Význam klasického cytogenetického vyšetření v pediatrické praxi: zhodnocení 384 indikací

Overview

Úvod:
Odchylky v počtu a stavbě chromozomů představují jednu z nejvýznamnějších etiologických skupin genetických chorob v rámci dětského lékařství. Základní diagnostickou metodou k jejich identifikaci je klasické vyšetření karyotypu v optickém mikroskopu. Cílem naší práce bylo zhodnotit klinické indikace k vyšetření karyotypu v dětském věku a analyzovat jeho úspěšnost, tj. podíl patologických nálezů.

Metodika:
Pro naši analýzu byly použity výsledky cytogenetického vyšetření u dětí (do 18 let věku) za období let 2010–2012 z databáze Cytogenetické laboratoře Ústavu biologie a lékařské genetiky VFN a UK 1. LF v Praze.

Výsledky:
Ve sledovaném tříletém období byl karyotyp vyšetřen u 384 dětí (204 chlapců a 180 dívek). Patologický karyotyp byl identifikován celkem u 35 dětí (9,1 %). Nejčastější indikací byla přítomnost vrozené vývojové vady (uvedena u 34,6 % záznamů) následovaná psychomotorickou či mentální retardací (33,3 %). Patologický nález byl nejčastěji zachycen u dětí vyšetřovaných již s klinickým podezřením na konkrétní chromozomovou odchylku (např. Downův syndrom) – celkem 15 pozitivních nálezů (3,9 % všech vyšetřovaných dětí). Tato skupina indikací měla i nejvyšší záchytnost (podíl případů s patologickým karyotypem vzhledem ke všem indikacím) – 26,3 %. Přítomnost vrozené vývojové vady byla spojena s odchylkou karyotypu jen u 6,0 % těchto indikací a úplně nejmenší četnost patologických nálezů pak byla u dětí indikovaných s poruchou růstu (1,3 %).

Závěr:
Klasické cytogenetické vyšetření zůstává jedním z nejčastěji prováděných genetických laboratorních vyšetření v dětském věku. Důležitá je spolupráce s klinickým genetikem, který může pomoci rozhodnout o vhodnosti indikace, případně doplnění podrobnějších vyšetření u dětí se suspektním fenotypem a normálním karyotypem.

Klíčová slova:
karyotyp, chromozomové odchylky, genetické syndromy

Úvod

Stanovení karyotypu je jedním ze základních vyšetření v rámci klinické genetické diagnostiky. Principem vyšetření je hodnocení preparátů obarvených metafázních chromozomů v optickém mikroskopu. V rámci postnatální cytogenetické diagnostiky jsou jako materiál k tomuto vyšetření nejčastěji využívány kultivované lymfocyty periferní krve. Jeho úkolem je odhalení strukturních či početních odchylek chromozomů [1].

Chromozomové odchylky představují významnou příčinu mortality i morbidity dětského věku. Podle dat Národního registru vrozených vad se v České republice (ČR) mezi lety 1994 a 2007 narodilo 1385 dětí s některým ze sledovaných typů chromozomových odchylek [2]. Ve skupině živě narozených dětí tvořily chromozomové odchylky jen 2,3 % všech diagnóz, neboť díky vyspělému prenatálnímu screeningu a diagnostice v ČR je řada případů chromozomových odchylek zachycena již prenatálně [2, 3]. Novější data ukazují, že vůbec nejčastější chromozomovou odchylkou u narozených dětí zůstává v ČR Downův syndrom, jehož četnost u živě narozených dětí v období 1994–2010 činí 17,47 na 10 000 živě narozených [4].

Klinicky jsou chromozomové odchylky velice různorodou skupinou spojenou s celou řadou různě vyjádřených symptomů. K suspekci na chromozomovou odchylku vede zejména psychomotorická retardace, kraniofaciální dysmorfie (abnormální rysy obličeje a lebky, nejčastěji zasahující oči, nos a ušní boltce), vývojové vady vnitřních orgánů či poruchy dospívání a fertility. Početně i klinicky významnou skupinou mezi těmito diagnózami jsou nejznámější syndromy způsobené aneuploidiemi autozomů (syndromy Downův, Edwardsův a Patauův) či gonozomů (syndromy Turnerův či Klinefelterův). Právě u této skupiny diagnóz je velmi vypovídající a účelné použití klasického cytogenetického vyšetření [1].

