci, nezávislou na rozvoji specifické (adaptivní, získané) imunity.

Adaptivní (získaná, specifická) imunitní odpověď začíná záchytem cizorodých bílkovin nebo polysacharidů antigen-prezentujícími buňkami. Při virové infekci, která je ze své podstaty intracelulární, dochází po stimulaci interferonem γ k podpoře vyzrávání TH1 lymfocytů a cytotoxických lymfocytů (TC lymfocyty, CD8+lymfocyty). Cytotoxické lymfocyty usmrcují napadené buňky podobným způsobem jako NK buňky, využívají však jiný způsob jejich vyhledávání. Orientují se podle HLA antigenů, které každá buňka nese na svém povrchu; infikované buňky mají na své buněčné membráně molekuly MHC I s navázanými peptidy virového původu. Působení cytotoxických lymfocytů je tedy selektivnější a může být razantnější než působení NK buněk.

Jestliže se virové antigeny vyskytují i volně v extracelulárním prostředí, je stimulována jiná forma imunitní odpovědi, na níž se podílejí zejména TH2 lymfocyty a interleukin 4 (IL-4). Důsledkem jejich působení je transformace B lymfocytů na plazmatické buňky, které začnou tvořit specifické protilátky.

Adaptivní imunitní odpověď je velmi účinná při likvidaci patogenních mikroorganismů, vyžaduje však přípravnou fázi trvající 1–3 týdny. Tento typ imunitní odpovědi se proto uplatňuje hlavně v boji s infekcemi, které jsou závažné a/nebo trvají déle než týden. U infekcí, které postihují sliznice a nejsou spojené s poškozením hlubších tkání, nemá tento sofistikovaný způsob obrany zásadní význam.

Velkou předností adaptivní imunitní odpovědi je vytvoření imunologické paměti, která je dlouhodobá a svého nositele chrání před reinfekcí. U krátkodobě probíhajících slizničních infekcí však vytvoření dlouhodobé imunity není nutné, protože onemocnění není závažné. V těchto případech lidský organismus vystačí s vytvořením krátkodobé odolnosti zajištěné cestou trained immunity a cytotoxickými lymfocyty, které zůstávají v podslizničních lymfatických tkáních [42]. Tím jsou lidé po prodělání infekce chráněni před reinfekcí od osob ve svém bezprostředním okolí. Celá komunita se takto v krátké době promoří a virus se mezitím přesune do jiného segmentu populace.

Celkově působící adaptivní imunitu spojenou s tvorbou sérových protilátek je možné chápat jako náročný děj, který sice vytváří účinnější a dlouhodobější ochranu, ale na druhé straně vzniká relativně pomalu, je energeticky náročná (při výběru vhodných antigenních variant je nutné generovat množství buněčných klonů a většinu z nich zase zničit) a v neposlední řadě je i riskantní: při špatné koordinaci různých spolupracujících buněk hrozí selhání nebo naopak rozvoj přestřelené nebo špatně cílené reakce, které může vyústit do autoimunních a jiných imunopatologických stavů [43, 44]. U lehce probíhajících infekcí by přínos z tohoto zapojení adaptivní imunity nevyvážil její cenu a rizika.

 

 

MODIFIKACE ZÁNĚTLIVÉ ODPOVĚDI KORONAVIREM

SARS-CoV-2 disponuje celou řadou možností, kterými může oslabit a přesměrovat imunitní odpověď lidského organismu (tabulka 4). Schopnost tlumit imunitní odpověď mají i jiné viry (maskování cizorodé RNA, snižování účinnosti interferonové signalizace, inhibice apoptózy a podobně). SARS-CoV-2 se však odlišuje mimořádnou schopností měnit charakter zánětlivé odpovědi lidského organismu.

Obecně platí, že přirozenou odpovědí imunitního systému na virovou (intracelulární) infekci je rozvoj lymfoplazmocytárního typu zánětu, zatímco purulentní zánět s převažující aktivací polymorfonukleárů a komplementu se uplatňuje u bakteriálních infekcí, u nichž se mikrobi množí v mimobuněčném prostředí. SARS-CoV-2 však různými mechanismy nutí imunitní systém k neadekvátnímu typu odpovědi:

1. N protein se při infekci vytváří v nadbytku a z postižených buněk se uvolňuje do lymfy a do krve [30]. To vyvolává několikeré negativní důsledky:
   1. N protein působí jako solubilní faktor, který aktivuje komplement [46, 47] a podporuje vyplavení cytokinů spouštějících purulentní zánětlivou reakci;
   2. současně je takto podporován rozvoj protilátkové specifické imunitní odpovědi namísto buněčné odpovědi;
   3. protilátková odpověď se zaměřuje přednostně na tento protein, a méně na protein S. Protilátky proti N proteinu však na rozdíl od anti-S protilátek nejsou virus-neutralizační, nebrání viru v napadení cílových buněk.
2. Adheze viru k receptorům ACE2 má také specifické dopady. Prostřednictvím ACE2 mohou buňky různých tkání ovlivňovat intenzitu průtoku krve v dané oblasti. Podrobný popis těchto regulací přesahuje zaměření tohoto sdělení; zde je možné jen shrnout, že vyřazení většího počtu molekul ACE2 v důsledku virové infekce vede k posílení vlivu angiotenzinu I a II, a tedy k lokální vazokonstrikci a současně k podpoře purulentního zánětuc (viz schéma 1) [48, 49].
3. Virus inhibuje apoptózu, takže napadené buňky musejí být likvidovány NK buňkami nebo cytotoxickými lymfocyty; přitom dochází k uvolnění molekul, které působí jako DAMP (damage-associate molecular pattern), opět s akcentací pyogenní odpovědi.
4. Virové proteázy štěpí buněčný regulační protein, který ovlivňuje nasměrování imunitní odpovědi. Výsledkem je nadměrná sekrece IL-6 a dalších prozánětlivých cytokinů, které podporují rozvoj purulentního zánětu [51, 52].

Společným důsledkem jmenovaných dějů je špatné nasměrování imunitní odpovědi, která se zaměřuje proti bakteriálním a nikoli virovým patogenům. Tím je možné vysvětlit vysokou hladinu CRP a vysokou hodnotu poměru polymorfonukleáry/lymfocyty (NLR, neutrophil/lymphocyte ratio) v krvi nemocných se závažnou koronavirovou infekcí, a rovněž aktivaci endotelu a hemokoagulační kaskády, které se klinicky projevují sklonem k trombózám a dalším cévním komplikacím provázejícím covid-19.

