Protilátky proti složkám komplementového systému a systémový lupus erythematodes

SLE je onemocnění charakterizované nadprodukcí různých typů autoprotilátek. Za jistých okolností lze zjistit přítomnost autoprotilátek rovněž proti neoepitopům komplementového systému. Neoepitopy nejsou přítomny v nativních proteinech, ale objevují se při jejich strukturálních změnách. Mezi známé antikomplementové autoprotilátky patří: C3 nefritický faktor, protilátka proti C1 inhibitoru či protilátky proti C1R (C1 receptor). Bezesporu nejvýznamnější autoprotilátkou proti komplementu jsou anti-C1q protilátky. Jsou přítomny asi u třetiny nemocných se SLE, korelují s klinickou aktivitou a s přítomností lupusové glomerulonefritidy. Vysoké titry anti C1q protilátek jsou doprovázeny sníženými hladinami C1 ale také C3 a zejména C4 složky komplementu. Přítomnost anti-C1q protilátek není omezena či specifická pouze pro lupus. Poprvé byly popsány v případě syndromu HUVS (Hypocomplementemic Urticar Vasculitis Sydrome), později také při Feltyho syndromu, revmatoidní vaskulitidě, u hepatitidy C a ve stárnoucí populaci. Asociace mezi přítomností protilátek anti C1q, spotřebou komplementu a přítomností renálního postižení v případě SLE vzbuzuje otázku, zda a jak se tyto autoprotilátky podílejí na patogenezi orgánového postižení. Jak ukazují zvířecí modely choroby, pro vznik lupusové nefritidy je potřebná přítomnost jak anti-dsDNA, tak anti-C1q protilátek, jejichž vzájemná interakce spouští mechanizmy rozvoje imunokomplexového renálního postižení.

Klíčová slova:
systémový lupus erythematodes, komplementový systém, anti C1q protilátky

Úvod

SLE (systémový lupus erythematodes) je choroba charakteristická největším známým počtem různých typů autoprotilátek. Jejich produkce může být řízena antigenem, je však také výsledkem aktivace B buněk a poruch apoptózy a výsledkem dysregulace cytokinové sítě. U SLE bylo popsáno více než sto autoprotilátek, které cílí nukleární, cytoplazmatické, membránové či fosfolipidové antigeny, dále krevní a endoteliální buňky, antigeny v nervovém systému, plazmatické či matrixové proteiny včetně CRP a různé další antigeny (1).

V patogenezi SLE hraje komplement ambivalentní roli (2). Aktivace komplementu přispívá k tkáňovému postižení, komplementový systém však současně zvyšuje solubilitu imunokomplexů zejména při jejich transportu k fagocytárním buňkám při odstraňování apoptotického materiálu z cirkulace a tím působí proti autoimunitním mechanismům (3). Jak se pokusí ukázat tato práce, komplement se může rovněž stát cílem autoprotilátek, což může mít pro rozvoj SLE důležité patogenetické i klinické relevantní důsledky

2. Komplementový systém

Komplement je fylogeneticky starou součástí imunitního systému a spolu s interferonem, cytokiny a chemokiny představuje jednu ze základních složek nespecifické odpovědi. Komplementový systém je tvořen více než dvaceti membránovými a sérovými proteiny (enzymy), které jsou tvořeny jaterní buňkou, v menší míře pak monocytomakrofágovým systémem či jinými buňkami.

Komplement představuje hlavní efektorový mechanismus zánětlivé odpovědi, hraje důležitou roli v fyziologickém odstranění imunokomplexů a rovněž má pomocnou roli v indukci protilátkové odpovědi. Může být aktivován třemi různými cestami, klasickou, alternativní a lektinovou. Aktivace probíhá formou kaskádovitého štěpení (cleavage) jednotlivých součástí komplementu, při kterém vznikají jeho aktivní formy.

