Vývoj antibiotické mikrobiální rezistence – prevalence bakteriálních kmenů v moči

Overview

Cíl: Rozvoj antibiotické mikrobiální rezistence (AMR) se stal globálním problémem, nicméně lokální epidemiologická situace se doposud významně liší napříč kontinenty, státy, ale i zdravotnickými zařízeními. Lokální vyhodnocení vývoje antibiotické rezistence je jeden z nezbytných nástrojů v boji s šířením další rezistence. Cílem naší práce je zhodnotit výskyt rezistentních močových kmenů, analyzovat vývoj rezistence a porovnat AMR na jednotkách intenzivní péče (JIP) a standardním oddělení urologie.

Materiál a metody: Analyzovali jsme AMR močových kmenů v našem zdravotnickém zařízení v letech 2013–2020. Hodnotili jsme citlivost bakteriálních kmenů na různá antibiotika a porovnávali AMR na jednotkách intenzivní péče a standardním oddělení urologie. Vyhodnotili jsme trend růstu počtu enzymaticky podmíněných rezistentních kmenů v čase, konkrétně kmeny produkující širokospektrou beta‑laktamázu (ESBL), bakterie produkující beta‑laktamázu Ampicilin C (AmpC), kmeny produkující karbapenemázy (CPE), vankomycin rezistentní enterokoky (VRE) a kmeny meticilin rezistentního Staphylococcus aureus (MRSA).

Výsledky: Celkem bylo vyhodnoceno 35 831 pozitivních kultivačních nálezů. Zaznamenali jsme celkem 4 114 rezistentních kmenů (11,5 %). Nejčastěji jsme detekovali ESBL kmeny (7,8 %), kdy od roku 2013 do roku 2015 se rezistence téměř zdvojnásobila (5,6 % resp. 10,3 %). Přijatá preventivní opatření vedla k poklesu růstu rezistence, nicméně šance výskytu rezistence zůstává i v dalších letech v porovnání s rokem 2013 vyšší (maxOR: 1,93, 95 % CI; 1,64–2,27). Nárůstem VRE kmenů v posledních třech letech a CPE kmenů v posledním roce (0,3 %) může být ohrožena účinnost jedné z posledních skupin antibiotik. Antimikrobiální rezistence, konkrétně na beta‑laktamová antibiotika, byla na JIP signifikantně vyšší ve srovnání se standardními odděleními (p < 0,00).

Závěr: Hodnocená data prezentují vývoj AMR. Minimálně každý 10. pacient léčený pro infekci močových cest (IMC) v našem zdravotnickém zařízení trpí rezistentní infekcí. Výskyt nových typů antimikrobiální rezistence, které dříve nebyly v našem zdravotnickém zařízení pozorovány, je vážnou hrozbou.

Klíčová slova:

ESBL – MRSA – Antibiotická mikrobiální rezistence – AmpC – CPE – VRE

ÚVOD

Účinná terapie infekcí včetně infekcí močových cest se stává stále obtížnější. Problém antibiotické rezistence může dle některých predikcí vést až ke globální krizi s potenciálem zlikvidovat zdraví celosvětové populace. Některé předpovědi dokonce uvádějí, že do roku 2050 se infekce může stát hlavní příčinou úmrtí ve světě. Problémem nebude jen léčba vlastní infekce, ale například schopnost podstoupit dnes zcela běžný operační výkon, který může být v budoucnu bez účinné antibiotické profylaxe pro řadu pacientů fatální. Již v dnešní době byly ve světě zaznamenány zcela rezistentní bakterie odolné vůči všem známým antibiotikům (1). Dle WHO (World Health Organization) antibiotická rezistence způsobuje každoročně více než 500 000 úmrtí ve světě, včetně více než 200 000 úmrtí kojenců. Dle zprávy CDC (Centers for Disease Control and Prevention) se v USA každoročně vyskytne více než 2,8 milionu infekcí rezistentních na antibiotika a následkem toho zemře více než 35 000 lidí.