V karyotypu je popisováno i velké množství strukturních chromozomálních aberací. Řada z nich postihuje genom na submikroskopické úrovni – např. mikrodeleční syndromy či subtelomerické přestavby. Pro jejich přesnou detekci je kvůli jejich velmi malému rozsahu klasické cytogenetické vyšetření již nedostatečné a je třeba použít speciální molekulárně cytogenetické či molekulárně genetické metody (například MLPA či čipové metody) [5].

V naší práci sledujeme spektrum pediatrických indikací ke stanovení karyotypu a analyzujeme záchytnost (detection rate) u celkem 384 pacientů dětského věku.

Metodika

V naší studii jsou využity výsledky standardních cytogenetických vyšetření provedených u dětských pacientů v Cytogenetické laboratoři Ústavu biologie a lékařské genetiky 1. lékařské fakulty a Všeobecné fakultní nemocnice v Praze (dále jen ÚBLG) během tříletého období (2010–2012). Studie zahrnuje děti indikované a odebrané ke stanovení karyotypu mezi prvním dnem života a datem dovršení 18. roku včetně. Klinické informace o probandech byly získány ze žádanky a přiložené klinické zprávy.

Všechna cytogenetická vyšetření byla provedena ze vzorků periferní krve odebrané jednotlivým pacientům dodaných z ambulancí a lůžkových oddělení Kliniky dětského a dorostového lékařství UK 1. LFa VFN a ambulance ÚBLG. Vzorky byly zpracovány podle standardních laboratorních protokolů a doporučení [6], základní barvící metodou bylo G-pruhování, výsledky byly zaznamenány podle aktuální verze mezinárodní cytogenetické nomenklatury ISCN [7]. Kromě standardního vyšetření karyotypu bylo v laboratoři ÚBLG u celkem 7 indikovaných pacientů provedeno také vyšetření karyotypu s vysokou rozlišovací úrovní (tzv. HRT karyotyp, z angl. High Resolution Technique), u 17 pak fluorescenční in situ hybridizace (FISH), opět podle standardních postupů a doporučení [6].

Na základě klinických zpráv byly následně všechny případy roztříděny podle jednotlivých indikací (přichází v úvahu i více indikací v rámci jednoho případu) do šesti různých skupin. Následně jsme analyzovali četnost jednotlivých indikací a jejich úspěšnosti, a to jak celkově, tak i pro jednotlivé věkové skupiny (0–2 roky, 3–6 let, 7–12 let a 13–18 let věku dítěte).

Výsledky

Ve sledovaném období bylo k cytogenetickému vyšetření indikováno 384 dětských pacientů, z toho 204 chlapců a 180 dívek, podrobnější rozdělení podle jednotlivých věkových skupin ukazuje tabulka 1. Nejčastější indikací celkem byla s 34,6 % přítomnost vrozené vývojové vady; nejčastější byla ve skupině dětí do 2 let věku, kde představuje dokonce 55 % všech indikací. Následují indikace pro psychomotorickou či mentální retardaci, které tvořily 33,3 % všech indikací; vůbec nejčastější byla tato skupina u předškolních dětí, kde tvořila 60,5 % všech indikací. Skupina „jiná indikace“ zahrnovala ponejvíce případy, kdy byl karyotyp dítěte vyšetřen těsně po narození v rámci diferenciální diagnostiky těžkého klinického stavu, např. u dětí po perinatální asfyxii, proto je také tato indikační skupina zastoupena především u dětí do dvou let věku. Podrobnosti rozvádí tabulka 2.