Klasická cesta aktivace komplementu je závislá na protilátkách a je aktivována agregovanými IgG či IgM protilátkami v imunokomplexech. Lektinová cesta aktivace komplementu je nezávislá na protilátkách a je aktivovaná vazbou lektinu vážícího manózu (mannose-binding lectin, MBL) na bakteriální povrchy. Alternativní cesta je vývojově starší, je nezávislá na protilátkách či imunokomplexech a je aktivována potenciálními patogeny. Tři cesty aktivace komplementu se protínají v tvorbě C3b konvertázy, která přetváří nativní C3 do aktivní formy C3b. Aktivace komplementu pokračuje tvorbou trimolekulárního komplexu C3b konvertázy, C3b a C5. Po kaskádě aktivace dochází na buněčné stěně k vytvoření komplexu atakujícího membránu ze složek C5b-C9, který způsobí osmotickou lýzu buňky (membrane attacking complex, MAC). Z hlediska správné funkce je důležité přesné pořadí aktivace jednotlivých složek, chybí-li některý z proteinů, je celá sekvence přerušena (3, 4). Tradičně jsou přisuzovány komplementu čtyři biologické role – opsonizace, aktivace zánětu, clearance imunokomplexů a osmotická cytolýza infekčních agens. V posledních dekádách byla popsána řada dalších funkcí komplementu, který zřejmě slouží rovněž jako pojítko mezi vrozenou a adaptivní imunitou (5, 6).

2.1. Klasická cesta aktivace komplementu

Úvodním krokem v klasické cestě aktivace komplementu je vazba dvou či více globulárních domén C1q složky na Fc fragment protilátek vázaných na antigen. Samotná IgG či IgM protilátka je pouze slabým aktivátorem této složky. Dvě a dvě molekuly C1r a C1s vytvoří tetramer, který se naváže na tento komplex, což vede k jeho strukturální změně a rozštěpení C1s na aktivní enzymy (7). Jeho hlavní funkcí je rozštěpení neaktivní složky C4 na C4b a C4a fragmenty. Zejména pak C4b složka hraje klíčovou roli v tvorbě C3 konvertázy vznikající jako komplex C4b s C2a. Tento enzym rozštěpí C3, což vede v tvorbě velkého množství C3b složky pokrývající aktivované povrchy, tento fenomén se nazývá opsonizace. C4bC2a komplex váže také aktivní C3b, čímž vzniká další enzym v kaskádě, C5 konvertáza.

2.2. Alternativní cesta aktivace komplementu

Alternativní cesta aktivace komplementu zahrnuje šest plazmatických proteinů: C3, faktory B, D, H, I a properdin. Základním rysem alternativní cesty je možnost aktivace mechanismem nezávislým na protilátkách, a to působením patogenů jako jsou bakterie, houby, viry, paraziti či abnormální vlastní tkáně – nádorové buňky či infikované buňky. Tato cesta aktivace je ve stálém stavu mírné aktivity vyúsťující do trvalé tvorby nižších hladin aktivovaného C3b. Prvním krokem je interakce faktoru B s C3i v tekuté fázi nebo s C3b na cílovém povrchu. Faktor B je proteolyticky rozštěpen na aktivní Bb a neaktivní Ba. Komplex C3bBb vykazuje silnou C3 štěpící aktivitu a je také známý jako C3 konvertáza alternativní cesty. Faktor H a I působí jako regulační proteiny. Pro osud C3b je velmi důležitý charakter aktivovaného povrchu, ke kterému je enzym vázaný kovalentní vazbou. Pokud se jedná o „cizí“ povrchy (například bakterie), mohou tyto působit jako akceptory faktoru B a tím spouštět amplifikační kličku alternativní cesty. Jelikož faktory H a I, potažmo membránové regulační molekuly CD35 a CD46 činí vazbu C3b na vlastní povrchy nestabilní, k aktivaci C3 konvertázy nedochází. Tzv. amplifikační klička alternativní cesty aktivace komplementu působí prostřednictvím C3 konvertázy produkci velkého množství C3b složky, která má opět schopnost vazby na cizorodé povrchy a celý systém pozitivní zpětnou vazbou posiluje (3).

2.3. Lektinová cesta aktivace komplementu

Aktivace lektinové cesty je vyvolána vazbou MBL (mannose binding lectin) na terminální skupiny manózy na površích některých bakterií. Tato vazba vede k aktivaci dvou proteáz MASP-1 a MASP-2 vykazujících blízkou příbuznost k molekulám C1r a C1s. MASP-1 pak štěpí C4 a C2 velmi podobným způsobem jako C1s, což vede k tvorbě C3 konvertázy. Fyziologická funkce MASP-1 není známá (3).