Historicky úspěšná léčba gramnegativních infekcí močových cest založena na terapii aminopeniciliny se stala neúčinnou v důsledku bakteriální produkce beta‑laktamázy označované zkratkou ESBL (Extended Spectrum Beta‑Lactamase). Možnou terapií ESBL kmenů se stalo podání aminoglykosidů – často neúčinného gentamicinu či efektivního toxičtějšího amikacinu nebo užití karbapenemů – meronemu, imipenemu a méně účinného ertapenemu. Přes vývoj nových antibiotik se problém mikrobiální rezistence nepodařilo odstranit a naopak důsledkem selekčního tlaku antibiotik se ve stále větší míře objevují bakterie štěpící nejen běžná beta‑laktamová antibiotika, ale i cefalosporiny vyšších generací a dokonce i karbapenemy (2). Jak sledujeme nárůst výskytu ESBL rezistentních kmenů v posledních deseti letech, můžeme za další roky sledovat stejný nekontrolovatelný výskyt kmenů produkujících karbapenemázy s rezistencí na záložní meronem či imipenem. Nejčastěji se vyskytují karbapenemázy třídy A (celkem šest různých skupin), například KPC (Klebsiella pneumonie carbapenemase) (3) a dále roku 2009 nově detekovaný typ NDM-1 (New Dehli metallo‑beta‑lactamase) (4), který se nejspíše rozšířil z oblasti Dillí v Indii. Na konci roku 2012 vědci objevili varianty NDM-1 rezistence ve 42 druzích bakterií v celkem 55 zemích.

V případě rezistence bakterií na karbapenemy máme dále terapeuticky jen omezené možnosti, lze uplatnit tigecyklin a zejména kolistin (5), často označovaný jako antibiotikum poslední volby, na který bohužel důsledkem jeho užití v krmivech pro zvířata vznikla rezistence také. Objevení MCR-1 (mobilized colistine resistance) genu vedlo čínskou vládu v roce 2017 k zákazu podávání kolistinu do zvířecích krmiv. Gen, původně lokalizovaný na Čínu, byl od roku 2016 zaznamenán ve 30 zemích na 5 kontinentech. Vznikem plasmidem zprostředkované rezistence MCR-1 byla dotčena účinnost poslední skupiny antibiotik (6).

Odpovědnost za selektivní výhodu, jakou je rezistence na antibiotika, má extrachromozomální molekula DNA-Plasmid (R‑faktor), objevena japonskými vědci již v roce 1959. Teprve o několik let později byla opět v Japonsku detekována bakterie s rezistencí na dvojkombinaci antibiotik. V ten okamžik nikdo netušil, o jak zásadní problém se jedná. Následné zjištění, že rezistence se neposouvá jen vertikálně napříč generací, ale i horizontálně mezi různými druhy bakterií v rámci jedné generace, bylo šokující (7).

CÍLE STUDIE

Primární: vyhodnotit prevalenci rezistentních kmenů v jednotlivých letech a posoudit trendy vývoje rezistence v čase.

Sekundární: vyhodnotit rezistenci k testovaným antibiotikům a porovnat ji na jednotkách intenzivní péče a standardním oddělení urologie.

MATERIÁL A METODY

Retrospektivně jsme z databáze zhodnotili 115 058 močových izolátů odebraných v letech 2013–2020. Z těchto izolátů bylo získáno 35 831 bakteriálních kmenů, které jsme analyzovali. V hodnocení nebyly duplikované nálezy a rezistentní kmen se v daném roce neopakoval. Analýzou jednotlivých bakteriálních kmenů v jednotlivých letech jsme zhodnotili vývoj AMR v čase.

Pro vyhodnocení jsme definovali konkrétní rezistence:

◼ kmeny širokospektré beta‑laktamázy (Extented Spectrum Beta‑lactamase – ESBL)

◼ bakterie produkující beta‑laktamázu Ampicilin C (Beta‑lactamase AmpC)

◼ kmeny produkující karbapenemázy (Carbapenemase producing Enterobacteriaceae – CPE)

◼ vankomycin rezistentní enterokoky (Vancomycin‑resistant Enterococci – VRE)

◼ meticilin rezistentní Staphylococcus aureus (Methicillin‑resistant Staphylococcus aureus – MRSA)

K analýze jsme použili elektronickou databázi Oddělení klinické mikrobiologie. Hodnotili jsme všechny pozitivní močové kultivační nálezy kmenů Echericha coli, Klebsiella (pneumonie, oxytoca, variicola, ornithiolytica, planticola, ozaenae, rhinoscleromatis, terrige, species), kmeny Enterobacter (cloacae, kobei, asburiae, hormaechei, ludwigii, bugandensis, dissolvens, sakazakii, species), kmeny Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Morganella morgani, Serratia marcescens, kmeny Citrobacter (species, brakii, farmeri, freundi, gilleni, koseri, rodentium, sedlakii, youngae), kmeny Providentia (stuartii, rettgeri) a kmeny Acinetobacter (species, baumanii, calcoaceticus, haemolyticus, johnsonii, junii, lwoffii).