Patologický karyotyp byl identifikován celkem u 35 dětí (9,1 %); všechny záchyty jsme rozdělili podle stejných výše uvedených třídících kritérií. Nejčastější byly pozitivní nálezy u dětí vyšetřovaných z důvodu klinického podezření na konkrétní chromozomovou odchylku (např. Downův syndrom) – bylo jich celkem 15 (což je 3,9 % všech vyšetřovaných dětí) a dále u dětí s psychomotorickou či mentální retardací, kde jsme patologický karyotyp zachytili u 11 dětí (2,9 % všech vyšetřovaných). Podrobnosti pro jednotlivé věkové skupiny shrnuje tabulka 3.

Z konkrétních diagnóz byl zcela nejčastější Downův syndrom, který byl zachycen u 4 chlapců a 3 dívek, celkem tedy u 1,82 % všech vyšetřovaných dětí). Početní odchylky gonozomů (tedy například syndromy Klinefelterův či Turnerův) byly rovněž zachyceny u 7 dětí. Nejčastější skupinou vůbec byly „jiné odchylky autozomů“, které jsme nalezli u 10 dětí (5 chlapců a 5 dívek; celkem 2,6 % všech vyšetřovaných dětí) – zastoupeny jsou 3 děti s translokací, 2 případy s isodicentrickým chromozomem, 2 děti s delecí a po jednom případu triplikace, duplikace a trizomie jiného autozomu v mozaikové formě. Pro zajímavost je nutné zmínit dva nálezy „Sex reversal“, která zahrnuje diskrepanci mezi fenotypovým pohlavím (v obou případech dívčím) a karyotypem (v obou případech 46,XY) a dále 3 případy syndromu Smithové-Magenisové a 1 případ syndromu WAGR (Wilmsův tumor, Aniridie, malformace Genitálu, mentální Retardace), které byly na cytogenetické úrovni diagnostikovány metodou FISH. Podrobnosti o všech diagnózách uvádí tabulka 4.

Dále jsme analyzovali i záchytnost pro jednotlivé indikace – tedy procento případů, u kterých byl v rámci dané indikační skupiny opravdu zachycen patologický karyotyp. Největší záchytnost jsme zaznamenali ve dvou již zmíněných indikačních skupinách – podezření na konkrétní chromozomovou odchylku (26,3 % v celé skupině) a psychomotorická/mentální retardace (8,6 %). Distribuci záchytností v jednotlivých indikačních skupinách podle věkových kategorií uvádíme v tabulce 5.

Poslední analyzovanou položkou byla záchytnost v rámci klinického podezření na konkrétní chromozomovou aberaci. Z výsledků je zřejmé, že zatímco podezření na Downův syndrom bylo správné ve více než 58 % případů, klinické podezření na Turnerův syndrom nebylo správné ani jednou (tab. 6).

Diskuse

Chromozomové odchylky představují významnou skupinu diagnóz v prenatálním období. Často jsou ale diagnostikovány i časně po narození dítěte či později v průběhu dětského věku [1]. V rámci naší studie jsme analyzovali pediatrické indikace ke klasickému cytogenetickému vyšetření a úspěšnost těchto indikací v podobě jejich naplnění vysvětlujícím (odpovídajícím) cytogenetickým nálezem (záchytnost, detection rate).

Vyšetření karyotypu je v ČR v drtivé většině indikováno klinickými specialisty – neonatologem, pediatrem na lůžkovém oddělení, genetikem či syndromologem, méně často jinými. Nicméně nejsou ojedinělá doporučení praktických lékařů pro děti a dorost, kde je pečlivě popsán fenotyp dětského pacienta, vyslovena suspekce na odchylku karyotypu a připojena žádost o cytogenetické vyšetření. Základními indikacemi jsou vrozené vývojové vady (případně jen kraniofaciální dysmorfie), psychomotorická či mentální retardace, poruchy růstu a sexuálního vývoje; někdy fenotyp dítěte vede k vážnému podezření na konkrétní syndrom (např. Downův syndrom), jehož diagnóza je poté cytogeneticky ověřována.