2.4. Terminální cesta

Všechny tři cesty aktivace komplementu se protínají v oblasti štěpení C3 složky komplementu. Konečnou fází aktivace komplementu je tvorba komplexu atakujícího membrány (membrane attacking complex, MAC). C3 konvertázy všech cest aktivace komplementu váží další volné C3b molekuly za vniku C5 konvertáz (C4b2aC3b a C3bBbC3b). Rozštěpení C5 složky komplementu C5 konvertázou vytvoří C5a a C5b fragmenty. C5b reaguje s C6, následně s C7 a C8 složkami komplementu. Konečným krokem je pak vazba komplexu C5b-C8 s C9 složkou. Tím je tvorba MAC komplexu dokončena (3).

2.5 Regulace aktivace komplementu

Aktivace komplementu je ve všech fází regulovaná, což ochraňuje vlastní tkáně před vedlejšími efekty aktivace komplementu při obraně proti cizorodým organismům. Evoluce komplementového systému šla ruku v ruce s evolucí složitých regulačních mechanismů, které se uplatňují na několika úrovních v fázi „tekuté“ i povrchové aktivace komplementu.

C1 inhibitor blokuje C1 složku komplementu a reguluje podobně jako C4b vázající protein klasickou cestu aktivace C3 konvertázy. Faktory H a I se zásadní měrou účastní regulace alternativní cesty. Vitronektin interaguje s reaktivními místy C5b-7 komplexu, což omezuje konečnou schopnost MAC komplexu přilnout k buněčné membráně a chrání tak zdravé hostitelské buňky. Tyto molekuly se řadí mezi regulační proteiny tekuté fáze. Na membránových površích se uplatňují regulátory tvorby C3 a C5 konvertáz (MCP, DAF a CR1) a protein inhibující inserci MAC k membránám, CD59 (3).

3. Role komplementu v patogenezi SLE

SLE může sloužit jako prototyp onemocnění, u kterého se vyskytuje široká škála manifestací spojených s aktivací či dysfunkcí komplementového systému hrajících důležitou roli v patogenezi této choroby (3, 8, 9). Se SLE se pojí řada vrozených i získaných deficiencí komplementu. Dominantní cestou aktivace komplementu je v případě SLE klasická cesta iniciovaná interakcí C1q složky s imunokomplexy. Složky klasické cesty (C1, C2, C4) jsou u aktivního lupusu většinou nízké. Hladiny C3 jsou typicky na dolní hranici fyziologické normy, ale mohou být i signifikantně snížené. Aktivaci komplementu zahajuje jeho interakce s imunokomplexy, které aktivují hlavní cestu. Mechanismus, kterým imunokomplexy zprostředkovávají poškození tkání, je předmětem intenzivního studia. Do nedávna převládal lehce zjednodušený názor, že poškození tkání je důsledkem produkce imunokomplexů aktivujících komplement, který pak iniciuje zánětlivou reakci prostřednictvím aktivace enzymatické kaskády jednotlivých složek komplementu, koagulace a cytokinové sítě. Tyto děje jsou pak následovány přílivem zánětlivých buněk, zejména polymorfonukleárů a monocytů. Vývoj myších kmenů s chybějícím geny pro jednotlivé proteiny zánětlivé kaskády vytvořil několik zvířecích modelů pro studium mechamismů tkáňového poškození mediovaného imunokomplexy (8, 10, 11), které ukazují roli komplementu v těchto dějích v nové perspektivě. Důležitou se jeví zejména vazba komplementu prostřednictvím jeho receptoru pro Fc fragment protilátek k imunokomplexům, která pak aktivuje a udržuje zánětlivou reakci na jejich přítomnost. Je zřejmé, že význam jednotlivých typů imunokomplexů pro patogenezi SLE není identický a že je odvislý od místa jejich tvorby a typu zúčastněného antigenu (12). V mnoho zvířecích modelech byla tak potvrzena dominantní funkce Fc receptorů v tkáňovém poškození. Jiné modely pak prokázaly zásadní vliv aktivace anafylatoxinu C5a pro plnou expresi tkáňového poškození mediovaného imunokomplexy (13).

