Klinický přínos kvantifikace a imunofenotypizace uterinních NK buněk při diagnostice a léčbě neplodnosti

Overview

Úvod a cíl studie: Uterinní NK (uNK) buňky jsou specializovanou subpopulací NK (natural killer) lymfocytů nacházejících se v endometriu. Hrají klíčovou roli v regulaci imunitní odpovědi a v procesu implantace embrya. Cílem této studie je retrospektivní analýza výsledků léčby metodou in vitro fertilizace (IVF) v souboru žen, které podstoupily imunofenotypizaci uNK buněk a na základě výsledků tohoto vyšetření byly, nebo nebyly léčeny imunomodulační terapií. Metody: Studie zahrnovala 122 pacientek, které podstoupily imunofenotypizaci uNK buněk v období od dubna do prosince 2023. Imunofenotypizace byla provedena metodou průtokové cytometrie. Pacientky byly roztříděny do čtyř skupin dle fenotypu uNK buněk: normální nálezy, nízké absolutní a relativní počty uNK (LOW-IMMUNE profil), nízké počty uNK v kombinaci s nežádoucím posunem směrem k cytotoxickému uNKdim imunofenotypu (MIXED-IMMUNE profil) a normální počty uNK, ale nežádoucí posun v poměru cytotoxických a regulačních uNK s cytotoxickým fenotypem (OVER-IMMUNE profil). Byly hodnoceny výsledky embryotransferu a výskyt potratů do ukončeného 12. týdne těhotenství v jednotlivých skupinách. Výsledky: Nejvyšší míra dosažení klinické gravidity byla nalezena v léčené skupině OVER- -IMMUNE (70 %), následované skupinou MIXED-IMMUNE (60 %). Skupina LOW-IMMUNE se od neléčené NORMAL skupiny signifikantně nelišila (p = 0,205). Nedostatečná imunitní aktivace (LOW-IMMUNE profil) byla signifikantně nejčastěji sdružena s prvotrimestrální těhotenskou ztrátou (p < 0,0001). Závěr: Tato studie přináší nové poznatky o potenciálu imunofenotypizace uNK buněk a následné imunomodulační terapie v léčbě poruch plodnosti. Ačkoli výsledky naznačují možné klinické přínosy, je zapotřebí dalšího výzkumu k potvrzení těchto zjištění a k objasnění mechanizmů, které vedou ke zlepšení výsledků léčby technikami asistované reprodukce.

Klíčová slova:

in vitro fertilizace – imunomodulační léčba – uterinní NK buňky – imunofenotypizace lymfocytů – opakované selhání implantace – habituální potrácení

Úvod

Uterinní NK (uNK) buňky jsou specializovanou subpopulací přirozených zabíječů (NK – natural killer lymfocytů) nacházejících se v endometriu. Hrají klíčovou roli v regulaci imunitní odpovědi a v procesu implantace embrya. Mezi charakteristické CD znaky uNK buněk patří vysoká exprese CD56 a nízká exprese až absence CD16 znaku, což je odlišuje od periferních NK buněk, které mají nízkou expresi CD56 a vysokou expresi znaku CD16 [1].

Na základě exprese povrchového antigenu CD56 se uNK dělí na dvě hlavní subpopulace: dim a bright fenotyp. uNK buňky s dim fenotypem (CD56dim) mají nižší expresi CD56 a vyšší expresi CD16, což je situace obdobná jako u cytotoxických NK buněk periferní krve. Tyto buňky hrají primární roli v přímé cytotoxicitě a obranných mechanizmech proti infekcím a maligním buňkám. uNK buňky s bright fenotypem (CD56bright) vykazují vysokou expresi CD56 a nízkou nebo žádnou expresi CD16. Tento fenotyp je charakteristický pro buňky, které se podílejí na regulaci imunitní odpovědi, vč. produkce proangiogenních faktorů a cytokinů. CD56bright uNK buňky jsou klíčové pro úspěšnou implantaci embrya a pro udržení zdravého imunitního mikroprostředí během těhotenství, jelikož podporují remodelaci cév a imunitní toleranci vůči plodu [2]. Přítomnost a správná funkční aktivita uNK jsou nezbytné pro úspěšné těhotenství, nedostatečná funkce či počet uNK buněk může vést k poruchám implantace, ztrátě těhotenství nebo k těhotenským komplikacím, jako je preeklampsie nebo HELLP syndrom [3].

