Onychocola canadensis: prvé izoláty z onychomykóz na Slovensku

Overview

Onychomykózy na dolných končatinách patria medzi najčastejšie povrchové mykózy. Spektrum pôvodcov, najmä non-dermatofytov, je široké a pestré.

Počas 14 mesiacov (marec 2007 až apríl 2008) sa podarilo u štyroch pacientov mikroskopicky a kultivačne potvrdiť a zdokumentovať ako vyvolávateľa onychomykózy zriedkavo sa vyskytujúci druh Onychocola canadensis Sigler 1990. Na území Slovenska ide o prvé nálezy tejto mikromycéty. Autorky prezentujú skúsenosti s identifikáciou pomaly rastúcich, artrokonídiá produkujúcich izolátov.

Kľúčové slová:
Onychocola canadensis – morfológia kolónií – mikroskopická morfológia – onychomykózy.

Keď v r. 1990 Sigler a Congly [15] zaznačili prvé tri prípady autochtónnej onychomykózy spôsobené neznámou mikromycétou, podľa krajiny nálezu ju nazvali Onychocola canadensis. Hoci nové infekcie a objav teleomorfného štádia Arachnomyces nodosetosus Sigler et Abbott 1994 naznačovali, že huba sa vyskytuje typicky v Kanade, v rovnakom čase títo autori identifikovali izoláty O. canadensis pochádzajúce z autochtónneho prípadu onychomykózy na Novom Zélande [15]. Už v r. 1997 boli prvé infekcie zistené v Európe [2,3,11], ale podľa počtu publikovaných prípadov sa mykózy nechtov a kože nôh, spôsobené O. canadensis, vyskytujú mimoriadne zriedkavo [1,4,5,12,13,14,18,19].

V marci 2007 sme O. canadensis potvrdili v nechtoch na dolných končatinách u prvého pacienta v Slovenskej republike, a počas nasledujúceho roka (do apríla 2008) u ďalších troch osôb. V príspevku prezentujeme naše skúsenosti s identifikáciou tohto zriedkavého pôvodcu onychomykózy.

Materiál a metódy

Pacienti pochádzali z rôznych častí Slovenska:

3 ženy (vek 47, 52 a 61 rokov) a 54-ročný muž s niekoľko mesiacov až desiatky rokov trvajúcimi zmenami na nechtoch nôh (distolaterálna onychomykóza na palcoch alebo totálne postihnutie všetkých nechtov na oboch nohách). Vzorky (podnechtový drobivý až prachovitý keratín) z chorobne zmenených častí nechtov brali a zaslali na mykologické vyšetrenie ošetrujúci lekári.

Vzorky nechtov všetkých pacientov sme rutinne vyšetrili mikroskopicky v preparátoch prejasňovaných 20% KOH s Parker black ink ihneď po ich doručení. Kultivácia nechtovej drviny bola realizovaná na dvoch štandardných médiách (šikmý Sabouraudov agar Merck s 0,01 % chloramfenikolu „SAB”, a agar s 0,04 % aktidionu / cykloheximidu, Oxoid), najmenej po 20 inokúl z každej vzorky, inkubácia 5 týždňov pri teplote 25±1 ^oC v chladenom termostate.

V prípade rastu neznámych kultúr húb sme opakovali mikroskopické vyšetrenie pôvodnej vzorky a požiadali sme ošetrujúceho lekára o zaslanie nových vzoriek na potvrdenie pôvodcu onychomykózy. Podarilo sa to u 2 pacientov – avšak až po alebo počas liečby.

Štúdium izolátov neznámej mikromycéty. Vzhľad, farbu, rýchlosť rastu, veľkosť kolónií, primo- a sub-kultúr, sme sledovali v týždňových intervaloch počas 2 mesiacov pri raste na agaroch s aktidionom a bez aktidionu. Porovnali sme mikromorfológiu izolátov v rôznych časových intervaloch v preparátoch z kolónií (laktofenol s metylovou modrou) a v mikrokultúrach na troch médiách (Sabouraudov agar „SAB”, corn meal agar BBL „CMA“, a 2% vodný agar [3]. Overili sme ich rast pri 37 ^oC, ako aj schopnosť štiepiť močovinu (Christensen urea agar HiMedia, 25 ^oC, 14 dní) [10]. Diskovou metódou sme orientačne určili citlivosť izolátov na 6 azolových a 3 polyénové antimykotiká - postup podľa [21], pri dvoch inkubačných teplotách (37 ^oC a 25 ^oC).