Naše studie ukazuje, jak se četnost jednotlivých indikací mění v závislosti na věku vyšetřovaných dětí. Ve skupině nejmenších dětí (0–2 roky věku) byla nejčastější indikací (u 55 %) vrozená vývojová vada, ve skupinách starších dětí potom četnost této indikace postupně ubývá. Je to proto, že fenotyp vrozené vývojové vady většinou bývá dobře rozpoznatelný již po narození. Naopak, některé z dalších indikací jsou lépe rozpoznatelné až u starších dětí; typické jsou v tomto smyslu příznaky psychomotorické či mentální retardace. Podle nálezů v našem souboru je retardace nejčastější indikací právě ve skupině předškolních dětí (3–6 let věku), kde tvoří 60,5 % všech indikací, a primát (37,3 % všech indikací) si drží i ve skupině mladších školáků (7–12 let věku). V této posledně uvedené věkové kategorii se zastoupení pacientů indikovaných pro některou formu retardace ale velmi blíží podílu dětí s jinou indikací, totiž s poruchami růstu (v našem souboru až 33,9 %). Konečně, ve skupině dětí do 18 let věku tvoří více jak polovinu (56,0 %) všech indikací klinické projevy různých poruch sexuálního vývoje.

Také záchytnost se proměňuje v jednotlivých věkových kategoriích. Nejúspěšnějšími indikacemi jsou stavy, kdy již z fenotypu dítěte vyplývá významné podezření na konkrétní chromozomovou odchylku – takto byl patologický karyotyp nalezen u 26,3 % vyšetřovaných dětí. I zde ovšem najdeme rozdíly – v rámci našeho přehledu bylo klinické podezření na Downův syndrom následováno odpovídajícím karyotypem v cca 58 %, na druhé straně ani jedno ze 17 klinických podezření na Turnerův syndrom (hlavními indikačními kritérii jsou nízký vzrůst či porucha dospívání) nebylo na cytogenetické úrovni potvrzeno. Jediná dívka s Turnerovým syndromem (navíc v deleční formě) v našem souboru byla indikována z jiného důvodu (ověření nejasného nálezu v prenatálně vyšetřeném karyotypu CVS). V souvislosti s tím je třeba zmínit poněkud odlišnou diagnostickou rozvahu při podezření na tyto dva syndromy.

U Downova syndromu bývá fenotyp v řadě případů poměrně nápadný – a cytogenetické vyšetření je indikováno především k potvrzení diagnózy. V případě Turnerova syndromu může být jediným vodítkem k diagnóze nízký vzrůst dívky, což vede k obecnému doporučení indikovat cytogenetické vyšetření u dívek s dosud nevysvětleným růstovým deficitem právě k vyloučení tohoto syndromu [8]. Výskyt Turnerova syndromu u živě narozených dětí je v České republice poměrně nízký a několikrát nižší než výskyt Downova syndromu [9], který tím pádem mohl být častěji zachycen i v našem souboru. Skutečná incidence Turnerova syndromu (obecně i dalších gonozomových abnormalit) bude nejspíš vyšší – některé pacientky jsou diagnostikovány až v dospělosti v rámci diferenciální diagnostiky neúspěšné reprodukční anamnézy [10], ale do statistických hlášení už nejsou zahrnuty.

Ve skupině dětí s vrozenými vývojovými vadami (VVV) byla záchytnost chromozomových aberací 6 %; jako indikace se uplatnila zejména kraniofaciální dysmorfie a mikrocefalie (6, resp. 2 záchyty z celkem 8). U dětí, kde byly indikací strukturní vady končetin nebo například obličejové rozštěpy, nebyl patologický karyotyp zachycen. V indikační skupině dětí s psychomotorickou a/nebo mentální retardací pak záchytnost (8,6 %) dobře koreluje s literárními údaji – v rozsáhlé metaanalýze holandských autorů dosahovala průměrná četnost patologických nálezů při standardním cytogenetickém vyšetření v této indikační skupině 9,5 % [11].

V rámci naší studie se podařilo pomocí klasických cytogenetických metod (G-pruhování a v několika případech cílené FISH vyšetření) identifikovat patologický karyotyp celkem u 9,1 % dětí. Porovnání celkového výsledku je obtížné pro absenci studií se stejně definovaným základním souborem. V mezinárodním měřítku můžeme alespoň uvést jinou holandskou studii, která mezi 36 325 cytogeneticky vyšetřenými (převážně dětskými) pacienty s psychomotorickou retardací, komplexnějšími odchylkami vývoje a/nebo dysmorfickými rysy nalezla 8,5 % jedinců s patologickým nálezem [12].

