Imunofenotypizace průtokovou cytometrií v patologii

Průtoková cytometrie je moderní analytická metoda používaná v klinických i výzkumných laboratořích k imunofenotypizaci vybraných buněčných subpopulací v suspenzi (periferní krve, aspirátu kostní dřeně, mozkomíšního moku atd., ale i buněčné suspenzi získané z nefixovaného solidního tumoru). Poskytuje současně informace o četných povrchových nebo intracelulárních znacích analyzovaných elementů. V klinické praxi k tomu využívá fluorescenčních monoklonálních protilátek proti povrchovým nebo intracelulárním antigenům, které jsou asociovány s určitým typem buněk (T-lymfocyty, B-lymfocyty, apod.), jejím vývojovým stádiem nebo monoklonalitou (např. lehké řetězce povrchových imunoglobulinů).

Pravděpodobně nejširšího využití dosáhla metoda v diagnostice hematologických malignit, kde právě rychlá a přesná diagnostika dává lékaři stěžejní informace ke správnému stanovení diagnózy a k výběru optimální léčby, následně lze takřka v reálném čase sledovat efekt léčby.

Klíčová slova:
průtoková cytometrie – imunofenotypizace – non-Hodgkinské lymfomy

---

Průtoková cytometrie je laboratorní metoda používaná pro měření různých parametrů buněk. Jedná se o bioanalytickou metodu, která spojuje principy fluorescenční mikroskopie a hematologického analyzátoru. Je využitelná v mnoha vědeckých disciplínách. Největší uplatnění však našla v medicíně a biologii.

S myšlenkou průtokové cytometrie nás seznamuje v roce 1934 Andrew Moldavan, ovšem jeho prototyp zařízení nebyl nikdy sestrojen. Průtoková cytometrie se zrodila v roce 1949 díky Wallace H. Coulteru, který zkonstruoval přístroj schopný počítat krevní buňky v proudícím roztoku. Na principu Coulterova counteru vyvinul Mack Fulwyler a Marvin Van Dilla z Los Alamos National Laboratory první průtokový cytometr, který separoval částice podle jejich velikosti (1-4). Tento přístroj byl posléze zdokonalen doplněním detektorů fluorescence a byl představen Leonardem Herzenbergem a jeho pracovní skupinou ze Stanfordské Univerzity jako první funkční FACS (flurescence-activated cell sorter) (3,5).

PRINCIP METODY

Termín „průtoková cytometrie“ je používán od roku 1976. Cytometrie umožňuje analyzovat v krátkém čase velký počet částic a cytometrická data dovolují statistické zhodnocení jednotlivých buněčných subpopulací zejména podle relativní buněčné velikosti, granularity a intenzity fluorescenčního signálu pro různé testované vlastnosti díky použití vybraných specifických fluorescenčně značených protilátek (6-13).

Průtoková cytometrie funguje na principu hydrodynamické fokusace. Jednotlivé buňky v izotonickém roztoku (nosná tekutina, tzv. sheat fluid) protékají velmi tenkou tryskou do silnější kapiláry, kterou nosná tekutina proudí. Buňky usměrněné do tenkého proudu postupují jedna za druhou průtokovou komůrkou, kde protínají nejčastěji laserový monochromatický světelný paprsek. Částice fyzikálně lomí, odrážejí a rozptylují laserové světlo procházející optickou soustavou, jejímiž základními prvky jsou filtry propouštějící světlo o definovaných vlnových délkách (band pass, short pass a long pass filtry). Jednotlivé signály jsou převedeny na elektrické impulzy a zesíleny fotonásobičem (obr. 1) (7).

Měřenými parametry jsou zejména rozptyl světla v malém úhlu, tzv. „forward scatter“ (FSC – je přímo úměrný velikosti buněk) a rozptyl světla v úhlu 90°, tzv. „side scatter“ (SSC – je ovlivněn hlavně granularitou částic a členitostí buněčného jádra). Kromě těchto základních fyzikálních vlastností lze pomocí fluorescenčně značených protilátek rozlišovat buněčné subpopulace podle exprese povrchových i intracelulárních antigenů. Laserový paprsek excituje fluorochrom protilátky, tím je emitováno světlo o určité vlnové délce, které se skrz příslušné filtry optické soustavy dostává do příslušného detektoru fluorescence (obr. 1).

