Degradační produkty kolagenu a elastinu jako možné ukazatele aktivity sklerodermie

Úvod.
U systémové (SSc) a lokalizované sklerodermie (LSc) nejsou zatím k dispozici žádné spolehlivé ukazatele aktivity. U obou onemocnění dochází k excesivnímu ukládání vláken kolagenu a elastinu v kůži a podkoží, u SSc navíc v cévní stěně a parenchymu většiny orgánů.

Cíle.
Cílem této studie bylo stanovit míru degradace kolagenu typu I, exkreci elastinu a sérové koncentrace prozánětlivých cytokinů u SSc a LSc a porovnat tyto skupiny s pacienty s psoriasis vulgaris (PsV) a zdravými jedinci (ZJ).

Pacienti a metody.
Celkem bylo vyšetřeno 91 jedinců – 24 se SSc, 16 s LSc a jako kontrolní skupiny 37 pacientů s PsV a 14 dárců krve. Močová exkrece pyridinolinu (U-PD) a deoxypyridinolinu (U-DPD) byla měřena pomocí HPLC. Močová exkrece rozpustného elastinu (U-SE) byla hodnocena kvantitativní imunoprecipitační metodou, sérové koncentrace interleukinu-6 (IL-6) a solubilního receptoru pro interleukin-2 (IL-2R) byly stanoveny pomocí souprav ELISA. Všechna měření byla provedena při vstupu a po jednom roce.

Výsledky.
Hladiny U-PD byly při vstupu a po roce nejvyšší u SSc. Při vstupu byly koncentrace U-PD zvýšené u SSc a LSc ve srovnání se ZJ (u obou skupin p < 0,0001). Pacienti se SSc měli také vyšší hladiny ve srovnání s PsV (p < 0,001). Při vstupu byly U-DPD u SSc zvýšené ve srovnání se ZJ a LSc (p = 0,006 a p < 0,001). Při vstupu byly zvýšené koncentrace U-SE u skupiny PsV ve srovnání se ZJ (p < 0,001). Po roce byly tyto koncentrace významně vyšší u skupin SSc a PsV ve srovnání se ZJ (u obou p = 0,001). Hladiny IL-6 byly při vstupu zvýšené u skupin SSc, LSc a PsV ve srovnání se ZJ (p < 0,0001, p < 0,001 a p = 0,004), po roce však pouze u SSc (p < 0,001). Hladiny IL-2R se nelišily v žádné době.

Závěry.
Zvýšené ukazatele metabolismu kolagenu a elastinu u SSc a LSc odrážejí aktivní fibrotický proces u těchto nemocí a jsou v souladu s již publikovanými daty. Vysoká exkrece elastinu u nemocných PsV je překvapivá a nemáme pro ni dosud vysvětlení.

Klíčová slova:
systémová sklerodermie, morfea, psoriáza, kolagen, elastin, aktivita

Úvod

Termín sklerodermie označuje onemocnění charakterizovaná vznikem tuhé kůže, podmíněné zvýšenou produkcí a sklerotizací vaziva. Dochází-li k symetrickému tuhnutí kůže s postižením vnitřních orgánů, mluvíme o systémové sklerodermii (SSc). SSc postihuje kromě kůže zejména gastrointestinální trakt, plíce, srdce a ledviny. Dosud se nepodařilo vysvětlit: značnou variabilitu rozsahu a progrese této nemoci, rychlé hromadění složek extracelulární matrix v kůži a vnitřních orgánech, časté a typické imunologické odchylky. Pozorujeme nepravidelné střídání akutních a chronických zánětlivých změn a všudypřítomné a charakteristické změny struktury a funkce cév (1).