Zmatení, které virus vyvolává, se však neomezuje jen na imunitní systém. Protože podle charakteru zánětlivé odpovědi jsou lékaři zvyklí volit poskytovanou léčebnou péči, vedly výše zmíněné nálezy laboratorních ukazatelů u nemocných s koronavirovou pneumonií k podezření na bakteriální infekci či superinfekci a ke zbytečnému používání antibiotik. Důsledkem pak byl nárůst antibiotické preskripce a následný vzestup rezistence různých bakterií v mnoha zemích světa [43]; tato problematika již přesahuje rámec tohoto sdělení.

Smysl popsaných manipulací viru s imunitním systémem je možné spatřovat v tom, že se takto usnadní dlouhodobá perzistence viru v disponovaných jedincích, tj. zejména u osob se závažnou poruchou získané imunity [86, 87]. Tito jedinci se pak stávají dlouhodobým zdrojem infekce pro své okolíd.

 

cPoznámka: Název„angiotenzin“ je poněkud zavádějící, protože navozuje dojem, že tento hormon reguluje pouze cévní tonus, a tak ovlivňuje krevní tlak. Ve skutečnosti je jeho působení daleko komplexnější a zahrnuje metabolické a protiinfekční vyladění jednotlivých tkání.

 

Tabulka 4. Modifikace imunitní odpovědi koronavirem
Table 4. Immune response modification by coronavirus

Virus narušuje rozpoznávací systémy	virové enzymy upravují virovou RNA tak, aby nebyla rozpoznána jako cizí [54, 55] množení viru probíhá ve výchlipkách endoplasmatického retikula a vezikulách (viz text), čili mimo dohled imunitního systému [56] virové enzymy inhibují vystavení virových antigenů na povrchu napadené buňky [57, 58]
Virus inhibuje tvorbu i účinky interferonu	virové proteiny N a M inhibují signální dráhy od PRR k tvorbě interferonů [33] virové proteázy štěpí buněčný regulační protein IRF3, který po aktivaci interferonem zprostředkuje antivirovou ochranu na buněčné úrovni [52, 57]
Virus inhibuje apoptózu napadené buňky	virus inhibuje signální dráhy vedoucí k apoptóze infikované buňky [51, 59]
Virus modifikuje průběh zánětlivé reakce	virové proteázy štěpí regulační proteiny podporující tvorbu interferonu; absence těchto proteinů způsobuje převahu pyogenní zánětlivé odpovědi [51, 52, 59]; destrukce buněk nesoucích ACE2 receptory podporuje rozvoj pyogenního typu zánětlivé reakce [49] virový N protein jako cizorodá bílkovina uvolňovaná do lymfy podporuje rozvoj protilátkové odpovědi místo rozvoje buněčné odpovědi [42, 45] virový N protein v krevním řečišti aktivuje komplement [46, 47] chaotická kombinace signálních podnětů přivádí T lymfocyty k apoptóze [57, 61]

PRRs (pattern recognition receptors) – receptory rozpoznávající patogeny na základě jejich charakteristických struktur, ACE2 – enzym konvertující angiotenzin
PRRs – pattern recognition receptors, ACE2 – angiotensin converting enzyme 2

 

 

POSTIŽENÍ DÝCHACÍCH CEST

Virus vstupuje do lidského organismu nejčastěji dýchacími cestami a postihuje sliznici nosohltanu [62]. Vstupní branou však mohou být i ústa nebo oči. Ve všech těchto sliznicích se vyskytují permisivní buňky vybavené ACE2 a pomocnými proteázami (furin, TMPRSS2) [63]. V epitelu dýchacích cest mají na svém povrchu nejvíce receptorů pro SARS-CoV-2 řasinkové buňky a pohárkové buňky, které tvoří hlen [64]. Velké množství permisivních buněk se však nachází i v epitelu ústní sliznice a ve slinných žlázách přítomných v ústní dutině, což koreluje s přítomností viru ve slinách [65]. V epitelu dolních cest dýchacích postupně ubývá počtu permisivních buněk, přičemž na rozdíl od nosohltanu existují velké interindividuání rozdíly; tím je možné vysvětlit rozdílnou interindividuální vnímavost k postižení dolních dýchacích cest [62].

Inkubační doba covid-19 se pohybuje v rozsahu 2–19 dní, s mediánem 6,6 dní. V souvislosti se vzájemnou kompeticí jednotlivých virových variant nepřekvapuje, že novější varianty mají průměrnou inkubační dobu kratší než varianty předcházející. U varianty omikron byla naměřena střední inkubační doba pouhých 3,4 dne [66].

Úvodní fáze infekce trvá několik dnů a klíčovou roli zde hrají mechanismy nespecifické (přirozené) slizniční imunity, tedy zejména interferony I a III typu (IFNα, IFNλ) a NK buňky. Později se začnou uplatňovat i cytotoxické lymfocyty. Tyto prostředky mohou samy o sobě stačit k odvrácení klinicky významné nemoci.

Skutečnost, že o průběhu infekce v této časné době rozhodují složky přirozené imunity a nikoli adaptivní imunity, má ještě další důsledky. Přirozená imunita je obecně méně fragilní než imunita adaptivní a není tolik dotčena podáváním cytostatik nebo HIV infekcí. Nepřekvapuje proto, že pacienti s defekty získané imunity nevykazují významně zvýšenou náchylnost k těžkému průběhu covidu-19 [67, 68].

Výsledek této fáze určují především tři faktory:
a) velikost infekční dávky (velikost expozice),
b) funkční stav respiračních sliznic a také
c) různé stresující vlivy.

ad a) Význam infekční dávky byl prokázán na lidských i zvířecích modelech [17, 69], přičemž nejde o nic neobvyklého: závislost průběhu infekce na dávce byla popsána i u chřipky nebo SARS [24]. O významu infekční dávky svědčí i klinická zkušenost z dob počátků pandemie: těžký průběh infekce, nezřídka se smrtelným zakončením, byl hlášen u zdravotníků v Číně i v severní Itálii, kteří pečovali o nemocné a sami se nechránili. Dodatečně provedené studie ukazují, že minimální infekční dávka se pohybuje v řádu stovek virionů [17, 70].

ad b) Funkční stav exponované sliznice je obtížněji popsatelný a kvantifikovatelný. Je pravděpodobné, že ke snížení odolnosti respirační sliznice vůči SARS-CoV-2 přispívá dehydratace nebo pobyt v prašném prostředí [71, 72]. Opět nejde o selektivní vztah ke koronavirové infekci; podobná souvislost byla zjištěna i u chřipky [73]. Na druhou stranu je pozoruhodné, že zvýšená náchylnost k těžkému průběhu covidu-19 nebyla pozorována u osob s chronickým postižením respiračních sliznic, jako jsou kuřáci nebo pacienti s cystickou fibrózou [74]. ad c) Vliv stresujících faktorů je obtížné objektivně prokázat, protože vnímání stresu je vysoce subjektivní a u různých jedinců se může značně lišit. Studie na toto téma nebyly publikovány, nicméně klinická zkušenost ukazuje, že mezi faktory, které negativně a přitom nespecificky ovlivňují imunitu, patří dlouhodobý strach/úzkost nebo nevyspání.