Výskyt vrozených deficiencí komplementu je v populaci nízký, ale jsou velmi významně spojeny s rozvojem různých chorob (14). Homozygotní deficience každého z ranných proteinů aktivace klasické cesty (C1q, C1r, C1s, C2, C4) je silně spojena s rozvojem SLE (15-23). Tyto deficience jsou jedny z nejsilnějších genetických vazeb chorobných stavů popsaných u lidí (24). Existuje jednoznačná hierarchie prevalence a závažnosti SLE dle pozice, kterou daný protein v kaskádě zaujímá. Nejčastější a nejzávažnější jsou deficience proteinů C1 komplexu a C4 složky komplementu (25, 26).

Nejlépe definovaným genetickým defektem souvisejícím se SLE je selektivní chybění C1q složky komplementu (27–29). Tato vzácná genetická abnormalita byla intenzivně studovaná v postižených rodinách (viz Pickering pro detailní review, 30). Postižení jedinci trpí často závažnou formou lupusu od dětského věku. Homozygotní deficience samotné C4a složky či heterozygotní deficience C4a a/nebo C4b je častější a je rovněž popsána vazba k SLE (19, 30).

Slabší asociace s lupusem je pozorována také při defektech proteinů alternativní či MBL cesty aktivace komplementu. Genetické poruchy terminální společné cesty aktivace jsou spojeny spíše než s autoimunitními projevy se zvýšeným rizikem bakteriálních infekcí včetně meningokokové sepse (30).

Existují tři hlavní, navzájem se však nevylučující hypotézy, které se pokoušejí vysvětlit roli vrozených i získaných defektů komplementu v patogenezi SLE (11). První teorie vidí chybění komplementu jako podmínku vedoucí k nedostatečné clearanci imunokomplexů, jelikož vazba komplementu (zejména C1q, C4b, C3b) ovlivňuje kovalentní vazbou jejich velikost a rozpustnost a poskytuje další vazebné místo potřebné pro jejich efektivní odstranění (28). Tato hypotéza je v souladu s další teorií, která ji vidí zejména v porušené clearanci apoptotického jaderného materiálu. Ten se může stát, pokud není efektivně odstraněn, zdrojem autoantigenů – nukleozomů (10). Nukleozomy pak vyvolávají protilátkovou odpověď a tvorbu antinukleozomálních protilátek, které se stávají prostřednictvím rozšířených epitopů při humorální odpovědi zdrojem dalších antigenních komponent (dsDNA, histony). Defektní clearance apoptotického materiálu hraje zjevně roli rovněž při vrozené deficienci C1q (24, 30). Dále bylo prokázáno, že C1q složka komplementu se váže k apoptotickým keratocytům (31) a v případě C1q deficientní myši byla pozorována zvýšená apoptóza renálních buněk (24). Rovněž monocyty patientů s C1q defektem vykazují nedostatečnou schopnost odstraňovat apoptotické buňky, což lze upravit in vitro přidáním purifikované C1q složky (30). Tímto způsobem se může defekt komplementu podílet na rozvoji imunitní odpovědi spouštěné autoantigenem. Nicméně souslednost dalších změn, které vedou od poruchy clearance apoptotických buněk až k plnému rozvoji autoimunitní reakce, není znám (11). Je třeba brát do úvahy řadu dalších genetických faktorů i vlivů zevního prostředí. Alternativní hypotéza postuluje možnou pozitivní roli normální fungujícího komplementu v indukci autotolerance prostřednictvím determinace aktivačního prahu B a T lymfocytů. Defekty komplementu by dle této teorie mohly ovlivnit fyziologický mechanismus negativní selekce autoreaktivních lymfocytů (32–34).