Výsledky mykologického vyšetrenia nechtov

Vzorky nechtov troch pacientiek pri mikroskopickom vyšetrení obsahovali zhluky oválnych a súdkovitých hyalinných až žltohnedo zafarbených artrokonídií (niektoré boli usporiadané aj do retiazok), a dlhé alebo polámané septované, vetvené hyalinné hýfy, rôznej šírky - tenšie, „normálne“ i nerovnako zhrubnuté (obr. 1 a, b). Zhodné hubové elementy sme potvrdili aj pri opakovanej mikroskopii tej istej vzorky. Po 2 týždňoch na agare bez aktidionu, aj s aktidionom, začali rásť z inokulovaných častí nechtov drobné biele až bielo-žlté kolónie neznámej mikromycéty, od dvoch pacientiek masívne, od tretej z polovice inokúl. Mykologické vyšetrenie sme opakovali u jednej pacientky, žiaľ, až po 3 mesačnej liečbe terbinafinom (250 mg/deň): kultivačne – pôdy ostali sterilné, mikroskopicky – naďalej prítomné hýfy.

U 54-ročného muža, ktorý mal desiatky rokov trvajúce zmeny na nechtoch nôh, sme mikroskopicky našli ojedinelé hnedé artrokonídiá až pri opakovanom vyšetrení, realizovanom po 2 mesiacoch podávania p.o. terbinafinu. Napriek liečbe vyrástli rovnaké kolónie ako z prvej vzorky, a dokonca z väčšieho počtu inokúl.

Nijaké dermatofyty zo vzoriek nechtov týchto pacientov nevyrástli.

Morfológia izolátov

Pomaly rastúce kolónie neznámej mikromycéty na oboch kultivačných médiách (v skúmavkách) po 2 týždňoch pri 25 ^oC dosahovali 1 2 mm, po 3-4 týždňoch 2-7 mm, po 5-6 týždňoch 3 12 mm v priemere. Aktidion neobmedzil ich rast do plochy ale skôr rast vzdušného mycélia kolónií. Vzhľad kolónií sa s vekom menil: mladé – biele „vatovitejšie” na SAB agare, bielo-žlté „zamatové” na agare s aktidionom, polguľovite alebo kónicky vypuklé, 1-2,5 mm vysoké, spodná strana spočiatku bez pigmentu, neskôr od centra béžová. Po 4-6 týždňoch sa sfarbovali béžovo alebo žlto-sivo, spodná strana s hnedým až hnedo-sivým nedifundujúcim pigmentom (obr. 2 a,b). Subkultúry v Petriho miskách rástli rýchlejšie (8-18 mm/21 dní, po dvoch-troch mesiacoch dosahovali maximálne 15-23 mm v priemere). Kolónie, v centrálnej vyvýšenej časti mierne plstnaté, mali nižšiu zamatovú marginálnu zónu a krátko vláknitý laločnatý okraj. Staré kolónie radiálne i nepravidelne vrásnené, preliačené, praskajúce (vrátane agaru) v centre alebo i v okrajovej zóne, často s chumáčmi sekundárneho bieleho mycélia (obr. 3 a,b,c).

Mikromorfológia: preparáty v laktofenole pripravené z 2-týždňových izolátov a rovnako staré mikrokultúry na SAB agare obsahovali iba hyalínne septované hýfy.Na nutrične chudobných médiách (vodný a corn meal agar) už 7 dňové mikrokultúry začali produkovať vetvené „toruloidné” hýfy, ktoré sa následne menili na dlhé koherentné retiazky súdkovitých artrokonídií. Tie boli 1- až 2-bunkové, s hladkým povrchom, hyalinné, veľkosťou 3-4(-5)x5-7(-12) μm, a tvarom podobné ako artrokonídiá prítomné v nechtoch. V 4-týždňových a starších kultúrach sme nachádzali aj širšie, hrubostenné hnedé hýfy s nodulami melanoidného pigmentu na povrchu („nodózne hýfy”), niektoré sa v terminálnej časti špirálovite stáčali (obr. 4 a,b,c).

Iné znaky: Kultúry huby rástli pri 37 °C pomalšie než pri 25 ^oC. Izoláty produkovali ureázu (pri 25 ^oC za 10 až ≥14 dní) a tolerovali cykloheximid v médiu.

Identifikácia izolátov.

Na základe vyššie uvedených morfologických a iných znakov sme pomaly rastúce artrokonídiové izoláty identifikovali ako Onychocola canadensis Sigler 1990 [10, 16], anamorfné štádium askomycéty Arachnomyces nodosetosus Sigler et Abbott 1994 [15]. Druh bol v r. 2002 spolu s inými zástupcami tohto rodu zaradený do novo vytvoreného radu Arachnomycetales a čeľaďe Arachnomycetaceae [6].