Jestliže standardní imunitní mechanismy dokáží zastavit replikaci viru ještě v časné fázi, je velmi pravděpodobné, že infekce proběhne inaparentně. Inaparentní průběh nastává přibližně u 30 % exponovaných osob, viz schéma 3 a tabulka 2.

 

 

dPoznámka: Je zajímavé, že hlavní dispozicí k perzistující infekci jsou závažné poruchy získané imunity, přitom ale perzistence viru není vázána na těžký průběh koronavirové infekce, covid-19 může probíhat i jako velmi mírné onemocnění. Tato pozorování potvrzují představu, že o klinické závažnosti covidu-19 rozhoduje stav přirozené slizniční imunity. Perzistující či rekurentní infekci při mírném průběhu onemocnění lze vysvětlit dobrou odpovědí na úrovni interferonu a NK buněk, která však sama o sobě nestačila na eliminaci infekce a nenavazovala ani na rozvoj kvalitní specifické imunitní reakce, která by infekci ukončila.

 

 

Tabulka 5. WHO klasifikace závažnosti onemocnění covid-19 u dospělých [101]Table 5. WHO classification of COVID-19 severity in adults [101]

Stupeň závažnosti onemocnění	Charakteristika	Definice
Mírné onemocnění	žádný zánět plic	symptomatičtí pacienti splňující definici případu pro covid-19 bez známek virové pneumonie nebo hypoxie
Střední onemocnění	pneumonie	pacienti s klinickými příznaky pneumonie (horečka, kašel, dušnost, zrychlené dýchání), ale bez známek těžké pneumonie; SpO2 činí ≥ 90 % při spontánní ventilaci
Těžká nemoc	těžká pneumonie	pacienti s klinickými známkami pneumonie (horečka, kašel, dušnost) a jedním z následujících: dechová frekvence >30 dechů/min; těžká respirační tíseň; nebo SpO2 < 90 % při spontánní ventilaci. Diagnóza může být stanovena klinicky. Zobrazovací vyšetření (RTG plic, CT, sonografie) může pomoci při diagnostice a identifikovat nebo vyloučit plicní komplikace. Stav vyžaduje podání kyslíku (oxygenoterapii).
Kritická nemoc	syndrom akutní respirační tísně (ARDS)	Rozvíjí se během 1 týdne od počátku pneumonie nebo se projeví jako nová anebo zhoršující se dušnost. Zobrazovací vyšetření plic ukáže noduly nebo bilaterální opacity, které nejsou vysvětleny objemovým přetížením ani kolapsem plicního parenchymu. Stav vyžaduje připojení na ventilátor.

(podle [101])
(according to [101])

 

 

Druhá fáze slizniční infekce je charakterizována rozvojem specifické imunitní odpovědi, kterou tvoří zejména cytotoxické lymfocyty a posléze i slizniční IgA protilátkye (sIgA) [75]. Význam sIgA pro ochranu sliznic je zřejmý již z faktu, že za klidových podmínek se v lidském organismu denně vytvoří více těchto protilátek než všech ostatních izotypů protilátek dohromady [76]. Brzy poté, tj. za 10–14 dnů od počátku nemoci, se začnou vytvářet i systémové (sérové) protilátky třídy IgA, IgG a někdy i IgM. Systémové protilátky však slouží hlavně jako ochrana proti virémii a postižení různých orgánů; pro zvládnutí slizniční infekce nemají velký význam [77].

Je důležité si uvědomit, že paralelně s popsaným posílením imunitní odpovědi se mohou prosazovat i virem indukované modifikace zánětlivé reakce. Hodně tedy záleží na tom, jestli se specifická imunitní odpověď rozvine dříve, než virus stihne uplatnit svůj destruktivní vliv [9]. V tomto ohledu se patogeneze covidu-19 významně liší od patogeneze chřipky, která takový potenciál nemá [79].

Příznaky v prvních dnech trvání nemoci jsou velmi variabilní a zahrnují vzestup tělesné teploty (horečku nebo subfebrilie), zimnice, kašel, dušnost, únavu, myalgie, svalovou slabost, bolest hlavy, ztrátu chuti nebo čichu, bolesti v krku, pocit ucpaného nosu nebo rýmu, nevolnost, zvracení a průjem [80]. Ačkoli se nemocný člověk během této fáze covidu-19 často cítí špatně a je vysílený, jde podle WHO klasifikace stále o málo závažný stav (tabulka 5). Kašel v této fázi je projevem bronchitidy, nikoli pneumonie.

Mírně probíhající covid-19 se odlišuje od jiných respiračních virových onemocnění jen v detailech, jako je delší inkubační doba, ztráta čichu a chuti, často kombinovaná se suchostí sliznice ústní dutiny (xerostomií), nebo neobvykle velká únavnost.

Při infekci způsobené původní variantou viru byla porucha čichu zjištěna u 41 % pacientů, porucha chuti u 38 % pacientů [81]. Jde o časný projev nemoci, u 27 % pacientů jde o první příznak počínající infekce [82]. Může být vysvětlena poškozením senzorických neuronů, které na svém povrchu nesou ACE2 receptory [83]. Podobně porucha chuti a xerostomie je zdůvodňována velkým množstvím ACE2 i proteáz na povrchu buněk chuťových pohárků a menších i větších slinných žláz [63].

Porucha čichu může provázet i virové respirační infekce jiné etiologie [81, 84], v těchto případech jsou ale obtíže způsobeny povšechným zánětem nosní sliznice. Při infekci způsobené SARS-CoV-2 jsou čichové buňky postiženy přednostně, proto je ztráta čichu při covidu-19 výraznější a přetrvává déle.