Přínos cytogenetického vyšetření pro klinickou pediatrickou praxi je tedy nesporný, metodologie tohoto vyšetření však v současné době prochází prudkým rozvojem. Standardní cytogenetické vyšetření nemůže rozlišit změny v karyotypu o menším rozsahu nežli 5 Mb (milionů párů bazí, mega-bazí) [5], což vedlo k potřebě zavedení přesnějších metod, zejména pro diagnostiku přestaveb (např. mikrodelecí) nedetekovatelných v optickém mikroskopu [13]. V současné době jsou nejdále tzv. čipové technologie – například platformy aCGH či aSNP, které nabízejí vyšetření celého genomu s vysokým rozlišením (řádově desítky tisíc párů bazí) a řadu dalších výhod [14]. K dispozici jsou už první metaanalýzy ohledně úlohy čipových metod v prenatální diagnostice: např. v Itálii byl patologický profil vyšetření aCGH zachycen celkově u 6,4 % prenatálně indikovaných případů s normálním karyotypovým nálezem [15]. Pro postnatální vyšetření, včetně pediatrických indikací, takové studie zatím nejsou k dispozici. Nicméně tento technologický pokrok vede k přehodnocování standardů pro cytogenetickou diagnostiku a v některých západních zemích je vyšetření pomocí čipové technologie již metodou první volby při podezření na chromozomovou přestavbu [14]. Například ve Spojených státech amerických je oficiálně doporučeno použít aCGH/aSNP jako metodu první volby při vyšetření dětí s mnohočetnými vývojovými vadami či opožděním psychomotorického vývoje, které nelze zařadit do klinického obrazu konkrétního syndromu [16, 17]. V České republice prozatím obecné doporučení k indikaci čipových metod neexistuje – proto je nezbytná úzká spolupráce pediatra s klinickým genetikem, jak by tomu ostatně mělo být v případě indikace jakéhokoliv genetického vyšetření. Standardní cytogenetické vyšetření pomocí G-pruhování má však stále celosvětově velké využití a rozhodně z laboratoří nemizí [18].

Závěr

Klasické cytogenetické vyšetření je i nadále jednou z nejdůležitějších genetických laboratorních metod využívaných v dětském věku. Spolupráce pediatra s klinickým genetikem, případně syndromologem je velmi užitečná a v oblasti indikace jednotlivých vyšetřovacích metod přímo nezbytná. Naše výsledky ukazují, že u dětí s podezřením na konkrétní chromozomovou aberaci bývá frekvence patologických nálezů poměrně vysoká. Naopak u dětí s izolovanými vývojovými vadami je pravděpodobnost záchytu patologického karyotypu poměrně malá – nejlepším indikačním kritériem z této skupiny je tak výraznější kraniofaciální dysmorfie („chromozomální fenotyp“). Jak dokazují i naše výsledky – klasické vyšetření karyotypu pomocí G-pruhování svou roli v pediatrické diagnostice stále má a slouží jako základní a široce dostupná vyšetřovací metoda, na kterou lze v odůvodněných případech vhodně navázat např. (v ČR dosud stále finančně náročnými) čipovými metodami.

Zkratky:

aCGH – array Comparative Genomic Hybridization, aSNP – array Single Nucleotide Polymorphism, FISH – Fluorescence in situ Hybridization, HRT – High Resolution Technique, ISCN – International System for Human Cytogenetic Nomenclature, MLPA – Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification

Práce byla podpořena projektem OPPK CZ.2.16/3.1.00/24012 a grantem SVV 260023/2014 Univerzity Karlovy v Praze.

Došlo: 15. 12. 2013

Přijato: 7. 5. 2014

MUDr. Romana Mihalová

Ústav biologie a lékařské genetiky

VFN a UK 1. LF

Albertov 4

128 00 Praha 2

e-mail: romana.mihalova@lf1.cuni.cz