Diagnostický význam kvantifikace a imunofenotypizace uNK buněk pro klinickou praxi je dosud předmětem diskuzí. Některé studie naznačují, že laboratorně prokázaná nerovnováha v zastoupení populací uNK buněk může přispívat k diagnostice sterility a/nebo infertility [4,5]. Seshadariho metaanalýza však žádný významný rozdíl v procentuálním zastoupení periferních a uterinních NK buněk mezi neplodnými a plodnými ženami neprokázala [6].

Předkládaná studie si klade za cíl retrospektivně analyzovat výsledky léčby metodou in vitro fertilizace (IVF) v souboru žen jednoho klinického centra reprodukční medicíny, které podstoupily v období 1–4 měsíců před embryotransferem imunofenotypizaci uNK v biopsii endometria metodou průtokové cytometrie. Studie hodnotí jednotlivé imunofenotypy uNK a jejich zastoupení, zvolené imunomodulační léčebné postupy, míru dosažení klinického těhotenství po embryotransferu a výskyt potratů do ukončeného 12. týdne těhotenství po transferu v jednotlivých kohortách dle fenotypu uNK a zvolené terapie.

Pacientky a metodika

Byla provedena retrospektivní analýza klinických a laboratorních dat 122 pacientek, které podstoupily uNK imunofenotypizaci v období od dubna do prosince 2023. Pacientky byly do souboru zařazeny sousledně, k zařazovacím kritériím patřila:

1.
probíhající nebo absolvovaná léčba některou z technik asistované reprodukce;

2.
dostupnost relevantních anamnestických a klinických dat.

Laboratorní vyšetření

Vzorek endometria byl odebrán pipelou pro endometriální biopsii 20.–24. den menstruačního cyklu postupem dle Tersoglio et al. [7]. Vzorek byl zpracován ihned po doručení do laboratoře. Ze vzorku endometria byla vybrána vhodná část k analýze, a to kompaktní tkáň endometria bez viditelné krevní kontaminace. Tkáň byla promyta fosfátovým pufrem, osušena a zvážena. Následně byla děložní tkáň mechanicky dezintegrována a homogenizována. Obsah homogenizátoru byl přefiltrován do zkumavky přes filtr s propustností 50 µm.

uNK imunofenotypizace byla provedena metodou průtokové cytometrie modifikovaným postupem dle Harrity et al. [8]. K buněčné suspenzi byly přidány tyto fluorescenčními barvami značené protilátky proti povrchovým buněčným antigenům:

1.
CD56 PC7 (FL5) IQ test (A21692, Beckman Coulter);

2.
CD16 APC (FL6) ASRclone 3g8 (B008452110060, Beckman Coulter);

3.
CD45 Chrome orange FL10 (B36294, Beckman Coulter);

4.
CD3 (UCHT1) Pacific Blue™ FL (PB-514-T100, Exbio).

Po inkubaci s protilátkami byly vzorky lyzovány. Připravené zkumavky byly analyzovány na průtokovém cytometru NAVIOS (Beckman Coulter). Analýza naměřených dat byla provedena pomocí softwaru KALUZA.

Výsledky vyšetření byly hodnoceny s ohledem na referenční rozmezí normálních hodnot uNK pro danou metodu a danou laboratoř. Toto referenční rozmezí bylo stanoveno analýzou n = 3 431 nálezů všech vzorků dané laboratoře jako 5.–95. percentil naměřených hodnot následovně:

1.
NK buňky (CD56+CD3–) ze všech lymfocytů: 21–60 %;

2.
absolutní počet NK buněk:             0,9–8,1 × 10⁵/gram tkáně

3.
NK CD56++ bright ze všech lymfocytů: 18–55 %;

4.
T buňky (CD3+) ze všech lymfocytů: 33–71 %;

5.
NKT buňky (CD3+CD56+) ze všech lymfocytů: < 8 %;

6
.
CD56+CD16+ z NK buněk (cytotoxické NK, NKc): 7,5–25,0 %;

7.
CD56+CD16 – z NK buněk (regulační NK, NKr): 73–91 %;

8.
poměr NKr/NKc (index regulační/cytotoxické NK): 3–11,5.