Velkou únavu udává 44–70 % pacientů; bohužel v různých studiích je únava definována různě, proto se údaje jednotlivých autorů mohou podstatně lišit [85]. Velká únava je zpravidla vnímána jako neobvyklá u respiračních infekcí, vyskytuje se však často po prodělání MERS, SARS, infekční mononukleózy, infekci virem HHV-6, infekci HIV, Q-horečce, hepatitidě B nebo rickettsiových infekcích [85], a také po brucelóze nebo břišním tyfu čili obecně po infekcích vyvolaných intracelulárně se množícími patogeny, které dokážou modifikovat standardní imunitní odpověď.

 

ePoznámka: Velikost produkce specifických sIgA a jejich účinek na sliznicích nekoreluje s hladinou specifických IgA v krvi. Obě tyto skupiny IgA protilátek se navzájem liší místem svého vzniku, svou funkcí i regulačními mechanismy, které řídí jejich syntézu. Zatímco sIgA zajišťují ochranu sliznic, sérové IgA mají především regulační úlohu při řízení rozsahu systémové protilátkové odpovědi. Není proto možné na základě měření hladin IgA v séru usuzovat na míru ochrany sliznic slizničními IgA protilátkami [77, 78].

 

POSTIŽENÍ TRÁVICÍHO TRAKTU

Příznaky postižení střevní sliznice nastávají při covidu-19 poměrně často a někdy mohou být dominantními projevy nemoci [88]. Procento osob, u nichž SARS-CoV-2 způsobil gastroenteritidu, však nebylo spolehlivě dokumentováno a v různých studiích je udáváno různě [89, 90]. Hlavní příčinou tohoto stavu je subjektivita při zjišťování dat. Nicméně zdá se, že virová RNA je alespoň krátkodobě přítomna ve stolici poloviny nemocných, kteří prodělávají covid-19 [89].

Koronaviry se mohou množit v enterocytech, protože enterocyty nesou na svém povrchu ACE2 receptory [91]. Avšak SARS-CoV-2 je obalený virus a obalené viry obvykle střevní infekce nevyvolávají, protože nejsou odolné k působení kyselé žaludeční šťávy. Odborná literatura pro tento rozpor nabízí dvojí vysvětlení:

1. Žaludeční pH sice nalačno klesá k hodnotám 1–2, což koronaviry usmrcuje, ale po jídle se pH zvyšuje až na hodnoty kolem 5, což virům dovoluje přežít, zejména jestliže jsou navíc ještě obaleny mucinem [92, 93];
2. Obal SARS-CoV-2 je odolnější vůči kyselému prostředí i vůči vyschnutí ve srovnání s jinými respiračními viry, pravděpodobně v důsledku zvláštní struktury M proteinu [94].

Virus tedy má potenciál k tomu, aby se přenášel alimentární cestou. Analogie existují i ve zvířecím světě, kde koronaviry vyvolávají enteritidy různých zvířat [89, 95–97].

Imunitní odpověď na střevní koronavirovou infekci nebyla podrobněji zkoumána, ale lze předpokládat, že bude obdobná jako při infekci respirační sliznice. K mírnějšímu průběhu střevního postižení v porovnání s respirační formou infekce zřejmě přispívá fakt, že střevní epitel se velmi rychle vyměňuje: doba života enterocytů činí jen 2–5 dnů.

Klinické projevy střevní koronavirové infekce odpovídají běžné virové gastroenteritidě a zahrnují nauzeu, zvracení, bolesti břicha, horečku, dyspepsie a průjmy. Tato forma koronavirové infekce není závažná a obvykle nevyžaduje hospitalizaci. S tím korelují histologické nálezy, podle nichž je střevní postižení omezeno jen na sliznici a není provázeno makroskopicky patrnými patologickými změnami [89].

Schopnost viru vyvolávat alimentární nákazy je tedy významná především z epidemiologického hlediska. Práce různých autorů ukazují, že SARS-CoV-2 se může šířit nejen vzdušnou, ale i klasickou fekálně-orální cestou [89, 97, 98]. Zároveň se tím naskýtá možnost sledovat šíření viru a jeho jednotlivých variant v různých regionech pomocí kvantitativního vyšetřování virové RNA v odpadních vodách [99, 100].

 

POSTIŽENÍ PLIC

K postižení plic zpravidla dochází nejčastěji 5.–8. den trvání nemoci [105]. Je důležité pochopit, že přestup infekce z dýchacích cest do plic není plynulý proces, jde o skokovou změnu charakteru nemoci.

Rozvoj pneumonie se klinicky projeví narůstající dušností, hyperventilací a poklesem saturace krve kyslíkem. Značná část nemocných však nepociťuje dušnost, navzdory narůstající hypoxii (silent hypoxia, happy hypoxia). Věrohodným vysvětlením tohoto jevu by mohla být porucha funkce karotických tělísek [106]. Tato porucha pravděpodobně souvisí se systémovou aktivací endotelu cév; histopatologicky ani geneticky totiž nebyla prokázána přítomnost viru v karotických tělískách [107].

Po několika dnech od zhoršení klinického stavu potvrdí diagnózu intersticiální pneumonie RTG nebo CT vyšetření plic [108, 109]. Z léčebného hlediska je klíčové, jestli se při rozvoji pneumonie udrží funkce plic (výměna plynů) nebo ne; podle toho se řídí indikace pro hospitalizaci a nutnost podpůrné léčby.

Nejpravděpodobnějším mechanismem přestupu infekce do plicního parenchymu je mikroaspirace sekretů z horních cest dýchacích [62]. Predisponující okolností může být nedostatečná sekrece INFλ [110], opožděný nástup aktivity TC lymfocytů [111] nebo opožděná či nedostatečná tvorba slizničních protilátek (mIgA); ve všech těchto případech jde v podstatě o vznik časového okna mezi působením přirozené a získané imunitní odpovědi.

Ať už je příčina přestupu infekce do plicního parenchymu jakákoli, nastává s touto změnou zcela jiná situace. Anatomická stavba plic je jiná, než jaká se vyskytuje v dýchacích cestách nebo ve střevním traktu. V plicích není sliznice ani podslizniční lymfatická tkáňf. Ochranu plicního parenchymu zajišťují především alveolární makrofágy, které při známkách poškození pneumocytů rozpoutají v daném místě zánětlivou reakci. Imunitní systém je přitom nastaven tak, aby mohl rychle rozvinout zejména antibakteriální složky obrany. Je to logické, protože bakteriální infekce ohrožují plicní tkáň častěji a vzhledem k velmi tenké bariéře mezi alveolárním prostorem a krevním řečištěm zde hrozí snadný přestup infekce do krve a rozvoj sepse.