V patogenezi hrají významnou roli endoteliální buňky, jejichž funkce bývají při SSc narušeny, zejména tvorba prostacyklinu bývá snížena a dochází k aktivaci destiček. Skupina transformujících růstových faktorů beta 1–5 stimuluje tvorbu kolagenu a fibronektinu a inhibuje růst epitelií a endotelií. Tím může vyvolávat rozpad bazálních membrán a následné větvení cév a neovaskularizaci. IL-1 je produkován makrofágy a stimuluje proliferaci fibroblastů a syntézu kolagenu typu I a III. IL-2 produkovaný T lymfocyty působí jako růstový faktor fibroblastů, a proto bývají zvýšené jeho sérové hladiny i jeho solubilního receptoru (sIL-2R) u nemocných SSc a korelují s progresí choroby (3). IL-6 jako jeden z hlavních mediátorů zánětu je produkován T a B lymfocyty, fibroblasty, endoteliemi a keratinocyty. Může indukovat zvýšenou syntézu složek extracelulární matrix.

Je-li onemocnění omezeno pouze na kůži, bez nebo jen s minimálním, postižením vnitřních orgánů, jedná se o sklerodermii cirkumskriptní (4) neboli lokalizovanou či o morpheu (LSc) (5). Psoriasis vulgaris (PsV) postihuje v našich zemích kolem dvou procent populace. Jedná se o proces charakterizovaný abnormální diferenciací a hyperproliferací keratinocytů, endotelií, infiltrací zánětlivými buňkami a s pravděpodobnou účastí nervového systému. V současnosti se významná role při vzniku psoriázy přisuzuje imunitnímu systému (6), bývá považována za autoimunitní onemocnění (7).

SSc a LSc nemají spolehlivé ukazatele aktivity, protože běžné reaktanty akutní fáze nevystihují aktivitu těchto chorob. Jak bylo již uvedeno, excesivní ukládání komponent extracelulární matrix fibroblasty zejména kolagenu a elastinu vede k poruše rovnováhy mezi tvorbou a degradací těchto vláknitých bílkovin (8). Změny degradace zralého kolagenu a elastinu je možné kvantifikovat měřením močové exkrece příčněvazebných aminokyselinových elementů. Jedná se o pyridinolin (PD), který je produktem kolagenu typu I, II, III, V a XI a deoxypyridinolinu (kolagen typu I) (DPD), dále pak solubilní elastin (SE) nebo jeho příčněvazebné elementy, desmosinu a isodemosinu (9). U LSc by tyto močové ukazatele degradace pojiva mohly pomoci určit aktivitu procesu a zda je možné ještě terapeuticky zasáhnout a předejít tak rozvoji funkčního až mutilujícího postižení. PsV byla zařazena jako srovnávací diagnóza, neboť na rozdíl od SSc a LSc, zánětlivých onemocnění postihujících vazivo, se jedná o nemoc s převážným postižením epitelu (10).

Cíle tohoto projektu byly následující: 1. Vytvořit skupinu 20 nemocných s definitivní diagnózou SSc, 20 jedinců s LSc a jako kontrolní skupiny 20 nemocných PsV a 20 zdravých jedinců. 2. Podle vypracovaného protokolu provést vstupní vyšetření – část anamnestickou, klinickou a u SSc laboratorní testy a vyšetření orgánových systémů. 3. U všech skupin stanovit hladiny prozánětlivých cytokinů – IL-6 a IL-2R a degradačních produktů kolagenu v moči - U-PD a U-DPD a U-SE. 4. Provést kompletní kontrolní klinické, laboratorní vyšetření včetně stanovení uvedených ukazatelů po jednom roce.

Pacienti a metody

Pacienti

Bylo vyšetřeno 24 pacientů s SSc. Diagnóza byla stanovena dermatologem na základě kožních a u nejasných případů na základě histopatologických nálezů z kožní biopsie. Pacienti byli dále charakterizováni podle klasifikačních kritérií a rozděleni do podskupin (2): 14 (58,36 %) s limitovanou formou, 5 (20,69 %) s difuzní formou, 3 (12,71 %) jedinci s formou sclerodermia sine scleroderma, 1 (4,12 %) s překryvným syndromem a 1 (4,12 %) nemocný s nediferencovaným onemocněním pojiva. Jedinci se systémovou nebo plicní hypertenzí, s jinými fibrotizujícími procesy a s příznaky manifestní aterosklerózy byli vyloučeni ze studie.