Bakteriální kmeny byly testovány antibiotiky: ampicilin, amoxilicin‑klavulanát, cefuroxim, cefotaxim, ceftazidim, cefepim, gentamicin, amikacin, ciprofloxacin, nitrofurantoin, suflomethoxazol‑trimetoprim, meronem, kolistin, oxacilin, vankomycin, linezolid, piperacilin‑tazobaktam a tigecyklin.

Ve druhé části naší práce jsme určili reálnou rezistenci konkrétních antibiotik napříč celou populací bakteriálních močových kmenů v průběhu osmi let. Následně jsme porovnali, zda se rezistence jednotlivých antibiotik či skupin antibiotik signifikantně liší na standardním oddělení a jednotkách intenzivní péče. Nakonec jsme porovnali i vývoj rezistence jednotlivých antibiotik v čase na jednotkách intenzivní péče, urologie a ostatních standardních odděleních.

STATISTIKA

Výsledky uvádíme jako počet, %. Pro posouzení statisticky signifikantního rozdílu ve výskytu rezistence jednotlivých antibiotik mezi standardním oddělením a JIP jsme použili Pearsonův‑chí kvadrát test, hladinu významnosti jsme stanovili na 5 %. Dále jsme zhodnotili vývoj šance výskytu rezistence v čase (OR).

ETICKÉ ASPEKTY

Jedná se o retrospektivní zhodnocení sekundárních dat, souhlas EK není vyžadován.

VÝSLEDKY

Analýza dat prokázala 31,1 % pozitivních močových nálezů. Nejčastěji byly zastoupeny kmeny bakterie E. coli (48,7 %), Klebsiella sp. (14,8 %), Enterococcus faecalis (14,3 %), zastoupení ostatních kmenů prezentuje tabulka 1.

V hodnoceném souboru jsme zaznamenali 4 114 rezistentních kmenů, celkem 11,5 % IMC tak bylo způsobeno jednou z definovaných rezistencí (ESBL, AmpC, CPE, VRE, MRSA). Dle našich zjištění, některé bakteriální druhy obsahují více než 30 % rezistentních kmenů, nejvíce Morganella morganii (51,6 %). Velmi rizikovou bakterií je Klebsiella sp., jejíž výskyt je hned na druhém místě za E. coli a zároveň produkuje až 34,4 % rezistentních kmenů, a to jak ESBL, tak AmpC či CPE. Zastoupení jednotlivých typů rezistencí u ostatních bakterií dále prezentuje tabulka 1.

Nejčastějším typem rezistence našeho zdravotnického zařízení byla ESBL, tuto rezistenci mělo 7,8 % močových kmenů. Prudký a největší nárůst ESBL rezistence jsme zaznamenali v letech 2014–2015, během dvou let od roku 2013 se výskyt ESBL kmenů téměř zdvojnásobil (graf 1). Následná reakce a protiepidemická opatření zdravotnického zařízení vedly v dalších letech k poklesu rezistence, přesto šance výskytu ESBL rezistence v porovnání s rokem 2013 zůstává v dalších letech vyšší (maxOR: 1,93, 95 % CI; 1,64–2,27) (graf 1). Nejčastější bakterií produkující širokospektrou beta‑laktamázu je Klebsiella sp. se zastoupením ESBL kmenů až ve 42,5 % v roce 2015, šance na rozvoj rezistence u této bakterie v porovnání s rokem 2013 roste také (maxOR: 2,99, 95 % CI; 2,33–3,84).

Kompletní hodnocení vývoje jednotlivých rezistencí v čase prezentuje tabulka 2. Kmeny CPE se do roku 2013 v našem zařízení nevyskytovaly, nyní pozorujeme jejich trvalý růst, a to zejména v posledních letech. Stejný trend jsme zaznamenali i v případě VRE.

