Súvis génových polymorfizmov glutatión S-transferázy T1 a M1 s mikroalbuminúriou a incipientnou nefropatiou u detí s diabetes mellitus 1. typu

Overview

V etiopatogenéze diabetickej nefropatie (DN) sa diskutuje o vplyve oxidačného stresu. Glutatión S-transferáza (GST) predstavuje rodinu multifunkčných enzýmov s antioxidačnou funkciou. Null polymorfizmy GST theta 1 (GST T1) a mu 1 (GST M1) sú asociované s nižšou aktivitou týchto enzýmov. Cieľom práce bolo zistiť, či génové polymorfizmy GST T1 a M1 majú súvis s výskytom mikroalbuminúrie a diabetickej nefropatie u detí s diabetes mellitus typu 1.

U 116 pacientov s diabetes mellitus typu 1 vo veku 6–19 rokov boli zaznamenané základné antropometrické parametre, mali vyšetrenú koncentráciu glykozylovaného hemoglobínu a mikroalbuminúriu. Incipientná nefro-patia bola diagnostikovaná ako opakovaný nález mikroalbuminúrie zo vzorky 12-hodinového nočného moču 20–200 μg/min. Polymerázovou reťazovou reakciou boli stanovené génové polymorfizmy GST T1 a M1.

Diabetici s GST T1 null genotypom (n = 42) mali signifikantne vyššiu mikroalbuminúriu v porovnaní s diabetikmi s GST T1 wild genotypom (n = 74) (p <0,05), pričom v ostatných sledovaných parametroch nebol nájdený signifikantný rozdiel. Podobne nebol potvrdený signifikantný rozdiel v sledovaných parametroch v súvislosti s GST M1 genotypom. Incipientná diabetická nefropatia bola prítomná u 26 jedincov (22,41 %). Pacienti s diabetickou nefropatiou (DN+) mali signifikantne vyšší vek (p <0,01), dlhšie trvanie diabetu (p <0,01), vyšší body mass index (p <0,01) a vyššiu mikroalbuminúriu (p <0,01) v porovnaní s diabetikmi bez nefropatie (DN-). Multivariačnou logistickou regresiou boli uvedené parametre potvrdené ako rizikové faktory pre vznik DN. Rozdiely výskytu génových polymorfizmov medzi podskupinami DN+ a DN- neboli signifikantné.

GST T1 null genotyp môže súvisieť s vyššou mikroalbuminúriou, avšak pre potvrdenie tejto indikácie sú vhodné ďalšie štúdie.

Kľúčové slová:
diabetická nefropatia, génové polymorfizmy, glutatión S-transferáza T1 a M1

ÚVOD

Diabetes mellitus typu 1 (type 1 diabetes, T1D) je metabolické ochorenie charakterizované hyperglykémiou s absolútnym nedostatkom inzulínu následkom autoimunitného zápalu beta buniek pankreasu. Kvalita života jedincov s T1D je výrazne determinovaná prítomnosťou chronických diabetických komplikácií, ktoré nie sú doménou len dospelého veku, ale vzhľadom na skorý nástup ochorenia sa s nimi stretávame aj u detí a adolescentov. Diabetická nefropatia (DN) postihuje asi 30–35 % diabetikov 1. typu, pričom klinicky manifestná DN sa objaví asi u 30 % diabetikov po 15–20 rokoch trvania diabetu [1]. Klinické rozdelenie DN je uvedené v tab. č. 1.

V etiopatogenéze diabetickej nefropatie má úlohu genetická predispozícia spolu s pretrvávajúcou hyperglykémiou, ktorá indukuje mnohé metabolické procesy pôsobiace vo vzájomnej interakcii, medzi ktoré patrí neenzýmová glykácia proteínov, polyolová cesta a oxidačný stres. Oxidačný stres, ako výsledok nerovnováhy medzi tvorbou reaktívnych foriem kyslíka (RFK) a činnosťou antioxidačných mechanizmov, indukuje expresiu tkanivového rastového faktora β1 (TGF- β1) a fibronektínu, ktoré podporujú produkciu extracelulárnej matrix, čím prispievajú k zhrubnutiu glomerulárnej bazálnej membrány a k renálnemu poškodeniu. Nadprodukcia RFK alteruje mezangiálne bunky, vyvoláva bunkové procesy vedúce k apoptóze a v mezangiálnych a glomerulárnych bunkách zvyšuje aktivitu proteínkinázy C (PKC) pôsobiacej v bunkovej signalizácii [3]. Izoformy PKC- β1 a 2 zhoršujú krvný prietok cez obličky, zvyšujú kapilárny únik, indukujú produkciu extracelulárnej matrix a aktivujú prozápalové cytokíny, čím prispievajú k mikrovaskulárnemu poškodeniu [4]. PKC tiež stimuluje produkciu RFK. Tieto zmeny spolu s neenzýmovou glykáciou proteínov vedú k renálnej hyperperfúzii, hyperfiltrácii, k hromadeniu extracelulárnej matrix, k vazokonstrikcii renálnych ciev, k rekonštrukcii renálnej štruktúry a dokonca k nefroskleróze.