Dále bylo vyšetřeno 16 nemocných s různými typy LSc, u nichž diagnóza byla také stanovená dermatologem. Jako kontrolní skupiny bylo vyšetřeno 37 pacientů s PsV s různým rozsahem kožního postižení a 20 zdravých jedinců (ZJ) (dárců krve). Základní demografická charakteristika je uvedena v tabulce 1.

Metody

U nemocných SSc byla provedena základní hematologická, biochemická vyšetření séra a vyšetření moči. Krevní obraz byl stanoven na automatickém analyzátoru (Sysmex).Dále bylo provedeno vyšetření rychlosti sedimentace erytrocytů dle Fahraeuse a Westergrena za hodinu (FW). Ke stanovení jednotlivých frakcí sérových bílkovin bylo použito elektroforézy. Sérové koncentrace laktátdehydrogenázy, kreatinkinázy, kreatininu a močoviny byly stanoveny na automatickém analyzátoru (Hitachi). Dále bylo provedeno vyšetření moči chemicky, sedimentu a proteinurie za 24 hodin.

U nemocných SSc a LSc byly detekovány antinukleární protilátky (ANA) pomocí nepřímé imunofluorescence na HEP2 buňkách. Dále bylo provedeno vyšetření imunoblottingem, kde se detekují autoprotilátky komplexu ENA – U1RNP, NRNP, Ro, La, a dále anti Scl-70, Jo-1, P-protein, Sm, ACA a neznámé autoprotilátky.

Stanovení močové exkrece pyridinolinu a deoxypyridinolinu

Stanovení U-PD a U-DPD bylo provedeno pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) kombinované s fluorescenční detekcí, jak bylo popsáno dříve (11). Dosažený detekční limit pro obě příčné vazby je 200 fentomol. Naměřené množství PD a DPD bylo vztaženo na koncentraci močového kreatininu. Udává se v jednotkách nmol/mmol kreatininu.

Stanovení koncentrace rozpustného elastinu v moči

Ke stanovení koncentrace U-SE byla použita kvantitativní „dye-binding“ metoda (komerční sada Fastin Elastin, firmy Biocolor Ltd., N. Ireland). Elastin ve vzorcích moči byl měřen v dubletech a kvantitativně vyhodnocen na základě kalibrační křivky získané z komerčně dodaných standardů elastinu. Výrobcem udávaný detekční limit metody je 5 mikrogramů.

Stanovení sérových hladin IL-6 a IL-2R

Stanovení plazmatických hladin bylo provedeno enzymovou imunosorbentní analýzou pomocí komerčně vyráběných setů (BioSource International, Inc., California, USA). Citlivost eseje použité metody byla pro IL-2R 36 pg/ml a pro IL-6 1,4 pg/ml. Interassay koeficient byl 5,2 %.

Vyšetření tkání a orgánů

Kapilaroskopické vyšetření

Dále bylo provedeno kapilaroskopické vyšetření nehtových valů, kdy jsme vycházeli z metodiky popisu morfologických změn podle Maricqové (12), kterou jsme později kvantifikovali (13).

Kardiologické vyšetření

U všech nemocných byl proveden delší záznam EKG a echokardiografické vyšetření. U pacientů s nálezem četnějších extrasystol bylo provedeno EKG Holterovo monitorování.

Kožní vyšetření

U nemocných SSc byl hodnocen rozsah a závažnost kožního postižení pomocí kožního skóre modifikovanou metodou podle Rodnana (14). U pacientů s LSc (morpheou) bylo provedeno hodnocení rozsahu a závažnosti kožní postižení pomocí skóre podle Seygera a spol. (15). U pacientů s PsV bylo provedeno hodnocení rozsahu a závažnosti kožní postižení pomocí skóre PASI.