Pneumonie způsobené SARS-CoV-2 se v několika aspektech liší od pneumonií způsobených chřipkou nebo jinými viry. V histologických preparátech jsou u jedinců zemřelých na koronavirovou pneumonii popisovány infiltrace plicního parenchymu polymorfonukleárními leukocyty a makrofágy, destrukce postižených tkání a následná fibrotická přeměna [114, 115], čili obraz purulentního zánětu – ačkoli ve tkáních nejsou přítomny bakterie ani houby. Stejný obraz purulentního zánětu ukazují i výsledky hematologických a biochemických vyšetření: leukocytóza s posunem doleva, lymfopenie, vysoký poměr PMN/lymfocyty, aneozinofilie, vysoká hladina CRP. Rozdíl proti nespecifickému bakteriálnímu zánětu spočívá jen ve zvýšené hladině laktátdehydrogenázy [109, 116, 117]. Purulentnímu typu zánětu odpovídá i vysoká sekrece prozánětlivých cytokinů (TNFα, IL-1, IL-6, IL-8 a dalších) [114, 118] a také vysoká hladina feritinu [119], který je důležitý při kompetici o ionty železa u bakteriálních infekcí, ale ne u infekcí virových. A naopak byla v plicní tkáni při covidu-19 zjištěna jen nízká tvorba interferonů I a III typu, ačkoli v analogické situaci u chřipky nebyla tvorba interferonů nijak omezena [120].

Z toho je zřejmé, že imunitní odpověď je v této fázi koronavirové infekce jiná než při infekci sliznic, je spjatá s jinou cytokinovou signalizací, a je dysregulovaná [121, 122]. Čím je tato dysregulace způsobena?

Z patogenetického hlediska je možné popsat vývoj postižení plicního parenchymu následovně: Nejprve jsou napadeny pneumocyty II typu, které na svém povrchu nesou nejvíce ACE2 receptorů [50, 64]. Hlavní funkcí těchto buněk je tvorba surfaktantu čili komplexu lipoproteinů, které snižují povrchové napětí a brání slepení stěn alveolů na konci výdechu. SARS-CoV-2 sice sám o sobě není cytopatogenní, ale infikované buňky jsou likvidovány apoptózou nebo prostřednictvím NK buněk či cytotoxických lymfocytů. V infikované tkáni tedy ustává tvorba surfaktantu [121] a to vede k značnému mechanickému namáhání plicního parenchymu. Pneumocyty I typu čili neinfikované buňky, které tvoří většinu alveolární výstelky, začnou v důsledku mechanického poškozovaní vysílat alarmující signály typu DAMP, a to způsobí rozsáhlou zánětlivou reakci, která je obecně namířena proti extracelulárním patogenům. Sbíhá se tu tedy několik vlivů, které všechny navádějí imunitní systém k purulentní odpovědi, přestože jde o virovou infekci (viz tabulka 4).

Poslední tři položky obsažené v tabulce 4 jsou přitom typické pro SARS-CoV-2, nevyskytují se například u chřipky, přinejmenším ne v takovém rozsahu. Bezprostředním výsledkem je zánětlivá exsudace do plicních sklípků [114] a rychle se zhoršující výměna plynů v plicích.

Postižení plic u covidu-19 může být velmi závažné, protože se zde sčítá velký rozsah zánětu, typický pro virové pneumonie, s purulentní zánětlivou odpovědí, která je vůči tkáním více destruktivní než lymfoplazmocytární zánět. Značně zvýšená permeabilita plicních kapilár se mimo jiné projevuje fibrinózním charakterem alveolárního exsudátu, což v pozdějších stadiích nemoci komplikuje hojení. Obnova plicních funkcí po prodělané koronavirové pneumonii je pomalejší než u pneumonií jiné etiologie a častěji vede k rozvoji plicní fibrózy [122, 123].

Na neadekvátní signalizaci a zapojení přirozené imunity navazuje nepřiměřená stimulace získané imunity. Je podporována zejména protilátková odpověď, přičemž se specifické protilátky tvoří v tradičním pořadí, tj. nejprve IgM a později IgG a IgA. Tvorba IgM je však málo přínosná, protože v této fázi ještě nedochází k virémii [124] a IgM protilátky se při likvidaci viru ve tkáních mimo krevní řečiště uplatní jen minimálně. Stále ještě jde o virovou infekci, která postihuje epitel, a nejvýznamnější složku obrany v této situaci představují cytotoxické lymfocyty. O omezené účinnosti protilátkové odpovědi v této situaci svědčí pozorování o neobvykle dlouhé perzistenci viru v postižené plicní tkáni u jedinců s těžkým průběhem covidu-19 [29, 125, 126].

Imunokompetentní jedinci jsou po prodělání pneumonie chráněni systémově působícími protilátkamig a paměťovými lymfocyty T i B řady před rekurencí pneumonie. To jim však nezaručuje ochranu před slizniční formou infekce a samozřejmě ani před infekcí způsobenou antigenně odlišnou variantou viru.

 

fPoznámka: V oblasti průdušek je poslizniční lymfatická tkáň přítomna jen v dětském věku (BALT, bronchus-associated lymphatic tissue) a v dospělosti prochází involucí. To je pravděpodobně jednou z příčin lehčího průběhu respiračních virových infekcí u dětí. K dalším příčinám patří nižší koncentrace ACE2 receptorů v horních dýchacích cestách dětí [112], vyšší aktivitu přirozené imunitní odpovědi, rychlejší schopnost regenerace a nižší výskyt metabolických poruch typu diabetes nebo obezita, které disponují k těžšímu průběhu koronavirové infekce [113].

