Stanovení anti-Müllerova hormonu u žen

Anti-Müllerův hormon (AMH) je glykoprotein patřící do skupiny růstových faktorů TGF-β. V našem přehledovém článku je popsána metoda jeho stanovení v séru a folikulární tekutině, diskutuje se o referenčních hodnotách a změnách jeho hladin v průběhu života ženy. Kromě toho je popsán vztah mezi AMH, obezitou, kouřením a užíváním hormonální antikoncepce. Těžiště práce je v prezentaci významu stanovení AMH v klinické praxi. V asistované reprodukci se stalo jeho stanovení jedním z nástrojů ke zjišťování ovariální rezervy. Pomáhá nejen predikovat sníženou odpověď na stimulaci gonadotropiny, ale i nebezpečí vzniku ovariálního hyperstimulačního syndromu. V rámci zjišťování ovariální rezervy se diskutuje o vzájemném vztahu mezi sérovými hladinami AMH a počtem antrálních folikulů (AFC) určovaným ultrazvukem. V následující části jsou zmíněny další klinické stavy, u kterých je v současné době vyšetření AMH často indikováno. Jde především o syndrom polycystických ovarií, který je velkou výzvou nejen pro vyšetřování AMH, ale je v něm otevřen prostor i pro další mezioborovou spolupráci. Endometrióza nemá přímý vliv na ovariální rezervu a hladiny AMH v séru. AMH je velmi citlivý nádorový marker a používá se k diagnostice a sledování nádorů z buněk ovariální granulózy. Kromě toho je v onkologii prediktorem stupně poškození ova-riálních folikulů radio- a chemoterapií.

Klíčová slova:
anti-Müllerův hormon – ART – antrální folikuly – endometrióza – chemoterapie – IVF – nádor buněk granulózy – ovariální hyperstimulační syndrom – syndrom polycystických ovarií

ÚVOD

Anti-Müllerův hormon (anti-Müllerian hormone, AMH) je glykoproteinový dimer tvořený dvěma monomery o molekulové hmotnosti 72 kDa [43]. AMH řadíme do skupiny růstových faktorů transforming growth factor-β (TGF-β). Gen pro AMH je umístěn na krátkém raménku chromozomu 19 [49]. Při účinku na buňky využívá AMH dvou typů receptorů: MIS receptor type I (MISRI) a MIS receptor type II (MISRII), které jsou přítomny v cílových tkáních (gonády a Müllerův duktus) [27]. Produkce AMH je soustředěna u plodů mužského pohlaví v Sertoliho buňkách, u žen pak v granulózových buňkách vaječníků. AMH hraje důležitou roli v pohlavní diferenciaci plodu. Produkce AMH způsobuje u plodu regresi Müllerova vývodu a spolu s testosteronem podporuje vývoj plodu mužského pohlaví. Pokud není AMH přítomen v prenatálním období, vyvíjí se plod ženského pohlaví [30]. V našem článku jsme se snažili zmapovat současnou úroveň poznatků o měření AMH u žen.

ZPŮSOBY MĚŘENÍ AMH

AMH je možné stanovit v séru pomocí imuno-analytických metod, které jsou založeny na principu reakce antigenu a protilátky. V současné době jsou na trhu diagnostické soupravy na bázi systému Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assays (ELISA). Princip ELISA metod ukazuje schéma 1.

AMH je detekováno pomocí dvou monoklonálních protilátek, z nichž první, záchytná protilátka, je pevně vázána na stěnu reakční jamky. Po přidání vzorku s antigenem, kterým je v tomto případě AMH, je vzorek zachycen protilátkou vázanou na pevné fázi. Po promytí se přidá roztok s druhou detekční protilátkou, která je namířena proti další antigenní determinantě molekuly AMH. Detekční protilátka se naváže na již vzniklý komplex záchytné protilátky a AMH. Detekční protilátka je označena enzymem. Po odmytí nezreagované detekční protilátky se do reakční jamky přidá enzymatický substrát. Enzym zpracuje přidaný substrát za vzniku barevné reakce. Výsledné zabarvení vyhodnotíme fotometricky. Intenzita zabarvení je úměrná koncentraci AMH.