V súvislosti s oxidačným stresom sú v popredí záujmu génové polymorfizmy niektorých antioxidačných enzýmov, ktoré by mohli mať vplyv na vznik chronických diabetických komplikácií. Glutatión S-transferáza (GST) predstavuje rodinu enzýmov zapojených v metabolizme cudzorodých látok, katalyzujúcich konjugáciu redukovaného glutatiónu s exogénnymi alebo endogénnymi substrátmi (aldehydy, N-nitrozamín, polycyklické aromatické uhľovodíky) s cieľom ich detoxifikácie a jednoduchšej exkrécie. Substrátom pre uvedenú reakciu sú aj sekundárne metabolity reaktívnych foriem kyslíka a organické hydroperoxidy, z čoho vyplýva antioxidačná funkcia GST. Navyše, GST enzýmy majú úlohu v syntéze zápalových mediátorov (leukotriény, prostaglandíny) a tiež v bunkovej signalizácii ako regulátory apoptózy. Podľa substrátovej špecificity, chemickej afinity, štruktúry a kinetiky bolo identifikovaných niekoľko tried cytozolových GST. Najviac študovaným je GST M1 enzým v mu triede kódovaný génom lokalizovaným na chromozóme 1 a GST T1 enzým v theta triede kódovaný génom lokalizovaným na chromozóme 22 [5]. Bolo dokázané, že jedinci s GST null genotypom disponujú signifikantne zníženou aktivitou tohto antioxidačného enzýmu [6] a majú vyššie koncentrácie intermediárnych produktov oxidačného metabolizmu v porovnaní s jedincami s wild genotypom. Táto skutočnosť môže viesť k exacerbácii patologických účinkov reaktívnych foriem kyslíka a môže mať dôležitý vplyv v etiopatogéneze viacerých ochorení.

Podľa posledných prác, GST T1 a M1 génové polymorfizmy majú súvis s vývojom chronických diabetických komplikácií [7, 8], avšak väčšina autorov sa venuje dospelej populácii s diabetom typu 2 (type 2 diabetes, T2D). Cieľom tejto práce je zistiť, či génové polymorfizmy glutatión S-transferázy T1 a M1 majú súvis s mikroalbuminúriou a incipientnou nefropatiou u detí s T1D.

METODIKA

Pacienti a sledované parametre

Projekt bol schválený Etickou komisiou Jesseniovej lekárskej fakulty v Martine. Zúčastnení jedinci a ich zákonní zastupcovia boli informovaní o zámere projektu a mali podpísaný informovaný súhlas. Do štúdie boli zahrnutí pacienti s T1D (kritériá Americkej diabetologickej asociácie) [9], pacienti s ketoacidózou alebo s akútnym infektom boli zo štúdie vylúčení.

Každý jedinec mal zaznamenané trvanie T1D, vek nástupu T1D a základné antropometrické parametre – hmotnosť, výšku, body mass index (BMI). Od každého pacienta boli odobrané dve vzorky venóznej krvi, jedna pre stanovenie glykozylovaného hemoglobínu štandardnými biochemickými postupmi (DCCT norma) a druhá pre vyšetrenie génových polymorfizmov. Zo vzorky 12-hodinového nočného moču bola vyšetrená mikroalbuminúria za štandardných podmienok. V prípade pozitívneho nálezu (>20 µg/min) bola mikroalbuminúria znovu vyšetrená o 2 mesiace za rovnakých podmienok. Ak zvýšená mikro-albuminúria (20–200 µg/min) bola prítomná v obidvoch vzorkách, stav u pacienta bol označený ako incipientná nefropatia. V prípade opakovanej hodnoty mikroalbuminúrie nad 200 µg/min bol stav považovaný za manifestnú nefropatiu. Všetci pacienti mali vyšetrený tlak krvi digitálnym tonometrom. Hodnoty krvného tlaku pod 90. percentilom pre daný vek, pohlavie a výšku boli považované za normálne, hodnoty medzi 90. a 95. percentilom boli považované za prehypertenziu a hodnoty nad 95. percentilom za hypertenziu.

