Klinický význam mikrometastáz karcinomu prsu v sentinelové uzlině

Cíl studie:
Zavedení biopsie sentinelové uzliny do rutinní praxe a zlepšení metodik histopatologického a imunohistochemického vyšetření přineslo vyšší frekvenci detekovaných mikrometastáz. V současné době není jednotný názor na klinický význam těchto mikrometastáz, publikované studie o vztahu mezi přítomností mikrometastázy a průběhem onemocnění přinášejí rozdílné výsledky. Cílem studie bylo vyhodnocení vlivu mikrometastáz karcinomu prsu v sentinelové uzlině k průběhu onemocnění.

Typ studie:
Retrospektivní studie.

Pracoviště:
Gynekologicko-porodnická klinika FN Motol, Praha.

Metodika:
Retrospektivně bylo vyšetřeno 87 případů negativity sentinelové uzliny z období od ledna 2000 do prosince 2006. Tkáňové bločky uzlin byly sériově vyšetřeny metodou hematoxilin-eozinem a imunohistochemicky. Dále bylo vyhodnoceno dalších 15 případů mikrometastatického postižení sentinelových uzlin ze stejného období, které bylo nalezeno již při zpracování uzliny v průběhu operace metodou „zmrazeného řezu“. U 67 žen s negativním nálezem v sentinelové uzlině a u 35 žen s mikrometastázou byl vyhodnocen průběh onemocnění. Průměrná délka sledování žen byla 60 měsíců (24-96 měsíců).

Výsledky:
V původně negativním souboru sentinelových uzlin bylo sériovým vyšetřením a imunohistochemicky nalezeno 20 případů (23 %) mikrometastáz. Ve skupině žen s negativním nálezem (N0) došlo v 7 případech k vývoji recidivy nádoru (10,5 %) a ve skupině 35 žen s mikrometastázou (Nmic) nastala recidiva v 5 případech (13,3 %). Ve skupině N0 jsme pozorovali dvě regionální recidivy a tři úmrtí, ze kterých však dvě úmrtí nesouvisela se základním onemocněním. Ve skupině Nmic došlo k jedné regionální recidivě a ke třem úmrtím následkem generalizace nemoci.

Závěr:
V naší studii byl prokázán vztah mezi přítomností mikrometastázy a rizikem vývoje vzdálených metastáz a generalizací nemoci, avšak nikoli vztah k riziku regionální recidivy nemoci.

Klíčová slova:
mikrometastázy, sentinelová uzlina, karcinom prsu.

ÚVOD

Stav lymfatických uzlin je jedním z rozhodujících prognostických faktorů karcinomu prsu a má rozhodující vliv na strategii další léčby. Postižení uzlin nádorem je považováno za prognosticky nepříznivý faktor a indikuje nasazení systémové léčby. V případě negativního nálezu bývají však popisovány recidivy nemoci do 5 let až u 15 až 20 % žen. Poměrně častá frekvence recidiv v případech negativity axilárních uzlin vedla k řadě retrospektivních studií, které revidovaly původně negativní bioptické vzorky uzlin. Metodami sériového vyšetření uzliny barvené hematoxylin-eozinem (H&E) a imunohistochemickým stanovením (IHC), především cytokeratinů byly nalezeny v původně negativních lymfatických uzlinách mikrometastázy karcinomu s frekvencí mezi 9 – 33 % [8].

Za mikrometastázu v uzlině je považováno nádorové depozitum velikosti 0,2–2 mm. Takovéto depozitum nelze většinou rutinním histopatologickým vyšetřením detekovat a spekuluje se o tom, že výskyt mikrometastáz bude spojen s vyšším rizikem recidivy a jsou tedy nepříznivým prognostickým faktorem. Nádorová depozita menší než 0,2 mm jsou prokazována pouze imunohistochemicky a označují se jako „izolované nádorové buňky“ (ITC). Při sledování vztahu mezi přítomností mikrometastáz a průběhem onemocnění výsledky jednotlivých studií vykazovaly značnou heterogenitu. Některé studie nalezly v případech výskytu mikrometastáz horší průběh nemoci [5, 21, 22], některé nikoli [12, 13, 16, 19].