Souhrnnou rezistenci testovaných antibiotik za celých osm let napříč celou populací močových kmenů podrobně uvádí tabulka 3. Nulovou rezistenci zatím vykazuje pouze jediné antibiotikum – linezolid, testovaný spolu s tigecyklinem a vankomycinem u gram‑pozitivních bakterií. Nejvyšší rezistenci z gram‑pozitivních bakterií vykazuje E. faecium (rezistence na tigecyklin 1,2 % a vankomycin dokonce 7,4 %). U gram‑negativních bakterií je velmi znepokojivá rezistence na kolistin, a to konkrétně u P. aeruginosa a Acinetobacter sp. (4,4 %), u kterých jsme současně zaznamenali i vysokou rezistenci na meronem, 14,2 %, resp. 14,4 % (Acinetobacter sp. na JIP dokonce 23,7 %).

Zaznamenali jsme statisticky signifikantně vyšší podíl antibiotické rezistence na jednotkách intenzivní péče oproti standardnímu oddělení urologie, konkrétně u beta‑laktamových antibiotik. Největší rozdíl v rezistenci jsme prokázali u piperacilin‑tazobactamu (12,0 % vs. 21,1 %, p < 0,00), jak prezentuje tabulka 3. Naopak statisticky významně nižší rezistenci na JIP vykazují oproti urologii pouze dvě antibiotika – amikacin a v ambulantní urologické péči často užívaný nitrofurantoin.

Vývoj souhrnné rezistence beta‑laktamových antibiotik v čase prezentuje graf 2 (aminopenicilin, amoxicilin‑klavulanát, cefalosporiny, piperacilin‑tazobaktam). Na JIP je rezistence trvale vyšší oproti urologii a zbytku zdravotnického zařízení a od roku 2019 opět výrazněji roste. V roce 2015 dosáhla souhrnná rezistence beta‑laktamových antibiotik na JIP 32,8 %, největší rozdíl oproti urologii jsme pak zaznamenali v roce 2020 (30,7 % vs. 21,6 %). Zvýšená léčba ESBL kmenů karbapenemy zejména na JIP vede sekundárně k prudkému nárůstu meronemové rezistence, kdy od roku 2013 se tato rezistence zvýšila 7× z původních 0,4 % na 2,8 %. Antibiotická léčba rezistentních kmenů tak vytváří prostor pro rozvoj dalších druhů rezistence. Pozorujeme růst AMR dalších antibiotik, kdy rezistence vankomycinu na JIP vzrostla z původních 1,1 % v roce 2013 na 5,3 % v roce 2020, rezistence na kolistin byla roku 2018 na JIP dokonce 25,0 %.

DISKUZE

Pandemie covidu-19 ukázala, jak zranitelná je celosvětová populace obecně vůči infekcím. Rozvoj AMR je oproti rychlému vývoji virové pandemie postupný, nenápadný a ve svých důsledcích nepředvídatelný s rizikem, že již nebudeme mít řešení. Vývoj očkovací vakcíny na virová onemocnění je technologicky jinou záležitostí a dá se zvládnout do jednoho roku, vývoj nové molekuly antibiotika může trvat i několik let. Navíc vývoj nových antibiotik není pro většinu velkých farmaceutických společností ekonomicky výhodný.

Aktuálně novějšími antibiotiky pro léčbu ESBL kmenů jsou ceftolozan‑tazobaktam (ceftolozan působí na pseudomonády a tazobaktam inhibuje beta‑laktamázu) nebo ceftazidim‑avibactam, kdy avibaktam je nový inhibitor beta‑laktamáz a působí na některé karbapenemázy, nepůsobí však na enterokoky (8). Recentně byl v dubnu 2020 schválen v Evropě pro léčbu multirezistentních gramnegativních IMC nový preparát cefiderocol. Jinou možností léčby ESBL kmenů je podání antibiotika temocilin, které ale není v České republice a většině EU registrované. Z běžně užívaných antibiotik lze zaznamenat citlivost vůči ESBL kmenům u nitrofurantoinu či fosfomycinu. Z novějších preparátů je fosfomycin hodnocen v našem zařízení až poslední tři roky a pivmecillin až od roku 2021 a nejsou tedy součástí našeho hodnocení.