Extrakcia DNA a vyšetrenie polymorfizmov

Na extrakciu genómovej DNA bola použitá štandardná fenol – choloroformová metóda. GST T1 a M1 génové polymorfizmy boli vyšetrené technikou polymerázovej reťazovej reakcie (polymerase chain reaction, PCR). Primery použité pre GST M1 polymorfizmus boli 5´- GAACTCCCTGAAAAGCTAAAGC-3´ a 5´- GTTGGGCTCAAATATACGGTGG-3´ a pre GST T1 5´- TTCGTTACTGGTCCTCACATCTC-3´ a 5´- TCACGGGATCATGGCCAGCA-3´. Za účelom vylúčenia falošne negatívnych výsledkov bola použitá kontrola beta-globínom. Použité primery pre beta-globín boli 5´- CAACTTCATCCACGTTCACC – 3´a 5´- GAAGAGCCAAGGACAGGTAC – 3´. PCR reakcia prebiehala v objeme 25 µl, z čoho 6 µl tvorili primery, 1 µl izolovaná DNA, 8 µl PCR zmes (Taq polymeráza, MgCl₂) a 10 µl redestilovaná voda. Dĺžka získaných produktov bola 215 bázových párov (bp), 480 bp a 268 bp pre GST M1, GST T1 a beta-globín v uvedenom poradí.

Štatistická analýza

Výsledky boli spracované štatistickým programom SYSTAT (verzia 11). Parametre boli vyjadrené ako priemer ± štandardná odchýlka. Pre vyjadrenie štatistickej významnosti bol použitý Studentov t test, pričom p menej ako 0,05 bolo považované za štatisticky významné. Pre stanovenie rizika bol multivariačnou logistickou regresiou stanovený parameter OR (odds ratio) s 95. konfidenčným intervalom (95CI).

VÝSLEDKY

Štúdie sa zúčastnilo 116 pacientov s T1D vo veku 6–19 rokov (priemer 12,95 ± 4,13 rokov), 53 ženského a 63 mužského pohlavia. Charakteristika skupiny je uvedená v tabuľke 2.

V našom súbore bolo 42 jedincov (36,21 %) nosičmi GST T1 null genotypu a 74 jedincov (63,79 %) GST T1 wild genotypu. GST M1 null genotyp bol prítomný u 46 diabetikov (39,66 %) a GST M1 wild genotyp u 70 pacientov (60,34 %). Diabetici s GST T1 null genotypom mali signifikantne vyššiu mikroalbuminúriu v porovnaní s diabetikmi s GST T1 wild genotypom (12,32 ± 17,08 vs. 7,14 ± 9,40 µg/min, p <0,05) (graf 1), pričom v ostatných sledovaných parametroch nebol nájdený signifikantný rozdiel. Podobne nebol potvrdený štatisticky významný rozdiel v sledovaných parametroch medzi jedincami s GST M1 null a wild genotypom (tab. 3).

Podľa opakovaného vyšetrenia mikroalbuminúrie bola diabetická nefropatia prítomná u 26 jedincov (22,41 %), pričom u všetkých bola v rozmedzí hodnôt charakteristických pre incipientnú nefropatiu. Dvaja pacienti s diabetickou nefropatiou mali jednorazovým vyšetrením zistené hodnoty krvného tlaku medzi 90. a 95. percentilom pre daný vek, pohlavie a výšku, všetci ostatní diabetici mali hodnoty tlaku krvi pod 90. percentilom. Pacienti s diabetickou incipientnou nefropatiou (DN+) mali signifikantne vyšší vek (15,08 ± 3,11 rokov vs. 12,35 ± 4,19, p <0,01), dlhšie trvanie diabetu (7,13 ± 4,22 rokov vs. 4,44 ± 3,73, p <0,01), vyšší BMI (20,65 ± 3,57 kg/m2 vs. 18,52 ± 3,30, p <0,01) a vyššiu mikroalbuminúriu (16,63 ± 18,87 µg//min vs. 7,68 ± 10,56, p <0,01) v porovnaní s diabetikmi bez nefropatie (DN-). Multivariačnou logistickou regresiou bol ako rizikový faktor pre vznik diabetickej nefropatie potvrdený vek (OR = 1,235, 95CI 1,072–1,424, p <0,01), trvanie diabetu (OR = 1,161, 95CI 1,040–1,296, p <0,01), body mass index (OR = 1,194, 95CI 1,048–1,361, p <0,01) a mikroalbuminúria (OR=1,034, 95CI 1,001 – 1,067, p <0,01). Častejší výskyt GST T1 null genotypu v podskupine DN+ nebol signifikantný (46,15 % vs. 33,33 %, OR = 1,714, 95CI 0,706–4,162, p >0,05), takisto ako riziko predstavené ostatnými génovými polymorfizmami (tab. 4).