AMH V SÉRU

Metoda stanovení AMH v séru systémem ELISA byla vyvinuta v druhé polovině 80. let minulého století. První práce byly zveřejněny v roce 1990 a týkaly se vztahu AMH a normálního či narušeného pohlavního vývoje dětí [1, 21, 23]. Kolem roku 2000 se objevily práce, které zkoumaly vztah AMH a ovariální rezervy na zvířecím modelu [8, 9]. Od roku 2002 se pak začíná hovořit o AMH jako o novém markeru ovariální rezervy u žen [6, 47, 59]. V souvislosti s ovariální rezervou je dnes indikována většina vyšetření sérových hladin AMH.

AMH VE FOLIKULÁRNÍ TEKUTINĚ

Po nabytí zkušeností s měřením koncentrací AMH v séru přitáhl pozornost výzkumných týmů folikul samotný, resp. folikulární tekutina. Princip stanovení ve folikulární tekutině je shodný s principem stanovení v séru. Bylo zjištěno, že produkce AMH v rostoucím folikulu klesá. Nejvyšší koncetrace AMH se nachází v preantrálních a malých antrálních folikulech, menších než 4 mm. Ve větších folikulech (4–8 mm) se koncentrace AMH postupně snižuje a ve folikulech větších než 8 mm je již hladina AMH velmi nízká nebo úplně chybí [61]. Hladina AMH je v malých folikulech přibližně třikrát vyšší než ve folikulech velkých. Hladiny AMH naměřené v malých i velkých folikulech pozitivně korelovaly s počtem časných antrální folikulů před řízenou ovariální hyperstimulací (COH, controlled ovarian hyperstimulation), počtem rostoucích folikulů v den aplikace hCG a počtem získaných oocytů. Navíc byly hladiny AMH ve folikulární tekutině významně vyšší u žen, které v příslušném cyklu in vitro fertilizace (IVF) otěhotněly. AMH ve folikulární tekutině může být tedy rozhodujícím faktorem při výběru oocytů, které budou oplodněny [60].

AMH V PRŮBĚHU ŽIVOTA ŽENY

Hladiny AMH jsou u dívek po narození velice nízké. První malý vzestup hladin zaznamenáváme ve dvou letech života. Tento věk se nazývá obdobím minipuberty [31]. Další malý vzestup přichází kolem osmého roku života a do dvanáctého roku hladiny AMH klesají. Poté nastává postupné zvyšování hladin až do dosažení životního maxima mezi dvaceti pěti až dvaceti sedmi lety. Následně hladiny AMH klesají až do neměřitelných hodnot v období menopauzy [25].

REFERENČNÍ HODNOTY AMH

Referenční sérové hladiny AMH se mění s věkem ženy. Průměrné maximální hodnoty dosahované asi ve 25. roku života se pohybují kolem 5 ng/ml. Poté hladiny spolu s ovariální rezervou postupně klesají. Průběh průměrných hodnot AMH ve fertilním věku ženy ukazuje graf 1. Při tvorbě grafu jsme vycházeli především ze dvou největších studií provedených ve Velké Británii [25, 39].

Další typ referenčních hodnot se používá v souvislosti s IVF. Zde jde o predikci odpovědi na hormonální stimulaci na při známé hladině AMH před zahájením stimulace. V tabulce 1 uvádíme příklad referenčních hodnot AMH, které jsou nastaveny tak, aby kladly důraz na minimalizaci rizika ovariálního hyperstimulačního syndromu (OHSS). Zkušenosti jednotlivých pracovišť se mohou v tomto směru lišit. Každé pracoviště by si mělo pro tento účel stanovit své vlastní referenční hodnoty.