V současné době, kdy je biopsie sentinelové uzliny již standardem chirurgické intervence v axile, patologové stále častěji nalézají přítomnost mikrometastáz. Cílem naší práce bylo retrospektivní vyhodnocení klinického významu nalezené mikrometastázy ve vztahu k prognóze žen a určení rizika postižení nesentinelových axilárních uzlin.

SOUBOR A METODIKA

V letech 2000–2007 bylo na gynekologicko-porodnické klinice FN Motol provedeno 337 biopsií sentinelové uzliny. Absence postižení uzliny nádorem byla nalezena ve 241 případech (71,5 %), postižení nádorem v 81 případech (24 %). V 15 případech, kdy peroperační vyšetření uzliny detekovalo přítomnost mikrometastázy (4,5 %) byla provedena disekce axily. Ve všech 15 případech mikrometastáz v sentinelové uzlině nebyly v uzlinách vyšší etáže nalezeny další makro- či mikrometastázy. Vybrané případy 87 negativních nálezů v sentinelových uzlinách z období 2000–2006 byly retrospektivně sériově vyšetřeny pro potvrzení či vyloučení přítomnosti mikrometastáz. V roce 2008 bylo provedeno vyhodnocení průběhu onemocnění u tohoto souboru 87 žen společně vyhodnocením klinického stavu 15 žen s nalezenými mikrometastázami již při peroperačním vyšetření. Průměrná doba sledování byla 60 měsíců s rozptylem od 24 do 96 měsíců. Základní charakteristiky sledovaných souborů žen jsou uvedeny v tabulce 1.

METODIKA HISTOPATOLOGICKÉHO HODNOCENÍ

Sentinelová uzlina odeslaná k peroperačnímu vyšetření technikou „zmrazeného řezu“ (FS) byla rozdělena na dvě poloviny tak, aby se při prokrajování dostala do řezu v největším rozměru. Z poloviny uzliny zmrazené v tekutém dusíku byl odkrojen řez pro peroperační vyšetření. V případě sporného nálezu bylo provedeno přikrojení uzliny. Zmrazený bloček byl z uzliny po odkrojení řezů pro FS rozmražen a spolu s druhou polovinou uzliny fixován v 10% pufrovaném formolu 24 hodin a dále zpracován běžnou parafinovou metodou.

Z parafinových bločků z každé uzliny byly připraveny obvykle tři řezy pro barvení hematoxylinem-eozínem. V uzlinách, kde nebyl nález zcela jasný a vzešlo podezření na metastázu, bylo provedeno další prokrojení uzliny a imunohistochemické vyšetření protilátkami proti širokospektrému cytokeratinu Anti-Human Cytokeratin AE1/AE 3 (DAKO), nebo proti Cytokeratinu large spektrum (Immunotech). Pro detekci mikrometastáz byly parafínové bločky z vybraného souboru 87 negativních sentinelových uzlin dále prokrájeny v intervalu 0,2 mm, vyšetřeny metodou hematoxylin-eozínem a rutinně imunohistochemicky polyklonálními protilátkami (Cytokeratin large spectrum – Immunotech), Anti-Human Cytokeratin AE1/AE3 (DAKO) a monoklonálními protilátkami (Anti-Human Cytokeratin, Clone MNF 116 (DAKO) a Anti-Human Epithelial Membrane Antigen (EMA)(DAKO). Reakce byly vizualizovány za použití DAB (diaminobenzidin) (FLUKA).