 

SYSTÉMOVÉ DŮSLEDKY VYPLAVENÍ PROZÁNĚTLIVÝCH MEDIÁTORŮ: AKTIVACE ENDOTELU CÉV, HYPERKOAGULAČNÍ STAV A CYTOKINOVÁ BOUŘE

Aktivace cévního endotelu je přímo spjata s postižením plic. Bariéra mezi alveolárním prostorem a plicními kapilárami je extrémně tenká, což je za fyziologických okolností nezbytné pro snadnou výměnu plynů mezi vzduchem a krví. Při dysregulovaném purulentním zánětu postihujícím alveoly jsou prozánětlivými mediátory ovlivněny i přiléhající cévy [127]. Zvyšuje se tedy permeabilita plicních kapilár a dochází k aktivaci jejich endoteliálních buněk. Aktivované endotelie secernují von Willebrandův faktor, který spouští hemokoagulační kaskádu. Současně v krevním řečišti probíhají prozánětlivé děje, zejména aktivace komplementu a aktivace polymorfonukleárů, která vede k produkci volných kyslíkových radikálů (ROS, reactive oxygen species). Aktivované polymorfonukleáry, které nenacházejí fagocytovatelné bakterie, reagují vyvržením vlastního jaderného chromatinu (NETóza, neutrophil extracellular trapping), který slouží jako molekulární síť. Do sítí vytvořených z jaderného chromatinu i z narůstajících fibrinových vláken se zachytávají erytrocyty a trombocyty, a tak vznikají intravazální tromby. Vyplavený jaderný chromatin současně působí jako DAMP a podporuje prozánětlivý stav. V důsledku všech zmíněných dějů se zvyšuje náchylnost k trombózám a případně embolizacím, nejprve v kapilárách v postižených místech plic a posléze v celém krevním řečišti [114,128-130].

Je třeba zdůraznit, že trombofilní stav se tímto způsobem může vyvinout již ve stadiu počínající pneumonie. Není tedy nutně spojen se závažným nebo dokonce kritickým průběhem nemoci a nemusí být důsledkem přímého poškození endotelií. Přítomnost ACE2 receptorů na endoteliálních buňkách svádí k představě, že aktivace endotelu je způsobena přímým napadením těchto buněk koronavirem [130]. Ve skutečnosti existuje jen velmi málo dat podporujících tuto hypotézu; vyplavení prokoagulačně působících mediátorů je dostatečným důvodem [131, 132].

Z klinického hlediska je důležité, že k trombembolickým komplikacím může docházet i při standardní tromboprofylaxi [133–135]. Na druhou stranu, dysbalance koagulačního systému může vyústit i do opačného extrému, tj. krvácivých komplikací [134].

Několik autorů porovnávalo trombofilní stav při covidu-19 s diseminovanou intravazální koagulopatií (DIC), která provází sepsi, a případně i s dalšími koagulopatiemi (trombocytopenická purpura, trombotická mikroangiopatie, hemofagocytická lymfohistiocytóza). Dospěli k názoru, že trombofilní stav při covidu-19 se od ostatních jmenovaných koagulopatií odlišuje vysokou hladinou von Willebrandova faktoru, hemokoagulačního faktoru VIII a D-dimerů, a sníženou koncentrací aktivovaného proteinu C v krvi; naopak postrádá známky konzumpční koagulopatie, jako je snížená hladina fibrinogenu nebo trombocytopenie [128, 130, 136]. Další odlišnou vlastností koagulopatie u covidu-19 je skutečnost, že vychází z plicní tkáně. Někdy je proto popisována jako lokální, i když v důsledcích zasahuje celý organismus [137].

Závažný průběh onemocnění provázený hyperprodukcí prozánětlivých cytokinů a povšechnou endoteliální dysfunkcí se v literatuře často popisuje jako cytokinová bouře (cytokine storm). Někteří autoři toto pojmenování kritizovali s ohledem na to, že hladina cytokinů při covidu-19 nedosahuje úrovně, jaká bývá pozorována u sepse. Pro zdůraznění tohoto rozdílu navrhli zavést pro zánětlivou odpověď během covidu-19 označení „cytokinový vánek“ (cytokine breeze) [138, 139].

Hlavní odlišnost cytokinové odpovědi při covidu-19 v porovnání se sepsí však není kvantitativní, nýbrž kvalitativní. Dominantním mediátorem při rozvoji sepse je TNFα; jeho účinku jsou mimo jiné přičítány četné metabolické změny, které sepsi provázejí (proteokatabolismus, blokáda lipolýzy, blokáda glykolýzy na úrovni pyruvát-dekarboxylázy, nastavení glukózo-alaninového a glukózo-laktátového cyklu atd.). Při covidu-19 k těmto masivním zásahům do metabolismu nedochází. Jako hlavní cytokinový mediátor covidu bývá označován interleukin 6 (IL-6) a v aktivaci endotelu hrají významnou úlohu složky komplementu [132, 140–142]. Lze říci, že systémová aktivace endotelu doprovázející koronavirovou pneumonii napodobuje těžkou pyogenní infekci nebo sepsi. Závažnost a komplexita protiinfekční odpovědi je však při bakteriální infekci podstatně vyšší.

 

MULTIORGÁNOVÁ DYSFUNKCE

Multiorgánové postižení způsobené systémovou zánětlivou reakcí se u dospělých nemocných označuje akronymem MIS-A (multisystem inflammatory syndrome in adults) a u dětí MIS-C (multisystem inflammatory syndrome in children) nebo též PIMS (paediatric inflammatory multisystem syndrome). Definice MIS-A se vyvíjela postupně; v literatuře se nejčastěji setkáváme s definicí vytvořenou v CDC, USA [143].

Z výsledků tří metaanalýz je možné odvodit následující popis této klinické jednotky [144, 145]: Především se zdá, že MIS-A je vzácná komplikace, která byla dosud popsána jen u několika set pacientů. Její přesná incidence není známá, protože nepodléhá hlášení; je však  zřejmé, že se při porovnání s celkovou incidencí nemoci vyskytuje vzácněji než MIS-C u dětí.

MIS-A postihuje častěji muže (70–74 %), ve věku do 40 let. Většina postižených byla primárně zdravá, komorbidity byly popsány u 33–42 % postižených, nejčastěji šlo o obezitu (21–26 %). Příznaky MIS-A se objevují nejčastěji po 4 týdnech od kontaktu s infekcí [144], podle jiného vyjádření za 2–6 týdnů od začátku nemoci [145, 146]. Mezi hlavní postižené orgány patří plíce, srdce, ledviny, mozek, oči a kůže; nejčastěji je současně postiženo 4–5 orgánových systémů. Orgánové dysfunkce jsou běžně provázeny koagulopatií.

Příčinou MIS-A je pravděpodobně dysregulovaná specifická imunitní odpověď. Pro to svědčí pozdní výskyt příznaků, odpovídající době, kdy replikace viru by již měla být ukončena [144, 145], a rovněž negativita PCR testů detekujících SARS-CoV-2 a nepřítomnost INFα v krvi nemocných [147]. Nepřímým důkazem je i skutečnost, že výskyt MIS-A byl popsán nejen po onemocnění, ale i po vakcinaci proti covidu-19 [146]. O imunopatologické příčině MIS-A svědčí také fakt, že hlavní součástí léčby jsou kortikosteroidy, infuze imunoglobulinů nebo protizánětlivě působící monoklonální protilátky. Tato léčba je úspěšná, smrtnost se pohybuje na úrovni 5–7 % [144, 145].