Statistická analýza

Data byla analyzována s pomocí softwaru MedCalc® Statistical Software v. 22.026 (MedCalc Software Ltd, Ostend, Belgie). Test normality dat byl proveden Shapiro-Wilksovým testem. Normalita rozložení proměnných nebyla potvrzena, proto byly dále použity neparametrické statistické metody. Spojité proměnné byly prezentovány jako mediány a mezikvartilové rozsahy (IQR), případně rozpětí minimálních a maximálních hodnot, kategoriální proměnné jako absolutní a relativní počty. K porovnání analyzovaných skupin byl použit Kruskal-Wallisův test pro spojité proměnné a Chí-kvadrát test pro kategorické proměnné. Za statisticky významnou byla přijata hodnota p ≤ 0,05.

Výsledky

Základní deskriptivní charakteristiky vyšetřeného souboru uvádí tab. 1.

U žen starších 35 let byly častěji použity darované oocyty (p < 0,001). U žen s hodnotou indexu tělesné hmotnosti (BMI) převyšující 30 kg/m² bylo zaznamenáno signifikantně méně gravidit po IVF ET (p = 0,006) a častější použití darovaných oocytů (p = 0,017).

Výsledky uNK imunofenotypizace n = 122 žen byly roztříděny do čtyř skupin takto:

1.
Normální nálezy, tj. relativní a absolutní počty všech sledovaných lymfocytárních subpopulací v referenčním rozmezí. Tato skupina je dále v textu označována jako NORMAL.

2.
Nízké absolutní a relativní počty uNK při normálním poměrném zastoupení NK buněk s regulačním a cytotoxickým fenotypem (tj. s normálním indexem NKr/NKc). Tento nález byl hodnocen jako nedostatečná imunitní aktivace uterinního buněčného mikroprostředí a dále v textu je označován jako LOW-IMMUNE profil uNK.

3.
Normální relativní a absolutní počet uNK, ale poměr uNKr/uNKc abnormálně vychýlený ve prospěch uNKc s cytotoxickým fenotypem. Tento nález byl hodnocen jako cytotoxické buněčné mikroprostředí a označen jako OVER-IMMUNE profil uNK.

4.
Snížené celkové (absolutní, relativní) počty uNK v kombinaci s abnormálním poměrem uNKc/uNKr vychýleným ve prospěch uNKc s cytotoxickým fenotypem. Tento nález byl klasifikován jako smíšený a označen jako MIXED-IMMUNE profil.

Zastoupení jednotlivých uNK imunofenotypů a absolutní a relativní počty buněčných populací v jednotlivých profilech uNK uvádí tab. 2.

U 48 % (n = 57) vyšetřených žen nebyla nalezena patologie uNK, těmto pacientkám nebyla přidána k další léčbě technikami asistované reprodukce imunointervenční terapie. Z těchto 57 žen absolvovalo do 3 měsíců od vyšetření uNK embryotransfer 43 žen (75 %).

Zbylých 52 % (n = 65) vyšetřených žen vykázalo při uNK imunofenotypizaci patologické výsledky. Z nich celkem n = 57 (88 %) absolvovalo do 3 měsíců od uNK imunofenotypizace embryotransfer. K embryotransferu byla indikována léčebná imunointervence, zastoupení jednotlivých léčebných protokolů uvádí graf 1.

Výsledky embryotransferu po uNK imunofenotypizaci s imunointervencí a bez imunointervence dle profilů uNK uvádí tab. 3. Vyplývá z ní, že nejvyšší míra dosažení klinické gravidity byla nalezena v léčené skupině OVER-IMMUNE, na druhém místě s jen mírně nižšími hodnotami byly výsledky v MIXED-IMMUNE skupině. Skupina LOW-IMMUNE se od neléčené NORMAL skupiny v míře dosažení klinické gravidity signifikantně nelišila (Chí-square 1,603; hodnota p = 0,205 na hladině významnosti 0,05), pregnancy rate v nich odpovídala průměrné hodnotě českého registru asistované reprodukce pro medián věku 38 let [9].