DISKUSIA

Génové polymorfizmy glutatión S-trans-ferázy T1 a M1 sú považované za faktory, ktoré majú prinajmenšom parciálnu úlohu v etio-patogenéze mnohých stavov, ako sú kardio-vaskulárne, gastroenterologické, neurologické, respiračné, alergické, toxické alebo metabolické ochorenia [10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17]. Podľa posledných prác, GST T1 a M1 génové polymorfizmy ovplyvňujú tiež vývoj diabetes mellitus [18] a chronických diabetických komplikácií [19, 20]. Výsledky štúdií varírujú podľa jednotlivých autorov, regiónov a sledovanej populácie. Prevažná väčšina informácií bola opísaná u dospelých pacientov s T2D, doteraz sa iba jeden kolektív autorov zameriaval na adolescentov alebo mladých dospelých s T1D [21].

Podľa štatistickej analýzy výsledkov našej práce bola zistená signifikantne vyššia mikroalbuminúria u diabetikov s GST T1 null genotypom v porovnaní s pacientami s GST T1 wild genotypom, avšak v prípade GST M1 polymorfizmov nebol zistený signifikantný rozdiel. Častejší výskyt GST T1 null genotypu v podskupine DN+ však nebol signifikantný, čo mohlo byť spôsobené nízkym počtom subjektov v našom súbore. S podobnými informáciami o vplyve GST T1 a M1 genotypu na renálne komplikácie sa môžeme stretnúť aj v literatúre. Podľa posledných prác GST T1 null genotyp je asociovaný s chronickým zlyhaním obličiek u diabetických aj nediabetických jedincov bez ohľadu na GST M1 genotyp [22]. Podobne, GST M1 null genotyp nepredstavoval zvýšené riziko vzniku diabetickej nefropatie japonských pacientov s T2D [23] ani zvýšené riziko zlyhania obličiek [24], zatiaľ čo GST T1 null genotyp zvyšoval riziko zlyhania obličiek diabetických pacientov [24]. Podľa slovinských autorov GST T1 ani M1 genotyp nepredstavuje rizikový faktor pre vznik diabetickej nefropatie pacientov s T1D s priemerným vekom 27 rokov [25]. Tieto rozdielne výsledky môžu byť spôsobené regionálnymi rozdielmi alebo odlišnou dĺžkou trvania diabetu (priemerne 18 rokov v práci slovinských autorov v porovnaní s 5 rokmi v našej práci). Jedným z limitujúcich faktorov asociačných štúdií, ktoré vyhodnocujú vplyv genotypu na progresiu choroby je fakt, že s dlhším trvaním ochorenia sa vyvinie viac chronických komplikácií. Incipientná nefropatia bola v našom súbore prítomná u 22,4 % diabetikov. So zvyšovaním sa dĺžky trvania T1D sa dá predpokladať zvyšovanie prevalencie tejto chronickej komplikácie a teda aj odlišné výsledky asociácie nefropatie s GST génovými polymorfizmami. Vzhľadom na signifikantne nižšiu mikroalbuminúriu v podskupine detí s GST T1 null genotypom však predpokladáme aspoň čiastočný vplyv uvedených polymorfizmov v patogenéze diabetickej nefropatie.

V súvislosti s diabetickou nefropatiou boli študované aj génové polymorfizmy iných antioxidačných enzýmov. Súvis génových polymorfizmov katalázy s DN nebol dokázaný [26, 27], avšak bol potvrdený súvis génových polymorfizmov superoxiddizmutázy s diabetickou nefropatiou [28] a tiež so štádiami albuminúrie [29].