V současné době je na trhu k dispozici celá řada protilátek vhodných pro imunofenotypizaci průtokovou cytometrii. Jsou značené různými fluorochromy (např. námi nejčastěji používané: FITC, PE, PerCP-Cy5.5, PC7, APC, APC-Cy7, PB aj.), čímž je zaručena kombinovatelnost protilátek proti různým antigenům v jednom vzorku. Díky vícebarevnému značení je možné snáze posoudit případnou aberantní koexpresi vyšetřovaných znaků. Velkou výhodou multiparametrické průtokové cytometrie je možnost rozlišení i minoritních buněčných subpopulací.

Většina monoklonálních protilátek je zaměřena proti antigenům krevních buněk. Lze však imunofenotypizovat i nehematologické buňky. Cytometricky je rovněž možné zjišťovat přítomnost intracelulárních virů (např. HIV-1, CMV nebo EBV) (14-16), existují také monoklonální protilátky k identifikaci bakterií a parazitů (15).

V diagnostice lymfoproliferativních onemocnění se s výhodou využívá také analýza DNA. Metoda je založená na schopnosti některých barviv vázat se stechiometricky na nukleové kyseliny       (např. propidium jodid (PI), DAPI aj.). Buňky obarvené těmito barvivy po ozáření světlem o příslušné vlnové délce emitují světlo jiné vlnové délky. Pokud je barvivo podáno v nadbytku, je intenzita fluorescence jednotlivých buněk přímo úměrná obsahu DNA v buňce. Cytometrista díky ní rozpozná, zda jsou vyšetřované buňky diploidní nebo je přítomen určitý podíl buněk aneuploidních. Analýza DNA navíc umožňuje rozlišit podíl proliferujících buněk – ať už diploidních nebo aneuploidní frakce – tzn. buněk v S a G2/M fázi, čímž je metoda nápomocná v rozlišení nízce maligních a vysoce maligních procesů (obr. 2).

Z dalších možností uvádíme alespoň některé příklady uplatnění: stanovení funkční aktivity leukocytů, průkaz protilátek, analýza apoptózy, průkaz intracelulárních cytokinů nebo stanovení intracelulárního vápníku. Některé vyšetřovací postupy jsou rutinně využívány v klinických laboratořích, jiné nalézají své uplatnění především v laboratořích výzkumných (tab. 1).

VYŠETŘOVANÝ MATERIÁL

Metodou průtokové cytometrie lze imunofenotypizovat buňky v suspenzi. Nejčastěji bývá vyšetřována periferní krev, aspirát kostní dřeně, event. mozkomíšní mok a další buněčné suspenze. Je však velmi důležité vyšetřit také nativní bioptické vzorky solidního nádoru a stanovit imunofenotyp nádorových buněk. Poté je daleko snazší identifikovat i malé subpopulace nádorových buněk v rámci stagingu a restagingu. Nativní bioptický vzorek je neprodleně po odběru doručen do laboratoře a zpracován do buněčné suspenze buď mechanickou homogenizací nebo enzymatickým trávením.

CYTOMETRICKÁ DATA

Počítačové zpracování naměřených dat umožňuje získat imunofenotyp jednotlivých buněčných subpopulací. Výstupem měření jsou výsledky v grafické a číselné podobě. Ke grafickému zobrazení naměřených dat se používají jednak jednoparametrické histogramy, kde na ose x znázorňujeme intenzitu signálu a na ose y množství buněk (obr. 2) nebo dvouparametrické grafy – „dot-ploty“ – kdy na ose x je vynesena intenzita jednoho a na ose y intenzita druhého signálu. Množství buněk potom odpovídá hustotě zobrazených bodů v grafu, jelikož každý zobrazený bod v dot-plotu představuje změřenou buňku (obr. 3).

V dot-plotech můžeme zobrazit jednak buňky dle velikosti a granularity nebo podle intenzity fluorescenčního signálu, na základě čehož získáváme informace o přítomnosti či absenci vyšetřovaných antigenů. V rámci analýzy cytometrických dat je možné analyzovat vybrané buněčné subpopulace a jiné z analýzy „vypnout“. Proces vybírání buněčné subpopulace, kterou dále charakterizujeme z hlediska exprese námi testovaných znaků, označujeme „gatování“. Údaje získané měřením jsou archivovány v elektronické podobě.

VYUŽITÍ METODY V PATOLOGII

Imunofenotypizace hematologických malignit, která je nejhojněji využívanou analýzou průtokové cytometrie, je prováděna pod záštitou různých klinik, oddělení a ústavů. Komplexní diagnostika hematologických malignit zahrnuje širokou paletu vyšetření, které dohromady skládají informace vedoucí k identifikaci a klasifikaci onemocnění. Cílem vyšetření je zjistit maximum validních informací o expresi diagnosticky relevantních markerů.