4. Protilátky proti proteinům komplementové kaskády

Jak již bylo řečeno výše, deficience komplementu jsou silně spojeny s rozvojem SLE a aktivace komplementu hraje zásadní roli v zánětu. Komplement se však může sám stát cílem adaptivní imunitní od-povědi, v literatuře byly popsány protilátky proti různým komponentám komplementového systému (35, 36). Za určitých okolností se vyskytují rovněž protilátky, které cílí neoepitopy komplementového systému. Neoepitopy nejsou přítomny v nativních komplementových proteinech, ale mohou se vyskytnou při strukturálních změnách komplementového systému.

4.1 Anti- C1q protilátky

Většina anti-komplementových protilátek je namířena proti C1q složce. První popis C1q precipitátů o nízké molekulární hmotnosti v některých sérových vzorcích nemocných se SLE pochází z roku 1971 (37). Přítomnost těchto protilátek byla prokázána rovněž mnoha dalšími autory v následujících letech (38,39). Protilátky proti C1q cílí kolagenu podobnou oblast molekuly a reagují v solidní fází s C1q díky expozici skrytých neoepitopů při strukturálních změnách C1q při vazbě na její ligandy, jako jsou imunokomplexy (40–42).

4.1.1 Role anti-C1q protilátek v patogenezi SLE

Asociace mezi přítomností anti-C1q protilátek a spotřebou komplementu u SLE a HUVS (hypokomplementemická urtikární vaskulitida) nabízí otázku, zda tyto protilátky zapřičiňují či pouze zesilují aktivaci klasické cesty komplementu (13). Trouw et al. vyvinuli murinní monoklonální protilátku JL-1, která je identifikovatelná ELISA metodami díky své schopnosti rozpoznat „tail“ doménu myší C1q. Pokud byla anti-C1q (JL-1) podána samostatně, byla vázána v glomerulu k C1q složce, která se zde i za normálních okolností vyskytuje v malém množství. Nicméně tato interakce nebyla schopna sama o sobě vyvolat signifikantní glomerulární poškození. Pokud byla ale JL-1 podána myším s vysokou expresí C1q v glomerulech, zvířata vykazovala významné glomerulární poškození, sníženou ledvinnou funkcí a zvýšené pronikání bílkovin do moči (43, 44).

Patogenetická role anti-C1q protilátek v rozvoji lupusové nefritidy je předmětem hypotézy navržené Fliermanem (45). Vychází z nálezu spojení zejména vysokých titrů anti-C1q protilátek s renální chorobou a flary aktivity u SLE (44, 46–51). Samotná přítomnost anti-C1q protilátek však není dostatečná podmínka pro rozvoj nefritidy. Další nutnou podmínkou je přítomnost depozit imunokomplexů obsahujících anti-dsDNA protilátky na glomerulární bazální membráně. Jejich rozpoznání C1q složkou vede dle této teorie k expozici neoepitopů C1q molekuly cirkulujícím anti-C1q protilátkám. Při dostatečně vysokých hladinách anti-C1q a dostatečné lokální přítomnosti C1q složky pak dochází k plné aktivaci klasické komplementové cesty prostřednictvím C1q + anti-C1q komplexů, což vede k rozvoji plné formy lupusové nefritidy (obr. 1). Alternativní hypotéza považuje anti-C1q protilátky pouze za vedlejší produkt aktivace komplementu, která sama vytváří neoepitopy v molekule C1q (15).

4.1.2 Anti-C1q protilátky u různých chorob

Přítomnost anti-C1q protilátek není omezena či specifická pouze pro SLE či lupusovou nefritidu. Poprvé byla klinická asociace anti-C1q protilátek popsána v případě HUVS (hypokomplementemická urtikární vaskulitida), choroby charakterizované chronickou kopřivkou, kožní leukocytoklastickou vaskulitidou, angioedémem, glomerulonefritidou a bronchiální obstrukcí (52). Jiné protilátky nebyly u této jednotky dosud popsány. Vztah této nozologické jednotky a SLE je podobný vztahu mezi lupusem a antifosfolipidovým syndromem. HUVS může být součástí SLE (zejména v přítomnosti anti-C1q protilátek), ale může se rovněž vyskytnou jako samostatná primární jednotka (53). Anti-C1q protilátky byly zovněž nalézány u Feltyho syndromu a u revmatoidní vaskulitidy (38) stejně jako u zdravých lidí s narůstajícím trendem v seniu (48). Anti-C1q protilátky se rovněž objevují u 26 % infikovaných virem hepatitidy C (HCV). Ačkoliv prevalence anti-C1q protilátek je vyšší u nosičů HCV viru s kryoglobulinemií III. typu (50 %), nebyla popsána asociace mezi výskytem a hladinami protilátek a HCV genotypem, závažností jaterní choroby či specifickými projevy HCV vaskulitidy (54, 55).