AMH A OBEZITA

Studie zabývající se vztahem mezi indexem tělesné hmotnosti (BMI) a sérovou koncentrací AMH dospěly k závěrům, že mezi sérovou hladinou AMH a BMI neexistuje žádná korelace. Podobně nebyla prokázána žádná závislost mezi BMI a dalšími sérovými markery ovariální rezervy (FSH, LH, inhibin B) [52] a nepodařilo se prokázat ani žádný vztah mezi BMI a ultrazvukem stanoveným počtem antrálních folikulů (AFC, antral follicle count) [17]. Lze tedy konstatovat, že obezita nemá vztah k ultrazvukovému markeru AFC, ani k sérovým markerům ovariální rezervy.

AMH A KOUŘENÍ

Ženy kuřačky mají ve srovnání s ženami nekuřačkami nižší sérovou hladinu AMH, než by bylo obvyklé pro jejich věk, a zároveň u nich dochází v průběhu celého reprodukčního života k rychlejšímu poklesu hladin AMH [55].

Měření hladin AMH ve folikulární tekutině a hodnocení AFC u aktivních kuřaček prokázalo ve srovnání se ženami nekuřačkami snížení hladin AMH ve folikulární tekutině a menší velikost folikulů při hodnocení AFC [13]. Mechanismy, kterými kouření indukuje tyto změny, jsou prozatím neznámé [14].

AMH A HORMONÁLNÍ ANTIKONCEPCE

Názory podložené výsledky studií o vlivu užívání hormonální antikoncepce (HAK) na hladinu AMH v séru nejsou zcela jednotné. Studie publikovaná v roce 2012 poukazuje na rozdíl v koncentracích sérového AMH u žen užívajících HAK a žen, které HAK nikdy neužívaly. Ženy, které HAK užívaly, měly hladiny AMH o 30 % nižší a stejné snížení bylo nalezeno i u AFC. Závislost mezi dávkou hormonů a mírou poklesu AMH se nepodařilo prokázat [2]. Dřívější studie přitom neprokázaly žádné snížení hladin AMH u uživatelek HAK, a tudíž ve svých závěrech doporučují AMH jako spolehlivý marker ovariální rezervy i při užívání hormonální antikoncepce [34]. Závěry další studie popisují u žen užívajících HAK snížení počtu folikulů větších než 6 mm při stimulaci gonadotropiny v porovnání s ženami, které HAK neužívaly. Počet malých antrálních folikulů 2–6 mm a hladiny AMH však nebyly ovlivněny [5].

AMH JAKO MARKER OVARIÁLNÍ REZERVY

Počet folikulů klesá s věkem a v období menopauzy je jejich zásoba prakticky vyčerpána. Na rozdíl od jiných hormonálních markerů, sérová koncentrace AMH odráží počet folikulů během časné folikulární fáze, a je tedy dobrým parametrem pro sledování ovariální rezervy [24]. AMH v séru klesá v průběhu let a na rozdíl od FSH, LH, estradiolu a inhibinu B lépe reflektuje snižující se ovariální rezervu. Hladina AMH kromě toho pozitivně koreluje s počtem oocytů získaných po COH v programu asistované reprodukce (ART) [12].

AMH A AFc

Vztah mezi AMH a AFC je stále předmětem velmi intenzivní diskuse. AMH, AFC a další parametry ovariální rezervy byly testovány ve vztahu ke snižování ovariální rezervy ověřené histologicky. Pouze AMH a AFC přímo korelovaly s pozorovaným snížením počtu folikulů [20, 51]. Koncentrace AMH v séru koreluje s AFC, ale informace poskytovaná oběma markery je kvalitativně poněkud odlišná [62]. Na základě měření koncentrace AMH ve folikulární tekutině lze konstatovat, že AMH je více produkován v menších folikulech (menších než 2–4 mm) než ve folikulech větších. Ve folikulech větších než 8 mm je pak jeho produkce velice nízká. Pomocí ultrazvuku můžeme rozlišit folikuly větší než 2 mm. AFC nám tedy dává informaci o přítomnosti počtu folikulů o velikosti 2 mm a větších. Mnoho center reprodukční medicíny využívá proto v současné době při hodnocení ovariální rezervy rutinně oba tyto parametry.