Na našem pracovišti se nejčastěji setkáváme s diagnostikou non-Hodgkinských lymfomů. Pro diagnostiku Hodgkinských lymfomů není metoda průtokové cytometrie vhodným nástrojem, jelikož diagnostické buňky se ve tkáních nachází v minimálním množství a jsou při analýze snadno přehlédnutelné, event. se v buněčné suspenzi nevyskytují vůbec, díky limitaci metody při přípravě buněčné suspenze.

Non-Hodgkinské lymfomy jsou odvozené od B-lymfocytů, T-lymfocytů nebo vzácně z NK buněk (17). Každá skupina je představována řadou nozologických jednotek, jejichž hranice nejsou vždy ostře vyjádřeny, mnohá onemocnění se pak mohou transformovat a poté mění své biologické i klinické charakteristiky.

B-NHL

WHO klasifikace rozděluje B-NHL na lymfomy vycházející z prekurzorů B-řady a lymfomy vznikající ze zralých periferních B-lymfocytů. Jednotlivé B-NHL jsou dále do daných kategorií zařazeny na základě kombinace morfologických, imunofenotypických a molekulárně-genetických vlastností nádorových buněk současně s klinickými charakteristikami choroby. Na obr. 4 je znázorněn přehled nejčastějších typů B-NHL a základní zjednodušené schéma jejich imunofenotypizace pomocí FACS.

Cytometrická diagnostika B-NHL ze zralých B-lymfocytů se opírá zejména o průkaz monoklonální populace pomocí stanovení exprese lehkých povrchových řetězců imunoglobulinů kappa nebo lambda. Cytometrické vyšetření klonality vychází ze znalosti fyziologického poměru lehkých povrchových řetězců kappa a lambda, který je 3 : 2. Pokud je tento poměr signifikantně narušen, nález nasvědčuje přítomnosti klonální populace zralých B-lymfocytů. Pro diagnostiku B-NHL ze zralých B-lymfocytů je průtoková cytometrie vysoce spolehlivá a je účinným nástrojem pro rychlé stanovení diagnózy.

T/NK-NHL

Stejně jako B-NHL, vznikají i T/NK-NHL z prekurzorových a zralých T-lymfocytů event. NK buněk. V případě diagnostiky T/NK-NHL je však rozpoznání nádorových buněk komplikovanější a cytometrista se snaží nádorové buňky hledat podle případného aberantního imunofenotypu. Není však pravidlo, že by se nádorová buňka musela vyznačovat aberantní koexpresí vyšetřovaných znaků. Pro T/NK-NHL může být cytometrie vhodnou diagnostickou metodou právě v případě, že je zjištěna přítomnost aberantního imunofenotypu.

ZÁVĚR

V případě, že lékař-patolog disponuje metodou průtokové cytometrie, otevírají se mu nové možnosti diagnostiky. Na základě peroperačního vyšetření může indikovat potřebná vyšetření, tedy i imunofenotypizaci průtokovou cytometrií. Předností cytometrické analýzy je její rychlost. Již za dvě hodiny může znát první výsledek. I v případě, že z výsledků průtokové cytometrie nelze vždy jednoznačně určit diagnózu, její velký význam spočívá v tom, že může směrovat další kroky patologa ve vyšetřovacím postupu. Další její velkou výhodou je, že v případě průkazu přítomnosti nádorových buněk s určitým imunofenotypem (obr. 5), je průtoková cytometrie vhodným nástrojem při stagingu a restagingu onemocnění. Lze snáze identifikovat minoritní populace nádorových buněk, které by mohly být pod hranicí mikroskopické detekce.

Každá vyšetřovací metoda má své výhody a své limitace (18,19). Pro určení správné diagnózy je na místě dostupné vyšetřovací metody kombinovat a interpretovat získané výsledky po vzájemné korelaci nálezů. Jelikož patolog dovede nejlépe posoudit reprezentativnost odběru pro konkrétní vyšetření, je vhodné doporučit spolupráci cytometristy s patologem při zajištění dělby vzorků.

PODĚKOVÁNÍ

Podpořeno projektem (Ministerstva zdravotnictví) koncepčního rozvoje výzkumné organizace 00064206 (FN MOTOL).

Adresa pro korespondenci:

RNDr. Petra Manďáková, Ph.D.

Ústav patologie a molekulární medicíny, 2. LF UK a FN v Motole

V Úvalu 84, Praha 5, 150 06

tel.: 2 2443 5658, 5644; fax: 2 2443 5620

e-mail: p.mandak@email.cz