Ani nová antibiotika bohužel nemusí být dostatečným řešením problému mikrobiální rezistence, kdy již náš primární pohled na celou problematiku AMR byl špatný. Přes naše znalosti jsme ho řešili jen na úrovni zdravotnictví a nespojili jsme tento problém s dalšími aspekty, jako užití antibiotik v zemědělství, změny klimatu, vzestup cestování s celkovými dopady globalizace. Dle odhadů až 80 % spotřebovaných antibiotik v USA bylo obsaženo ve zvířecím krmivu a nebylo použito primárně k léčbě. Rezistentní bakterie tak opouští střeva zvířat a kontaminují okolní prostředí, NDM-1 rezistence byla prokázána v 5 % vzorků pitné vody okolo Dillí v Indii. Registrovaný problém bakteriální rezistence v nemocnicích je tak jen špičkou ledovce a problém je daleko rozsáhlejší, než se jeví.

Obecně infekce vyvolané kmeny MDR (Multi‑Drug Resistent) jsou spojeny s vyšší mortalitou (9). Zatímco v rozvojových a chudých státech se na rezistenci podílí špatná hygiena a horší kvalita zdravotní péče, ve vyspělých státech mezi hlavní rizikové faktory vzniku MDR infekce patří věk, imunosuprese, anamnéza bakteriální kolonizace, recentní pobyt v epidemiologicky rizikové oblasti, recentní infekce spojená se zdravotnickým zařízením či opakované podání širokospektrých antibiotik (10, 11, 12). Zejména vystavení působení fluorochinolonů a cefalosporinů III. generace u starších pacientů déle než 7 dní významně zvyšuje riziko ESBL IMC (13). Jiné práce uvádějí, že mužské pohlaví zvyšuje pravděpodobnost infekce ESBL o 50 %, zavedený katétr o 30 % a každých 10 let věku přidá 10 % (14). Rovněž IMC spojená s derivací horních cest močových je zatížena vyšší incidencí rezistentních bakterií ve srovnání s komunitní IMC (15, 16, 17, 18). Obecně nedoporučovaná léčba asymptomatické bakteriurie vede k selekci rezistentních kmenů (19). Dle mezinárodní studie GPIU (Global Prevalence of Infections in Urology) se až 9 % pacientů hospitalizovaných na urologii nakazilo nozokomiální infekcí, často způsobenou MDR kmeny (20). V našem hodnocení jsme pro dané kmeny nepoužili označení MDR, protože ne zcela všechny námi hodnocené enzymaticky podmíněné rezistence splňují aktuálně přijatou definici MDR z roku 2011 (rezistence minimálně na jedno antibiotikum ze tří a více antimikrobiálních kategorií).

Řada epidemiologických studií prokázala zvyšující se incidenci MDR IMC (21, 22, 23). Obecně míru rezistence na antibiotika monitoruje v Evropě organizace ECDC (European Centre for Disease Prevention and Control). Naše výsledky se vztahují k močovým nálezům, naproti tomu souhrnná zpráva ECDC prezentující výsledky AMR v letech 2015–2019 druh izolátu nerozlišuje. Zaznamenala velké rozdíly ve výskytu AMR v celé EU, kdy v několika zemích byla rezistence na karbapenemy nad 10 % (Řecko dokonce 58,3 %, Rumunsko 32,3 %, Itálie 28,5 %, Bulharsko 27 %, Kypr 13,3 %, Chovatsko 12 %, Portugalsko 10,9 %). Celkově podíl Klebsielly pneumonie rezistentní na karbapenemy v EU vzrostl od roku 2015 z 6,8 % na 7,9 % v roce 2019 (výskyt CPE rezistentní E. coli v EU stoupl z 0,1 % od roku 2018 dokonce 3×). Jednou z oblastí se zvláštním zájmem ECDC bylo zvýšení izolátů E. faecium rezistentních na vankomycin, kdy v EU od roku 2015 stoupl tento podíl z 10,5 % na 18,3 % v roce 2019. I naše výsledky izolátů v moči tento trend potvrdily. Výskyt CPE Klebsielly pneumonie v České republice (ČR) zatím není ve srovnání s celou EU tak špatný, přesto trvale roste, v roce 2015 činil 0,3 %, ale roku 2019 již dvojnásobek 0,6 %. Naopak VRE (E. faecium) v ČR přesáhl evropský průměr a dosáhl 19,8 %. Lichotivý pro ČR není ani 18,7 % výskyt MDR P. aeruginosa rezistentní na tři a více antibiotik ze skupiny piperacilin + tazobactam, chluorochinolony, aminoglykosidy a karbapenemy (24). Pro Klebsielly může být problém v EU nejen rostoucí karbapenemová rezistence, ale i její rezistence na kolistin (dle dat ECDC z roku 2017 byla rezistence na kolistin až 8,5 %) (25).