SNÍŽENÁ OVARIÁLNÍ ODPOVĚĎNA STIMULACI GONADOTROPINY

Stimulace folikulogeneze vyvolává růst folikulů, ale čím větší je folikul, tím méně AMH produkuje. Hladiny AMH v průběhu COH tedy postupně klesají. Údaje z mnoha studií přitom poukazují na pozitivní korelaci mezi bazální hladinou AMH před stimulací a počtem získaných oocytů u žen podstupujících COH. Přitom počet vytvořených folikulů a počet získaných oocytů jsou dvě hlavní kritéria pro vymezení dobré a špatné odpovědi na stimulaci. Koncentrace AMH v séru u žen se ziskem 11 a více oocytů byla 2,5krát vyšší ve srovnání s těmi, u kterých bylo získáno šest a méně oocytů. Bylo zjištěno, že AMH je lepším markerem pro predikci ovariální odpovědi na COH než věk ženy, sérová hladina FSH, estradiolu nebo inhibinu B. Z klinického hlediska tedy správná predikce nedostatečné odpovědi na COH pomocí stanovení AMH napomáhá snížit riziko předčasného ukončení léčebného cyklu, snižuje léčebné náklady a psychickou zátěž pro neplodný pár. Absence výkyvů koncentrace AMH v průběhu menstruačního cyklu staví tento parametr do pozice markeru ovariální rezervy, který může být vyšetřen nezávisle na dni cyklu [26].

AMH A SYNDROM POLYCYSTICKÝCH OVARIÍ

Evropská společnost pro lidskou reprodukci a embryologii (ESHRE) a Americká společnost reprodukční medicíny (ASRM) na společném workshopu v Rotterdamu v roce 2004 zpřesnily diagnostická kritéria sydromu polycystických ovarií (PCOS). Klinická diagnóza PCOS je potvrzena, pokud jsou přítomny alespoň dvě z následujících tří kritérií: chronické oligo- nebo anovulace, biochemicky potvrzená hyperandrogenémie anebo ultrazvukovým vyšetřením potvrzená morfologie polycystických ovarií (PCO) [58]. Mezi klinické projevy PCOS patří poruchy menstruačního cyklu spojené s anovulací, hyperandrogenismus, hirsutismus a mužský typ alopecie [41]. PCOS je diagnostikován u 5–10 % žen v reprodukčním věku a bývá spojen s metabolickými poruchami. Výskyt diabetes mellitus 2. typu je u žen s PCOS desetkrát vyšší než u zdravých žen. U 30–50 % žen s PCOS se po dosažení věku 30 let rozvíjí poruchy glukózové tolerance nebo diabetes mellitus 2. typu [32]. Ženy s PCOS mají oproti zdravým ženám ve vaječníku až šestkrát větší počet folikulů. Produkce AMH je až u 75 % žen s PCOS v porovnání se zdravými kontrolami zvýšena [41]. Podle některých autorů jsou vysoké hladiny AMH u žen s PCOS připisovány vysokému výskytu počtu malých antrálních folikulů o průměru do 2 mm, neboť koncentrace AMH pozitivně koreluje právě s počtem folikulů tohoto typu [18, 22]. Zvýšené koncentrace AMH hrají zásadní roli v potlačení procesu zrání folikulů [42].