4.1.3 Prevalence anti-C1q protilátek u SLE

V rámci SLE se prevalence anti-C1q protilátek pohybuje mezi 30–50 % a je spojena s vysokou klinickou aktivitou a zejména s lupusovou nefritidou (31, 38, 56–61). Asociace s jiným orgánovým postižením nebyla popsána. Navíc při absenci anti-C1q protilátek se neobjevuje zpravidla lupusová nefritida, zatímco nejméně u 50% nemocných s pozitivními protilátkami lupusová nefritidy vznikne (56, 59).

V přítomnosti vysokých titrů anti-C1q protilátek jsou většinou také nízké C1q a C4 složky komplementu (29). C3 složka bývá dle některých jen lehce snížena či se pohybuje v normálním rozmezí (29), dle jiných koreluje rovněž s hladinou anti-C1q protilátek (62).

4.2 Další protilátky proti komplementovému systému

Data získaná in vitro jakož také in vivo prokázala časté chybění receptoru pro komplement 1 (CR1, CD35) na erytrocytech nemocných s určitými autoimunitními chorobami, zejména se SLE a také u chronických infekcí typu HIV, HCV či lepry (63–66). U nemocných s lupusem byla prokázána vyšší prevalence protilátek proti CR1 (46 %). Tyto protilátky jsou nalézány také u jaterní cirhózy (36 %), HIV infekce (30 %) a u nemocných s antikardiolipinovými protilátkami (19 %), roztroušenou sklerózou (14 %), mnohočetným myelomem (14 %), avšak s chybějící korelací s hladinami anti-C1q protilátek (67). Rovněž reaktivita anti-CR1 protilátek s CR1 receptory byla in vivonízká (s výjimkou dvou pacientů s SLE), takže všeobecně přijímaná teorie předpokládá, že CR1 se ztrácí při předávce imunokomplexů v játrech a slezině z erytrocytů na fixované makrofágy (68). Role anti-CR1 protilátek není zřejmě významná. Rovněž jejich případné klinické korelace nejsou známé.

Protilátky proti iC3bse váží na aktivovaný produkt štěpení C3 zvaný iC3b; nicméně jejich případná účast v patogeneze jakékoliv choroby není známá (69).

C3 nefritický faktor je na hořčíku závislá IgG protilátka přítomná v séru některých nemocných s chronickou mesangioproliferativní hypokomplementemickou glomerulonefritidou. Inaktivuje C3 složku prostřednictvím jejího rozštěpení do dvou neúčinných fragmentů, C3c a C3d, místo vzniku normální C3b složky. C3 nefritický faktor je spojený s parciální lipidystrofií a s určitým typem mesangioproliferativní glomerulonefritidy (70). Tento faktor se rovněž může vzácně vyskytnout u nemocných se SLE.

Další protilátkou proti proteinům komplementové kaskády je protilátka proti C1 inhibitoru. Je přítomna u některých nemocných s lymfomy či angioedémy, ale nebyla zatím nalezena u SLE (71).

Závěr

Anti-C1q protilátky jsou nejvýznamnější protilátky proti komplementovému systému u SLE, jsou důležité v patogenezi poškození ledvin, mohou sloužit jako serologický ukazatel přítomnosti lupusové glomerulonefritidy či jejího rizika nebo jako možný indikátor aktivity choroby. Další známé protikomplementové autoprotilátky nebyly tak extenzivně studovány a jejich praktický význam je velmi omezený.

Tato práce byla podpořena grantem IGA MZdr ČR NR8406

Doc. MUDr. Pavel Horák, CSc.

III. interní klinika, FN a LF UP Olomouc

I. P. Pavlova 6

772 00 Olomouc

e-mail: horak@pfnol.cz