Plicní vyšetření

U všech nemocných SSc bylo provedeno fyzikální vyšetření hrudníku, zadopřední a bočný skiagram hrudníku. Následovalo spirometrické vyšetření a stanovení DLCO. Funkční vyšetření plic bylo provedeno na celotělovém pletyzmografu Medgraphics 1085 Series (USA) a byly měřeny tyto parametry: FVC, FEV-1 a pO₂. Vyšetření difuzní kapacity plic pro CO bylo provedeno metodou jednoho dechu “single breath” na přístroji Medgraphics PF/Dx, (USA). Hodnocení stupně postižení bylo vyjádřeno v % normálních hodnot ve věku nemocného. Vyšetření HRCT hrudníku bylo provedeno vysoce rozlišujícím algoritmem s hodnotami 130 kV, 70-100 mA, 3 s, kolimace 2 mm. Intervaly mezi skeny byly 15–20 mm. Hodnoceny byly tyto nálezy: mlhovité zvýšení denzity, centrilobulární mikronoduly, prominence centrilobulárních struktur, kondenzace, uzly, nerovné kontury dotyku, peribronchiální ztluštění, ztluštění stěn bronchů, dilatace bronchiolů, pleurální a subpleurální ztluštění, subpleurální nepravidelné linie, distorze parenchymu, septální linie, neseptální nepravidelné linie a pruhy a voštinovitá plíce. Stupeň aktivity (alveolitidy) a intersticiální fibrózy byl kódován takto: 0 – žádné změny, 1 – mírné změny, 2 – střední změny, 3 – významné změny.

Vyšetření jícnu

Všichni nemocní podstoupili scintigrafické vyšetření jícnu po polknutí látky značené radionuklidem Tc. Změny byly hodnoceny třemi stupni: 0 – normální nález, 1 – mírně zpomalená peristaltika, 2 – výrazně zpomalená peristaltika.

Ke statistickému zpracování výsledků byly použity tyto testy: Studentův t-test a Pearsonův korelační koeficient.

Výsledky

Laboratorní vyšetření

Všichni pacienti SSc měli normální krevní obraz i při roční kontrole a průměrná hodnota FW za jednu hodinu dosahovala pouze hraničních hodnot. Také hodnoty vybraných biochemických testů u nemocných SSc byly v mezích normy a po roce se lišily pouze nevýznamně. Chemické vyšetření moči prokázalo ve velmi nízkém procentu hematurii a proteinurii, která kvantitativně byla pozitivní pouze u jediné nemocné.

Výsledky imunologických ukazatelů

Při vyhodnocování výsledků imunologických testů u nemocných SSc a LSc byla soustředěna pozornost zejména na tyto autoprotilátky: celkové ANA, ACA, anti-Scl 70 a anti-U1RNP. U nemocných LSc byla zjištěna přítomnost ANA jen u dvou nemocných v nízkém titru. U nemocných SSc byla zjištěna pozitivita ANA u 95,83 % pacientů, při čemž nejčastěji se vyskytoval jemně zrnitý typ imunofluorescence (56,52 %). Přítomnost ACA byla zjištěna u 3 nemocných (12,50 %) a pozitivita anti-Scl 70 u 10 (41,67 %). U 5 pacientů (20,83 %) byly prokázány protilátky proti ENA, u 2 jedinců (8,33 %) pak v imunoblottingu neznámá autoprotilátka. Jiné autoprotilátky byly detekovány jen ojediněle (tab. 2).