Z patogenetického hlediska je důležité, že imunopatologické reakce mohou postihnout orgány, které nebyly přímo zasaženy virovou replikací. Virová RNA sice byla příležitostně prokázána post mortem v různých orgánech, zejména v srdci, ledvinách a mozku [148, 149], ale to ještě není důkazem infekce těchto orgánů. Mohlo se jednat o rozpadlé části viru, které byly do tkáně zaneseny hematogenně nebo prostřednictvím fagocytujících buněk. Vůbec už není možné považovat občasné nálezy tohoto typu za projev afinity viru k danému orgánu či tkánih. Dostupná data svědčí spíše o tom, že postižení těchto orgánů způsobené přímo virovou infekcí vznikají jen u nejtěžších forem covidu-19. Jenom při těchto stavech dochází pravidelně k virémii [124], která umožní diseminaci viru v organismu. Z téhož důvodu SARS-CoV-2 běžně nevyvolává infekci placenty a plodu [150].

 

gPoznámka: Lékaři mají často tendenci posuzovat sérologickou odpověď při covidu-19 podobně jako se běžně provádí u morbil, parotitidy, klíšťové encefalitidy a podobných infekcí. Zapomínají přitom, že u všech těchto nemocí dochází zcela pravidelně k virémii, a proto sérologická odpověď probíhá podle standardního schématu: nejprve tvorba IgM, která trvá krátce, a s několikadenním zpožděním tvorba IgG, která přetrvává dlouhodobě. Covid-19 je však primárně slizniční infekce, proto u nemocných s lehkým průběhem, jichž je většina, může být sérologická odpověď odlišná nebo i úplně chybět. Rozhodující úlohu má tvorba sIGA, tu však neumíme měřit.

 

LONG COVID, POSTCOVIDOVÝ SYNDROM

V literatuře je označován také akronymem PASC (post-acute sequelae of SARS-CoV-2 infection). Jde o nesourodý soubor obtíží, které přetrvávají po prodělaném covidu-19. Vzhledem k heterogenitě příznaků a absenci jednotící patogeneze nebyla přijata obecně uznávaná definice toho syndromu.

Klinické projevy zahrnují únavnost, kongitivní poruchy, neschopnost jasného myšlení (brain fog), změny nálady, slabost, úzkost, deprese, závratě, ortostatickou hypotenzi, artralgie a námahovou dušnost. Tyto obtíže se častěji vyskytují u žen a u starších, obézních a polymorbidních osob [151]. Klinický obraz v mnohých rysech připomíná chronický únavový syndrom (MEM/ CFS, myalgic encephalomyelitis/chronic fatique syndrome). Kromě zmíněných obtíží však mezi projevy long covidu patří i poruchy funkce různých vnitřních orgánů (srdce, plic, jater, pankreatu, ledvin, reprodukčních orgánů aj.), které nemusejí být subjektivně vnímány, ale mají velký vliv na zdravotní stav [151]. Tyto pozdní následky covidu-19 podle některých studií postihují více než 30 % nemocných [152, 153].

Časová hranice pro zařazení obtíží do kategorie long covid činí podle mnohých autorů 12 týdnů od prodělání nemoci [154, 155], avšak tento princip není chápán jednotně. Časový interval se někdy počítá od kontaktu s nákazou, jindy od počátku klinických projevů a v některých studiích také od propuštění z nemocnice [156]. Nicméně ani hranice 12 týdnů není univerzálně přijímána. Obtíže přetrvávající déle než 4 týdny jsou často považovány za post-covid nebo za long covid v širším smyslu, zejména když antigenní a PCR testy na přítomnost SARS-CoV-2 v dýchacích cestách vycházejí negativní [156, 157]. K problémům s časovým zařazením přispívá fakt, že obtíže mohou plynule přetrvávat po skončení aktivní infekce, mohou se však také rozvinout dodatečně po skončení nemoci anebo dokonce vzniknout po asymptomatickém průběhu infekce. Za těchto okolností není překvapivé, že údaje o incidenci této komplikace se v odborné literatuře liší o desítky procent.

Patogeneze long covidu je zjevně velmi různorodá. Mohou se na ní podílet organické změny způsobené nevratným poškozením tkání v období aktivní infekce i různé funkční poruchy. Příčinou chorobného stavu jsou nejspíše imunopatologické reakce, které vznikají zejména po opakovaných koronavirových infekcích v krátkém odstupu [158]. Podobnou antigenní stimulaci pravděpodobně může navodit i prodělání infekce s následným nebo těsně předcházejícím očkováním. Jako další možné příčiny byly navrženy: perzistence SARS-CoV-2 v dosud neurčených tkáních; reaktivace latentních infekcí (EBV, HHV-6); důsledek tkáňové ischemie v době aktivní infekce; změny střevní mikrobioty; mitochondriální dysfunkce způsobená vystupňovanou imunitní reakcí (stav napodobující sepsi); vedlejší účinky podávaných léků; sociální deprivace a emoční stres [151].

 

PŘÍČINY NEOBVYKLÝCH KOMPLIKACÍ COVIDU-19

Pohlížíme-li na covid-19 jako na virovou infekci, která postihuje především sliznice dýchacího traktu, je obtížné pochopit, jakým mechanismem vznikají u významného podílu nemocných závažné komplikace zmíněné v předchozích dvou kapitolách. Očekáváme, že tyto komplikace mají imunopatologický podklad, ale zároveň je zřejmé, že příčinou obtíží není nekróza buněk v postižených orgánech ani jejich zjevné morfologické poškození. Jde spíše o poruchu jejich funkce, sníženou výkonnost. Podstata těchto dějů se proto hledá na úrovni buněčného energetického metabolismu.