Dalším sledovaným parametrem byl časný potrat po embryotransferu (zamlklý nebo spontánní potrat do ukončeného 12. týdne těhotenství). Výsledky uvádí tab. 4. Nedostatečná imunitní aktivace uterinních lymfocytů (LOW- -IMMUNE profil) byla signifikantně častěji sdružena s prvotrimestrální těhotenskou ztrátou.

Míru živě narozených dětí nebylo možné do doby vzniku této práce vyhodnotit, protože některé gravidity stále probíhaly. V souvislosti s léčbou technikami asistované reprodukce a konkomitantní imunomodulační terapií je však tento údaj nevýznamný, protože těhotenství může být v celém svém průběhu ovlivněno řadou faktorů, které nemají žádnou souvislost s IVF a podávanou léčbou.

Přehled použitých imunointervenčních postupů dle profilu uNK ve vztahu k dosaženým hodnotám pregnancy rate uvádí tab. 5. Vyplývá z ní, že intralipidy v kombinaci s kortikosteroidy u pacientek v OVER-IMMUNE a MIXED-IMMUNE profily byly sdruženy s nejvyšší mírou dosažení klinického těhotenství.

Diskuze

Předkládaná práce je příspěvkem k diskuzi o klinickém přínosu imuno-fenotypizace uterinních NK buněk k diagnostice a léčbě poruch plodnosti. Retrospektivně analyzuje vliv různých imunofenotypů uNK na úspěšnost léčby pomocí technik asistované reprodukce. Jedním z klíčových poznatků této studie je identifikace různých imunofenotypů uNK a jejich vliv na úspěšnost embryotransferů a průkaz signifikantně vyšší míry dosažení klinické gravidity u žen, které byly na základě výsledků vyšetření uNK léčeny personalizovanou imunomodulační terapií.

Práci tak lze zařadit po bok studie německých autorů [10] prokazující v souboru n = 147 pacientek s habituálním potrácením na vysoké zastoupení cytotoxických NK buněk v endometriu nebo k rakousko-německé práci z roku 2020 [11], která v souboru 613 žen s habituálním potrácením a 185 žen s opakovaným selháním implantace embrya dospěla k podobným závěrům.

Naše práce navazuje na studie Ulčové-Gallové et al. z let 2017–2018 [12,13], liší se ale použitou metodou analýzy uNK. Zmíněné pracovní skupině patří v ČR ve vyšetřování uNK priorita. K vyšetření uNK použili plzeňští autoři imunohistochemickou metodu, což je technika, která umožňuje detekci specifických proteinů v buňkách tkáňových řezů. Tento postup zahrnuje fixaci a řezání tkáně, inkubaci s primárními a sekundárními protilátkami a vizualizaci pomocí mikroskopie a poskytuje informace o lokalizaci a expresi proteinů přímo v kontextu tkáňové architektury. Námi použitá metoda průtokové cytometrie umožňuje rychlou a kvantitativní analýzu fyzikálních a chemických vlastností buněk ve vzorku suspendovaném v kapalném médiu. Buňky procházejí proudem tekutiny přes laserový paprsek, který excituje fluorescenčně značené protilátky navázané na specifické buněčné povrchové antigeny. Detektory měří fluorescenční signály, což umožňuje stanovení počtu a typů buněk, jejich velikosti, granularity a exprese povrchových markerů. Domníváme se, že průtoková cytometrie je pro detailní a kvantitativní analýzu komplexních buněčných populací vhodnější, imunohistochemie je cennější pro lokalizaci proteinů v tkáňovém kontextu. Cytometrická analýza navíc umožňuje rychlou analýzu tisíců buněk za sekundu, což poskytuje statisticky významné množství dat v krátkém čase, poskytuje přesná kvantitativní data o expresi sledovaných markerů, umí simultánně detekovat více markerů na jednotlivých buňkách pomocí různých fluorochromů, což umožňuje detailní fenotypizaci buněčných populací.