Klinická vyšetření

Kardiologické a kapilaroskopické vyšetření

Echokardiografické vyšetření neprokázalo u žádného pacienta nepřímé známky plicní arteriální hypertenze. U jedné nemocné byly zachyceny supraventrikulární dysrytmie, ale podle Holterova monitorování byl jejich výskyt ojedinělý. Kapilaroskopické nálezy se u skupiny SSc po roce významně nezměnily (tab. 3).

Kožní vyšetření

U skupiny SSc byly hodnoty kožního skóre v průměru nízké (7,89) a po roce se významně nelišily. U skupiny PsV bylo vstupní PASI skóre relativně nízké se značným rozptylem hodnot, po roce se významně nezměnilo, podobné výsledky jsme také zaznamenali u morphea skóre ve skupině s LSc (tab. 3).

Výsledky vyšetření plic a jícnu

U nemocných SSc hodnoty všech sledovaných funkčních parametrů plic byly při vstupním vyšetření i po roce normální významně se nelišily, DLCO bylo snížené a po roce byl naměřen pokles (tab. 4). Obraz HRCT hrudníku byl u poloviny nemocných normální a zjištěné změny po roce významně neprogredovaly. Scintigrafické vyšetření jícnu ukázalo u většiny nemocných lehkou nebo střední poruchu motility a tento nález se po roce nezměnil.

Výsledky prozánětlivých cytokinů a degradačních produktů kolagenu a elastinu

Průměrné hodnoty studovaných ukazatelů při vstupním vyšetření a po 1 roce v jednotlivých skupinách jsou uvedeny v tabulce 5.

Plazmatické hladiny IL-6 a IL-2R

Průměrná plazmatická hladina IL-6 byla nejvyšší při vstupním vyšetření i při kontrolním odběru u skupiny SSc (tab. 5). Nejnižší průměrná hodnota byla zjištěna u ZJ. Při vstupním vyšetření byly hodnoty u skupin SSc, LSc a PsV významně vyšší oproti ZJ (tab. 7). Po 1 roce měli pouze nemocní SSc významně vyšší hodnoty ve srovnání se ZJ a pacienty s LSc.

Průměrná plazmatická hladina IL-2R byla nejvyšší při vstupním vyšetření u skupiny PsV a při ročním kontrolním odběru u skupiny SSc (tab. 5). Nejnižší průměrná hodnota byla zjištěna u ZJ. Při vstupním vyšetření byly významně vyšší hodnoty u skupiny PsV ve srovnání se ZJ, SSc a LSc (tab. 7). Po roce byly u skupin SSc, LSc a PsV vyšší hodnoty ve srovnání se ZJ na nízké hladině významnosti.

Močová exkrece PD a DPD

Průměrná U-DP byla nejvyšší při vstupním vyšetření i při kontrolním odběru u skupiny SSc (tab. 5). Nejnižší průměrná hodnota byla zjištěna při vstupním sběru u skupiny LSc a při kontrolním sběru u nemocných PsV. Při vstupním vyšetření byly hodnoty u skupin SSc a LSc významně vyšší ve srovnání se ZJ (tab. 8). Nemocní SSc měli také vyšší hodnoty ve srovnání s pacienty s LSc a PsV na nízké hladině významnosti. Při roční kontrole nebyly zjištěny významné rozdíly.

Průměrná U-DPD byla nejvyšší při vstupním i kontrolním sběru u skupiny SSc (tab. 5). Nejnižší průměrná hodnota byla zjištěna při vstupu i při kontrolním sběru u nemocných LSc. Při vstupním vyšetření byla U-DPD významně vyšší u skupiny SSc ve srovnání se ZJ, LSc a PsV (tab. 9). Při roční kontrole nebyly zjištěny významné rozdíly.