Antifungálna citlivosť izolátov (disková)

Rast inokula pri 37 ^oC bol slabý, pomalý a pri uvedenej teplote testy neboli hodnotiteľné ani po 8 dňoch - pokusy sme preto anulovali. Pri teplote 25 ^oC bol nárast inokula zreteľný po 4-5 dňoch inkubácie na kontrolnej aj na testovacích platniach, a v tejto dobe sme vykonali meranie inhibičných zón (IZ). Všetky kmene boli citlivé na ketokonazol, mikonazol, klotrimazol, ekonazol a pimaricin (priemer IZ >40 mm), inhibičné zóny ostali čisté a rovnako veľké niekoľko dní po hodnotení IZ. Izoláty od všetkých pacientov sa naproti tomu javili rezistentné voči flukonazolu a itrakonazolu. Dva kmene vykazovali po 5 dňoch odolnosť aj voči amfotericinu B a nystatinu, no po predĺžení inkubačnej doby rástli až k diskom kolónie všetkých štyroch kmeňov.

Výsledky testov citlivosti pomaly rastúcich izolátov O. canadensis považujeme za orientačné, nakoľko počas dlhšej inkubácie existuje riziko zníženia stability antimykotika – napr. amfotericinu B. (Pozn. disky s terbinafinom nie sú dostupné, ciklopiroxolamin sme netestovali).

Diskusia

I keď je O. canadensis známa od r. 1990, doteraz bolo opísaných do 50 prípadov humánnych infekcií [1-5,9,11-16,18,19], dá sa však predpokladať, že niektoré ďalšie zverejnené neboli. O. canadensis bola zaznačená prevažne ako pôvodca onychomykóz na nohách. Niekedy sa u pacienta pridruží interdigitálna, plantárna, a výnimočne palmárna mykóza [3,4,16], a klinické prejavy imitujú epidermofýciu (tinea). Onychomykózy O. canadensis boli podľa niektorých autorov častejšie u žien, podľa iných u mužov, s prevahou u seniorov (70 97-ročných) s poruchami periférnej cirkulácie a rôznymi chronickými chorobami („onychomykózy starých ľudí”) [3,16,19]. U mladších, medzi ktorých patrili i naši pacienti, boli zaznačené zriedkavejšie. Viacerí pred vznikom infekcie prišli do kontaktu so zeminou, rastlinami, u iných sa táto súvislosť nepotvrdila. O. canadensis bola doteraz izolovaná iba z humánnych kožných vzoriek v miernom klimatickom pásme, a na objavenie habitatu v prírode ešte čaká [3,9,16].

V posledných rokoch boli opísané nové druhy rodu Onychocola príp. ich teleomorfy Arachnomyces (A./O. gracilis, A./O. glareosus, A./O. kanei, A. minimus, O. sclerotica) a prinajmenej jeden z nich - O. kanei – ako pôvodca onychomykózy. Druhy rodu Arachnomyces sú hetero- alebo homotalické; askomatá (kleistotéciá s typickými hnedými, v terminálnej časti stočenými setae), obsahujúce rozpadavé 8-spórové asky, sú produkované až po niekoľkých mesiacoch na prírodných substrátoch [6,7,8]. Izoláty z biologických vzoriek sú konídiové formy (anamorfy).

Pri zbežnej makroskopickej (rutinnej) prehliadke, bez podrobného overenia mikromorfológie, by mladé asi 2-týždňové kolónie O. canadensis mohli byť zamenené s Trichophyton verrucosum či „atypickým” T. rubrum (napr. rastúcim na kyslom médiu). Navyše, O. canadensis tieto dermatofyty pripomína aj rezistenciou voči aktidionu, a iné zasa produkciou ureázy. Podľa objaviteľov O. canadensis asimiluje 12 rôznych karbohydrátov a KNO₃, hydrolyzuje kazeín a tyrozín, ale nie xantín a hypoxantín, je citlivá na benomyl a neperforuje vlasy in vitro [16], tieto testy sme však neoverovali.

Výrazným znakom O. canadensis je pomalý rast kolónií, v porovnaní nielen s non-dermatofytmi ale i s väčšinou dermatofytov. Kolónie vyrástli rovnako veľké na médiu obsahujúcom aktidion, i na agare bez neho, pri teplote 37 ^oC bol rast pomalší, obmedzený.