Je známo, že hladiny AMH u žen s normálním ovulačním cyklem klesají s věkem. Podobně, ale pomaleji, klesají koncentrace AMH u žen s PCOS [44]. U dívek s PCOS ve věku 12–18 roků byly pozorovány v porovnání se zdravými kontrolami vysoké hladiny AMH [3]. Zvýšené hladiny AMH byly též nalezeny u dívek narozených matkám s PCOS [53]. Koncentrace AMH u žen s PCOS pozitivně korelovaly s hladinou testosteronu a androstendionu [45]. Metformin podáváný anovulačním pacientkám s PCOS působí snížení hladiny AMH ve folikulární tekutině a tato změna by u nich mohla hrát významnou roli v navození ovulačních cyklů [10, 24].

OVARIÁLNÍ HYPERSTIMULAČNÍ SYNDROM

OHSS je potenciálně život ohrožující stav, který se projevuje přehnanou odpovědí vaječníků na řízenou stimulaci (COS). Syndrom má široké spektrum klinických projevů, od mírné formy vyžadující pouze sledování až po těžkou formou vyžadující hospitalizaci a intenzivní péči. Mírné a středně těžké formy OHSS se mohou vyskytnout u 15–20 % všech cyklů. Těžké formy syndromu byly pozorovány u 1–3 % [48]. Cestou k prevenci OHSS je správné vyhodnocení rizikových faktorů OHSS vedoucí k individuálně upravené počáteční dávce gonadotropinů, která je nezbytná pro dosažení optimální folikulární odpovědi. I tak zůstává predikce přesné odpovědi na stimulaci v IVF cyklu nadále velmi složitou záležitostí. Hlavním rizikovým faktorem pro OHSS je PCOS. Ten je přítomen u 20 % žen podstupujících COH a je morfologickým podkladem u 20 % žen s příznaky rozvíjejícího se OHSS. Vztah mezi OHSS a sérovou hladinou AMH naznačuje, že vysoká bazální hladina AMH je spojena se zvýšeným rizikem vzniku OHSS. Měření hladin AMH před stimulací gonadotropiny tedy dává možnost upravit stimulační protokol s cílem předejít OHSS [58].

AMH A KVALITATIVNÍ HLEDISKA OVARIÁLNÍ ODPOVĚDI

Šance na úspěšné provedení IVF je více závislá na kvalitativních parametrech než na pouhém množství získaných oocytů. Vzhledem k tomu, že stav ovariální rezervy zahrnuje množství i kvalitu folikulů, může AMH odrážet nejen kvantitativní, ale i kvalitativní charakteristiky ovariální odezvy na stimulaci [11]. V současné době není vztah sérové hladiny AMH a kvalitativních parametrů ovariální odpovědi zcela jednoznačný. Někteří autoři našli významnou pozitivní korelaci mezi sérovou koncentrací AMH, kvalitou oocytů a morfologií embryí [33], jiní však tento vztah nepotvrdili [54]. Prozatím byla prokázána korelace mezi sérovou hladinou AMH, počtem získaných oocytů a otěhotněním v konkrétním cyklu IVF [38]. Za účelem objasnění komplikovaného vztahu mezi sérovou hladinou AMH na straně jedné a kvalitou oocytů a embryí na straně druhé je třeba vyčkat výsledků dalších studií [35].

AMH V PROGRAMU DÁRCOVSTVÍ OOCYTŮ

Program darování vajíček je jednou z možností ART a je v současné době využíván v řadě zemí celého světa. Ve většině zemí je základním kritériem pro zařazení dárkyň do programu darování oocytů jejich věk [37]. Podle výsledků mnoha studií je možné říci, že AMH má prediktivní schopnost rozlišovat ženy s nedostatečnou či nadměrnou odpovědí na stimulaci gonadotropiny [46]. AMH je v tomto ohledu lepší marker ovariální rezervy než jiné biomarkery (FSH, LH, inhibin B) a věk dárkyně [50]. Přesné posouzení ovariální rezervy, predikce odezvy na stimulaci, predikce počtu a kvality získaných oocytů jsou přitom významná kritéria pro výběr vhodných dárkyň, takže AMH patří mezi parametry s vysokým potenciálem pro jeho zlepšení [15].