Jako možná příčina byla označena dysfunkce mitochondrií, které nejsou schopny zvýšit produkci ATP nad bazální hodnoty [159, 160]. Dalším kamínkem do mozaiky může být porucha metabolismu tryptofanu, způsobená zvýšenou aktivitou enzymu IDO2 (indolamin-2,3-dioxygenáza2). Tento enzym degraduje tryptofan na kynurenin a další metabolity, které působí na mitochondrie toxicky. Bylo zjištěno, že ve tkáních osob zemřelých na covid-19 je aktivita IDO2 neobvykle vysoká [161]. Kromě toho existuje ještě další možné vysvětlení, a sice porucha hormonální regulace v různých orgánech a tkáních, způsobená oslabením fyziologické role ACE2. Tento enzym působí jako receptor pro virus, jeho funkce může být tedy omezena jak přímo vazbou viru, tak i nepřímo, prostřednictvím imunitních reakcí, které jsou proti tomuto enzymu namířeny. Úloha ACE2 přitom spočívá nejen v regulaci místního prokrvení, ale i metabolismu a pohotovosti k rozvoji zánětlivé reakce (viz schéma 2). Význam ACE2 při ovlivňování aktivity tkání na lokální úrovni je dosud málo probádán. V tomto ohledu musíme konstatovat, že přes všechno dosavadní poznání zůstává naše vysvětlování komplikací covidu-19 na úrovni hypotéz.

 

hPoznámka: Z hlediska viru není postižení jiných orgánů nijak výhodné, protože virus, který zabloudí do krevního řečiště, se z organismu hostitele už nedostane ven a nenakazí další osoby. Je jistě teoreticky možné, že se někdy v budoucnu vyselektuje klon viru se speciálním způsobem vylučování a šíření (močí, žlučí a stolicí, slinami, potem, semenem nebo mateřským mlékem). Zatím se však zdá, že šíření respirační cestou je v naší civilizované a přelidněné společnosti nejefektivnější. Dosud není znám žádný selekční tlak, který by podporoval varianty viru napadající jiné orgány než dýchací cesty, plíce a střevo.
Pro virus je důležitá schopnost přesměrování imunitní odpovědi z„antivirové“ na„antibakteriální“, protože to umožní snáze uniknout imunitnímu dozoru. Těžký průběh nemoci způsobený imunopatologickými ději tedy může být chápán jako vedlejší důsledek virem nasměrované imunitní odpovědi.

 

ZÁVĚR

Z popsaných patogenetických souvislostí lze vyvodit následující teze:

• SARS-CoV-2 je respirační virus, který má podobnou patogenezi jako chřipka. Od virů chřipky a jiných respiračních virů se odlišuje zejména svou schopností modifikovat reakce imunitního systému. Ovlivnění imunitního systému se děje dvěma hlavními cestami. První je inhibice tvorby a působení interferonů I a III typu, která se uskutečňuje na několika úrovních. Druhá je falešné nasměrování imunitní odpovědi aktivací pyogenní zánětlivé reakce; v krajním případě se může objevit obraz připomínající sepsi.
  Zdá se, že hlavním smyslem této modifikace standardní imunitní protivirové odpovědi je vytvoření podmínek pro perzistenci viru v napadeném organismu. Tento vývoj nastává především u osob s preexistující poruchou získané imunity.
• Infekce vždy začíná na sliznici, přičemž průběh slizniční infekce rozhoduje o dalším vývoji onemocnění. Rozhodující vliv na průběh i prognózu infekce má časná fáze infekce, a při ní se uplatňují mechanismy přirozené imunity (interferony I a III typu, NK buňky).
  Při reinfekcích se zapojí i získaná imunita, ale stále platí, že rozhodující je první fáze onemocnění, která probíhá na úrovni sliznice; významnou roli pak mají slizniční paměťové cytotoxické lymfocyty a sekreční IgA protilátky. Mechanismy systémové imunity, zejména protilátky přítomné v krvi, jsou naopak při slizniční infekci jen málo využívány; jejich účinek ve slizničním kompartmentu je omezený a podmíněný rozvojem zánětlivé exsudace.
• Slizniční infekce může být velmi nepříjemná (vysoké horečky, slabost a další chřipkovité příznaky), ale tyto projevy nejsou ukazatelem závažnosti nemoci. Měly by být posuzovány jako projev boje organismu s patogenem; samy o sobě nejsou škodlivé, svědčí však o intenzitě tohoto zápasu a jsou důvodem k adekvátní rekonvalescenci po skončení infekce.
• Pneumonie se rozvine, když selžou výše zmíněné mechanismy slizniční imunity. Příčinou selhání mohou být získané i vrozené poruchy imunity týkající se organismu jako celku (včetně poruchy glykosylace proteinů, která je asociována s diabetem a obezitou, nebo dlouhotrvajícího stresu), ale také lokálně působící vlivy přímo poškozující respirační sliznici (prach, dráždivé látky obsažené ve vdechovaném vzduchu apod.). Další příčinou selhání slizniční imunity může být vysoká infekční dávka.
• Při pneumonii se zcela mění charakter nemoci. Kromě postižení plicního parenchymu dochází k vyplavení zánětlivých mediátorů do krevního řečiště, povšechné aktivaci cévního endotelu a prokoagulačnímu stavu. Doporučuji proto nepohlížet na pneumonii jako na komplikaci běžné koronavirové infekce, ale spatřovat v ní samostatnou klinicko-patologickou jednotku. Rozlišovali bychom pak dvě formy covidu-19: slizniční infekci a pneumonii. Je to podobná situace jako u infekcí způsobených Legionella pneumophila, kdy rozeznáváme mírnou formu (pontiacká horečka) a závažnou formu (legionelóza), kde dominuje pneumonie, ale přitom dochází k sekundárnímu postižení dalších orgánů, infekcí přímo nezasažených.
• Virémie se pravidelně vyskytuje jen u kriticky nemocných osob, jinak je výjimečná a pro virus neužitečná. Postižení jiných vnitřních orgánů než plic je obvykle navozeno imunopatologickými ději a neumíme ho predikovat. Jestliže vznikne, je to komplikace a ne forma nemoci.
• Postinfekční následky covidu (long covid) jsou projevem a/nebo následkem narušených imunitních a/nebo hormonálních regulací způsobených infekcí. Nejsou však projevem perzistující infekce. Čím déle covid-19 trvá, tím větší je pravděpodobnost těchto následků.

Poděkování
Autor děkuje RNDr. Daně Novákové z 2. LF UK a FN Motol za pomoc při vyhledávání zajímavých literárních zdrojů.

Prohlášení
Práce na rukopisu nebyla nikým sponzorována a nezakládá střet zájmů.

Do redakce došlo dne 18. 7. 2023.

Adresa pro korespondenci:
prof. MUDr. Jiří Beneš, CSc.
Klinika infekčních nemocí 3. LF UK, FN Bulovka
Budínova 67/2
180 81 Praha 8-Libeň
e-mail: benes.infekce@seznam.cz