Jiná data přicházejí ze Spojených států. Dle odhadů CDC bylo roku 2017 hospitalizováno asi 197 400 pacientů pro ESBL produkující enterobakterie (zemřelo asi 9 100 pacientů), MDR P. aeruginosa byla zaznamenána asi ve 32 600 případů (zemřelo odhadem 2 700 pacientů), u zhruba 54 500 pacientů se objevil vankomycin rezistentní enterokok (zemřelo odhadem 5 400 pacientů), MRSA byla prokázána v 323 700 případech (úmrtí asi 10 600 pacientů), Acinetobakter sp. rezistentní na karbapenemy vedl k hospitalizaci asi 8 500 a úmrtí 700 pacientů, 13 100 lidí se nakazilo karbapenem rezistentní enterobakterií a následně zemřelo asi 1 100 pacientů (26).

Dle doporučení EAU (European Association of Urology) racionální empirická terapie zahrnuje znalost lokální antibiotické rezistence (27). Publikací hodnotících rezistenci uropatogenů není v České republice mnoho (28). Byla prokázána dobrá citlivost na fosfomycin včetně ESBL kmenů (95,8 % E. coli a 85,3 % kmenů Klebsielly) (29). Dané práce však hodnotí rezistenci jen v daném časovém okamžiku na rozdíl od naší práce, která se pokusila postihnout vývoj rezistencí v čase s možnou predikcí dalšího vývoje. Jinak se výskyt rezistentní E. coli či Klebsielly v našem souboru významně neliší od publikovaných dat (20, 28, 29). Menší podíl ESBL izolátů Klebsielly (13,3 %) uvádí pouze britská studie (14). Limitací naší studie je retrospektivní sběr dat.

Snaha eliminovat další vzestup bakteriální rezistence je v současnosti do značné míry omezena na vlastní zdravotnická zařízení s nástroji, které mají k dispozici – dostatečná hygiena, racionální antibiotická terapie dle znalosti lokální epidemiologické situace s eliminací nadbytečné terapie. Boj s rezistencí je možný. Výskyt MRSA po zavedení celoplošného programu klesl ve Velké Británii o 80 % (30). Bohužel však platí, že v populaci jednou ustálená rezistence těžko vymizí (31).

ZÁVĚR

Hodnocená data v našem souboru prezentují trend vývoje mikrobiální rezistence v našem zdravotnickém zařízení. Z celkového počtu 35 801 močových nálezů jsme zaznamenali 11,5 % rezistentních kmenů. Minimálně každý 10. pacient léčený pro IMC trpí rezistentní infekcí. V populaci bakteriálních kmenů se nejčastěji vyskytuje ESBL rezistence. Hrozbou a současně výzvou v boji s rezistencí je výskyt CPE kmenů, které se do roku 2013 v našem zdravotnickém zařízení nevyskytovaly, a nárůst VRE v posledních letech. Signifikantně vyšší rezistenci některých antibiotik jsme zaznamenali na jednotkách intenzivní péče. Rezistence tak primárně vzniká, šíří se a roste zejména na JIP.

Lokální hodnocení epidemiologické situace a sdílení dat je zásadní pro boj s rostoucí rezistencí a důležitým nástrojem pro určení optimální empirické terapie. Globální přístup v boji s AMR je nezbytný.

Došlo: 30. 11. 2021

Přijato: 14. 1. 2022

Kontaktní adresa:

MUDr. Vít Paldus

Urologické oddělení, Krajská nemocnice Liberec, a. s.

Husova 10, 460 63 Liberec

e‑mail: vit.paldus@nemlib.cz

Střet zájmů: Žádný.

Prohlášení o podpoře: Autor prohlašuje, že zpracování článku nebylo podpořeno farmaceutickou firmou.

Práce vznikla s finanční podporou Vědecké rady Krajské nemocnice Liberec, a. s.