AMH A ENDOMETRIÓZA

U žen s endometriózou oproti zdravým ženám nedochází ke snížení ovariální rezervy ani ke změnám hladin AMH [56]. Zajímavým faktem je ovšem zjištění, že hladina AMH významně klesá půl roku po provedení chirurgického zákroku v souvislosti s léčbou endometriózy [4]. Tento fakt by měl být vzat v úvahu u žen fertilního věku s endometriózou, které ještě plánují těhotenství.

AMH U NÁDORŮ Z BUNĚK GRANULÓZY

AMH je u žen produkován v granulózových buňkách ovarií od narození až do menopauzy. AMH je tedy možné použít jako citlivý nádorový marker u tumorů vycházejících z buněk granulózy. Zvýšení AMH bylo zjištěno u 85 % žen postižených nádorem vycházejícím z granulózových buněk [29]. Průměrné zvýšení sérových koncentrací AMH bylo přibližně desetkrát vyšší než u zdravých žen. AMH je velmi citlivý a specifický marker pro sledování žen po ovarektomii a zvýšení sérových hladin AMH předchází detekci recidivy jinými metodami průměrně o 16 měsíců [36]. Přitom včasné odhalení recidivy má velký význam v systému dispenzarizace pacientek s nádory z granulózových buněk, neboť výskyt recidiv byl pozorován 10–20 let po resekci primárního tumoru [19, 28].

AMH U CHEMOTERAPIE A OZAŘOVÁNÍ

Všechny studie jasně prokázaly statisticky významné změny sérových hladin AMH v průběhu chemoterapie a po ozáření pánve. Poškození ova-riální rezervy a snížení hladiny AMH závisí na typu použitých chemoterapeutik a počtu terapeutických cyklů. Nejvíce destruktivní s ohledem na ovariální rezervu jsou alkylující látky [16]. Po chemoterapii bylo pozorováno obnovování hladin AMH, přičemž rychlost obnovení hladiny AMH pozitivně korelovala s koncentrací AMH v séru před chemoterapií. Při hladinách AMH před terapií, které byly vyšší než 2 ng/ml, docházelo po chemoterapii k obnově hladin rychlostí nárůstu o 11,9 % za měsíc. U žen s hladinou AMH nižší než 2 ng/ml před zahájením léčby docházelo k obnovení hladin po léčbě rychlostí nárůstu pouze o 2,6 % za měsíc [7].

ZÁVĚR

Při současném trendu snižující se reprodukční schopnosti naší populace vnímáme problematiku vyšetřování AMH jako velmi aktuální. Možnosti klinického využití AMH se neustále rozšiřují, a proto jsme se kromě dnes již obecně známého využití AMH při provedení IVF snažili zaměřit na indikace k vyšetření AMH, o nichž se široce diskutuje v zahraniční literatuře. Jde zejména o problematiku PCOS a souvisejícího metabolického syndromu. Dále jsme chtěli upozornit na AMH jako citlivý nádorový marker, neboť jakkoli patří nádory z granulózových buněk k méně frekventním, ohrožují zdraví a životy pacientek zejména pozdními relapsy. AMH hraje rovněž významnou úlohu při plánování ochrany reprodukčních funkcí před chemoterapií, radioterapií či chirurgickými výkony, které všechny ohrožují budoucí plodnost ženy.

Podpořeno MZ ČR - RVO (Fakultní nemocnice Plzeň - FNPl, 00669806).

PharmDr. Radek Kučera, Ph.D.

FN Plzeň, Imunoanalytická laboratoř

Oddělení nukleární medicíny

Dr. E. Beneše 13

 305 99 Plzeň

e-mail: kuucera@seznam.cz