Mladé (malé) kolónie obsahovali iba hyalinné hýfy, čím pripomínali T. rubrum. Pre O. canadensis typické dlhé retiazky súdkovitých artrokonídií boli produkované na SAB asi po 3-týždňoch, no rýchlejšie a hojne na nutrične chudobných médiách. To je v zhode s pozorovaniami objaviteľov druhu: „O.c. nemá špecifické požiadavky na živiny, ale lepšie rastie (a sporuluje) na médiách bez sacharidov” [16]. V starších kultúrach sme ako výrazný znak zaznačili aj spontánnu tvorbu širších hnedých„nodóznych hýf” [6,7]: na niektorých bola voľne stočená terminálna časť. V dobe tvorby týchto hýf sa zintenzívnila pigmentácia kolónií na žlto-hnedasto-sivé, a hnedla spodná strana. Až v tomto období boli kultúry dostatočne „zrelé” na identifikáciu.

Mikroskopicky treba kultúry O. canadensis odlíšiť od iných artrokonídiá produkujúcich mikromycét, napr. Scytalidium dimidiatum (Natrassia mangiferae)(rastie veľmi rýchlo, vyskytuje sa v tropických oblastiach), Arthrographis kalrae (termálne dimorfný druh, kolónie ostávajú svetlé, sú väčšie, rozšírenie celosvetové), ale tiež od Onychocola kanei a iných druhov tohto rodu (rastú pomaly, konídiácia pripomína chrysospóriové štádium Aphanoascus, doteraz raritné) [7,8,10] a i. 

Na rozdiel od dermatofytov, ktoré sú (považované za) univerzálne citlivé na antimykotiká určené na liečbu dermatofytóz, mnohé non-dermatofyty vykazujú in vitro rezistenciu voči viacerým antifungálnym látkam. Kmene O. canadensis Siglera a Conglyho boli citlivé na „obvyklé antimykotiká“ [16], s čím ale nesúhlasia zistenia iných. Izoláty od rôznych pacientov boli rezistentné proti grizeofulvinu (MIC >50 mg/liter), ciklopiroxolaminu (MIC >20 mg/L), znížene citlivé na ketokonazol (5 mg/L), citlivé na amorolfin (MIC 0,1-1,0 mg/L) a na terbinafin (0,8-1,0 mg/L) [3]. Naše orientačné testy potvrdili rezistenciu O. canadensis voči flukonazolu a itrakonazolu, ale i voči niektorým polyénom, a relatívne dobrú citlivosť na ketokonazol a topické azoly – tie však sú prakticky nepoužiteľné na liečbu mykóz nechtov na nohách. Tento fakt môže byť spoluzodpovedný za rozdielne výsledky (úspech, zlyhanie) liečby onychomykóz spôsobených O. canadensis [4,13,15].

Rovnako ako izoláciu iných non-dermatofytov aj nález O. canadensis ako pôvodcu onychomykózy je nutné potvrdiť opakovaným mykologickým vyšetrením nových vzoriek pacienta (časový odstup 1 a viac týždňov, neliečený pacient, kultivačne bez prítomnosti dermatofyta) [17]. Jednorazová izolácia ojedinelých kolónií onychokoly z dystroficky zmenených nechtov je považovaná za nevýznamnú, najmä ak sa mikroskopickým vyšetrením nechtov nepodarí potvrdiť relevantné hubové elementy [15]. Vzorky nechtov našich troch pacientiek obsahovali početné zhluky typických artrokonídií a hýf. U dvoch sa nález potvrdil masívnym, u zvyšných pacientov stredne masívnym rastom onychokoly, v jednom prípade sme hubu izolovali opakovane aj napriek začatej liečbe (terbinafin p.o.). Z dôvodu pomalého rastu kolónií, oneskorenej tvorby typických morfologických štruktúr, a aby bolo možné urobiť presný diagnostický záver, odporúča sa dobu kultivácie predĺžiť na 4 týždne [16).

I keď vyššie uvedené izoláty O. canadensis z nechtov štyroch pacientov označujeme za prvé diagnostikované na Slovensku, nedá sa vylúčiť, že huba bola už v minulosti izolovaná na našom alebo na iných pracoviskách klinickej mykológie (najmenej jeden podobný nález sme riešili pred rokmi, bez fotodokumentácie kultúr a pacienta). S týmto pôvodcom onychomykóz (dermatomykóz)treba na našom území rátať i naďalej.

Do redakce došlo 8.8.2008

Doc.RNDr. Anna Volleková, CSc,mim.prof.

HPL s.r.o.,

Istrijská 20

841 07 Bratislava

Slovenská republika

e-mail: vollekov@mail.t-com.sk