Přínos naší studie lze spatřovat též v tom, že analyzuje léčebné imunomodulační postupy, které byly k ovlivnění uterinního mikroprostředí použity. Naše výsledky se dosti přibližují personalizovaným léčebným postupům francouzských autorů Lédée et al. [14,15], byť samozřejmě imunologické profilování endometria provádí tato výzkumná skupina zcela odlišným způsobem [16]. Studie Lédée et al. hodnotila výsledky imunomodulační terapie v kohortě 215 žen, které byly léčeny:

a)
nízkodávkovým aspirinem a/nebo nízkomolekulárním heparinem;

b)
systémovými kortikosteroidy s aspirinem, nebo bez aspirinu, či heparinu;

c)
hydroxychlorochinem;

d) intralipidy.

Léčené pacientky měly v této studii signifikantně vyšší míru kumulativního počtu živě narozených dětí než imunologicky neléčené ženy (43,0 vs. 34,8 %; p = 0,04), přičemž ženy léčené systémovými steroidy a intralipidy měly ve srovnání s imunologicky neléčenými ženami až 2krát větší šanci na narození živého dítěte (OR 2,0 při 95% CI 1,1–3,7 pro kortikosteroidy a OR 1,8 při 95% CI 0,9–3,6 pro intralipidy).

Aktuálně již není sporu o tom, že úspěšná implantace plodu vyžaduje pečlivě řízené zapojení imunitního systému matky do procesu [17]. Jednou z možných příčin selhání implantace embrya nebo časné ztráty těhotenství mohou být aberantní imunitní funkce, avšak jasné důkazy pro klinický přínos testování dosud chybí. Je potřeba deklarovat, že existují jak studie a metaanalýzy dokládající význam uNK imunofenotypizace [18,19], ale i studie se zcela opačnými výsledky [20,21]. Evropská společnost pro humánní reprodukci a embryologii (ESHRE) proto aktuálně nedoporučuje uNK imunofenotypizaci k rutinnímu použití při diagnostice ženské neplodnosti [22]. Naše studie však naznačuje, že toto vyšetření může být přínosné v určitých klinických situacích, a to zvláště tehdy, pokud standardní diagnostické a terapeutické postupy selhávají. uNK imunofenotypizace poskytuje cenné informace o stavu buněčné imunity v endometriu a může ovlivnit volbu léčebné strategie. Naše data naznačují, že personalizovaná léčebná imunointervence může vést k dosažení vyšší míry klinické gravidity. Tento přístup by mohl představovat nový standard péče u vybraných skupin pacientek, přispět k individualizaci léčby neplodnosti a zvýšit šanci na úspěšné těhotenství.

Naše práce má i slabá místa, ke kterým patří v první řadě relativně malý počet pacientek, a tedy možný výběrový bias, který by mohl ovlivnit výsledky. Jsme si vědomi toho, že nelze jednoznačně určit, zda byla imunomodulační terapie příčinou zlepšených výsledků, nebo zda k tomu přispěly i jiné faktory – klamná korelace (spurious correlation) může vést k chybným závěrům, pokud není pečlivě analyzována a interpretována. Obecným nedostatkem retrospektivních studií vč. naší je nemožnost randomizace a zaslepení. Nedostatečná standardizace v metodách měření a hodnocení výsledků mezi různými studiemi hodnotícími fenotyp uNK komplikuje srovnávání našich zjištění s jinými výzkumy. Další limitací naší práce je nedostatek dlouhodobých údajů o bezpečnosti a účinnosti použitých imunomodulačních postupů, což podtrhuje potřebu dalšího výzkumu v této oblasti.

Závěr

Naše studie přináší nové poznatky o potenciálu imunofenotypizace uNK buněk a následné imunomodulační terapie v léčbě poruch plodnosti. Prezentovaná data naznačují možné klinické přínosy, zapotřebí je však dalšího výzkumu k potvrzení těchto zjištění a k objasnění mechanizmů, které vedou ke zlepšení výsledků těhotenství. Je nutné provést rozsáhlejší a lépe kontrolované studie, které by zahrnuly větší počet pacientek a standardizovaly diagnostické a terapeutické postupy. Pouze tak můžeme získat přesvědčivé důkazy, které by mohly podpořit širší klinické použití imunofenotypizace uNK buněk a s ní spojených terapeutických intervencí v oblasti reprodukční medicíny.