Močová exkrece rozpustného elastinu

Průměrná U-SE byla nejvyšší při vstupním vyšetření u skupiny PsV a při kontrolním odběru u skupiny SSc (tab. 6). Nejnižší průměrná hodnota byla zjištěna při vstupním sběru u ZJ a při kontrolním sběru u nemocných LSc. Při vstupním vyšetření skupina PsV měla hodnoty U-SE významně vyšší než ZJ, ve srovnání s SSc a LSc byly rozdíly méně významné (tab. 10). Při kontrolním sběru měli nemocní SSc významně vyšší hodnoty ve srovnání s nemocnými LSc a skupinou ZJ. Nemocní PsV měli významně vyšší hodnoty ve srovnání se skupinou LSc a ZJ.

Diskuse a závěr

U pacientů se SSc naše výsledky ukázaly nejintenzivnější degradaci kolagenu a současně aktivní zánětlivý proces dokumentovaný zvýšenými sérovými hladinami IL-6, což odráží patologické děje v kůži a viscerálních orgánech ve srovnání s pacienty s PsV a zdravými jedinci. U nemocných SSc je pozoruhodný pokles hodnot U-PD a U-DPD po roce na polovinu, který byl statisticky významný. V naší předchozí studii (16) všechny čtyři měřené ukazatele nepřesáhly normální hodnoty. Tento rozpor můžeme vysvětlit jiným složením skupiny (odlišná aktivita a závažnost nemoci) a je třeba vzít v úvahu i účinky terapie. I tak jsme tehdy zaznamenali některé klinické korelace. Hladiny U-DPD a solubilního IL-2R korelovaly s hodnotami zjednodušeného dotazníku kvality života, sérové hladiny IL-6 s počtem leukocytů v krevním obraze. Ištok a spol. (17) stanovili U-PD a U-DPD u nemocných s různými formami SSc, Raynaudovým fenoménem a osteoporózou. Zjistili podobně zvýšené hodnoty jako námi prezentovaná data zejména u nemocných s difuzní formou SSc a Raynaudovým fenoménem ve srovnání se zdravými jedinci. Stejná skupina studovala (18) množství PD v různých tkáních (endokard, fascie a močový měchýř) u pacientů se SSc. Pozorovali zvýšené množství této příčné vazby (1,41x, 1,26x and 2,64x) ve srovnání s tkáněmi zdravých jedinců.

Dále naše výsledky ukazují, že u LSc byla degradace kolagenu podobná jako u PsV a ZJ, ale byla pozorována určitá zánětlivá aktivita. Brinckmann a spol. (19) studovali příčné vazby u lipodermatosklerózy a LSc s otázkou, zda všechny zralé příčné vazby jsou zvýšené u fibrózy v souvislosti se zvýšením PD a DPD. Zjistili pokles koncentrace těchto vazebných elementů po lázních psoralenem a ozáření ultrafialovým světlem A u šesti z devíti nemocných LSc. Podle jejich hodnocení tento výsledek odráží remodelaci extracelulární matrix.

Námi naměřené hodnoty U-SE je obtížné interpretovat, zejména překvapily vstupní nejvyšší hodnoty u skupiny PsV, kde změny metabolismu elastinu dosud nebyly zjištěny. Stone a spol. (20) zjistili u nemocných SSc významně zvýšené ex-krece desmosinu a isodesmosinu, kdežto naše data ukázala vyšší hodnoty rozpustného elastinu u nemocných PsV než srovnání s SSc.

Závěrem lze konstatovat, že přínos měření příčně vazebných elementů odvozených od pojivových bílkovin u fibrotizujících procesů v tělních tekutinách je diskutabilní. Daleko relevantnější se jeví analýzy těchto ukazatelů ve změněných tkáních a zejména pak studie na genové úrovni. K tomuto účelu jsou zapotřebí rozsáhlejší mezinárodní výzkumné projekty.

Poděkování: Tato práce se uskutečnila za podpory Výzkumných záměrů Ministerstva zdravotnictví ČR č. 00000023728.

Doc. MUDr. Radim Bečvář, CSc.

Revmatologický ústav

Na Slupi 4

128 50 Praha 2

e-mail: becv@revma.cz