Podľa štatistickej analýzy výsledkov našej práce boli ako rizikové faktory pre vznik DN stanovené vek, trvanie diabetu, BMI a mikroalbuminúria, ktorých význam už bol v literatúre opísaný [30, 31]. Jedným z faktorov urýchľujúcich progresiu nefropatie je hypertenzia [32], ktorá sa vyskytuje často aj u detí s T1D [33]. Súvis GST génových polymorfizmov s vysokým tlakom krvi bola doteraz študovaná u iných než diabetických jedincov. Podľa publikovaných prác kombinácia genotypov GST T1 null/M1 null sa vyskytovala častejšie u pacientov s novodiagnostikovanou esenciálnou hypertenziou v porovnaní s normotenznými jedincami [34]. Podobne, jedinci s GST M1 null genotypom mali signifikantne vyššie riziko vývoja hypertenzie [35]. Okrem dvoch diabetikov mali všetci jedinci v našom súbore normálne hodnoty krvného tlaku, avšak pre presnejšie hodnotenie by bolo v budúcnosti vhodné 24-hodinové ambulantné monitorovanie tlaku krvi a jeho eventuálna korelácia s génovými polymorfizmami.

Prevažnú väčšinu pacientov v našom súbore tvorili pacienti s nedostatočnou kompenzáciou T1D, ktorí boli odosielaní regionálnymi endokrinológmi za účelom zlepšenia kompenzácie základného ochorenia. Táto skutočnosť pravdepodobne ovplyvnila priemernú koncentráciu glykozylovaného hemoglobínu v našom súbore a tiež frekvenciu výskytu incipientnej nefropatie – 22 % po piatich rokoch trvania T1D. Pre porovnanie, podľa prospektívnej štúdie EURODIAB Prospective Complications Study Group bola kumulatívna incidencia mikroalbuminúrie u pacientov s T1D 12,6 % po 7,3 rokoch trvania diabetu [36]. Prevalencia mikroalbuminúrie však môže dosiahnuť aj vyššie hodnoty – 18 % už pred 5 rokmi trvania T1D [37], najmä u pacientov s nedostatočnou kompenzáciou glykémie, s vysokou lipidémiou a hypertenziou. Navyše, nezávislým rizikovým faktorom pre mikroalbuminúriu je aj obdobie puberty [38], čo pravdepodobne prispelo k vyššej prevalencii mikroalbuminúrie aj v našom súbore, keďže priemerný vek sledovaných pacientov bol 13 rokov. U adolescentov s T1D často dochádza k zhoršeniu kompenzácie kvôli endokrinným zmenám v puberte (rastový faktor podobný inzulínu – IGF, sexuálne hormóny) [39], ale aj kvôli nedostatku fyzickej aktivity, nadmernému príjmu potravy, nedodržiavaniu inzulínového režimu, prípadne kvôli rizikovému správaniu (alkohol, fajčenie, drogy, antikoncepcia).

Podľa našich výsledkov u detí s T1D, null polymorfizmus glutatión S-transferázy T1 je asociovaný s vyššou koncentráciou mikroalbuminúrie, častejší výskyt tohto polymorfizmu u jedincov s incipientnou nefropatiou však nebol signifikantný. V budúcnosti sú vhodné ďalšie štúdie s väčším počtom sledovaných jedincov, ktoré by potvrdili alebo vyvrátili spojitosť GST polymorfizmov s chronickými diabetickými komplikáciami.

Poďakovanie

Za odbornú pomoc pri stanovení génových polymorfizmov ďakujeme doc. Mgr. Eve Babušíkovej, PhD., z Ústavu lekárskej biochémie Jesseniovej lekárskej fakulty Univerzity Komenského v Martine, pod vedením prof. MUDr. Dušana Dobrotu, CSc.

Práca bola podporená grantom „OPV – 26110230031/04/D/2010“a projektom “Dobudovanie Centra experimentálnej a klinickej respirológie – CEKR II”, ktorý je spolufinancovaný zo zdrojov EÚ.

Došlo: 19. 6. 2012

Přijato: 21. 10. 2012

MUDr. Jarmila Vojtková, PhD.

Klinika detí a dorastu JLF UK a UNM

Kollárova 2

036 01 Martin

Slovenská republika

e-mail: jarmilavojtkova@gmail.com