VÝSLEDKY

Ze sériového zpracování 87 původně negativních sentinelových uzlin byly mikrometastázy nalezeny ve 20 případech (23 %). Ve 12 případech byly nalezeny mikrometastázy mezi 0, 2–2 mm a v 8 případech byly imunohistochemicky detekovány pouze izolované nádorové buňky (20 %). To je podstatný rozdíl proti 4,5% frekvenci mikrometastáz nacházených peroperačním vyšetřením metodou FS. V těchto 15 případech (4,5 %) byla provedena disekce axily a všechny uzliny byly bez dalších mikro či makrometastáz. Postup další onkologické léčby se tedy podstatně nelišil, protože všechny ženy byly léčeny jako „node negativní“ podle obvyklých parametrů jako: velikost nádoru, grade, věk, stav hormonálních receptorů a úroveň exprese ERB2.

V říjnu 2008 byl vyhodnocen stav sledovaného souboru žen.Ve skupině žen s mikrometastázou (Nmic) bylo zaznamenáno pět recidiv (14,3 %) a ve skupině s negativním nálezem v axile (N0) bylo recidiv sedm (10,5 %). K manifestaci všech recidiv došlo do 24 měsíců od primární léčby. Tabulka 2 zobrazuje zastoupení různých druhů recidiv (lokální, regionální a vzdálené) ve sledovaných skupinách žen.

Při rozboru recidiv a úmrtí ve skupině žen s negativním nálezem v sentinelové uzlině jsme nalezli u jedné ženy lokální recidivu nádoru v kontralaterálním prsu, ve dvou případech regionální recidivu v axile a tři úmrtí, avšak z toho dvě nesouvisely s karcinomem prsu (kardiovaskulární příhody).

Ve skupině žen s mikrometastázou v sentinelové uzlině se vyskytly dvě lokální recidivy (jednou operovaný a jednou kontralaterální prs), jedna regionální recidiva současně se vzdálenou metastázou v hrudní páteři s následnou generalizací a úmrtím a ve dvou případech se objevila náhlá generalizace nemoci s úmrtím. Společným faktorem recidiv u většiny žen mimo dvou úmrtí na kardiovaskulární komplikace byla absence systémové léčby, v převážné většině ženy užívaly adjuvantní hormonální léčbu. Avšak podle současných guidelines léčby až na jeden případ nebyla chemoterapie u těchto žen indikována.

Statisticky nebyl prokázán významný rozdíl ve frekvenci metastáz mezi oběma soubory, avšak při podrobnějším rozboru se zdá být přítomnost mikrometastáz spojená s horší prognózou onemocnění. Přítomnost mikrometastázy v sentinelové uzlině v našem souboru však nebyla spojena s vyšší frekvencí regionálních recidiv, jak by se dalo předpokládat.

V souboru 35 mikrometastáz v sentinelové uzlině jsme nalezli mikrometastázy v 77,1 % a izolované nádorové buňky detekované pouze imunohistochemicky ve 22,9 %. Popsané recidivy pocházely vždy ze skupiny žen s mikrometastázami.

DISKUSE

Přítomnost mikrometastázy v sentinelové uzlině představuje dilema pro další postupy léčby. Peroperační detekce mikrometastázy metodou zmraženého řezu je nahodilou záležitostí, v našem souboru to představovalo 4,5 % případů. Podle současných pravidel léčby je tento nález indikací k disekci axily, avšak my jsme v žádném případě v získaných uzlinách nenalezli nádorové postižení, byť jen mikrometastázou. Na druhou stranu sériové zpracování a imunohistochemické vyšetření původně negativních uzlin odhalilo 23% frekvenci mikrometastáz. Toto zpracování vyžaduje čas a výsledek je znám až dlouho po operaci. V naší práci jsme u skupiny žen s mikrometastázou nalezli jednu regionální recidivu a tato recidiva byla spojena s manifestací vzdálené metastázy. V tomto případě nebyla podána indikovaná systémová léčba (chemoterapie). Ve skupině s negativním nálezem v sentinelové uzlině jsme zaznamenali dvě regionální recidivy, opět u těch žen bez systémové léčby (chemoterapie).

Naskýtá se tedy otázka, jestli má být provedena v případech detekované mikrometastázy systematická disekce axily. Dilema dalšího postupu léčby v těchto případech řešilo mnoho studií. Van Deurzen [9] nalezl v případech výskytu izolovaných nádorových buněk v sentinelové uzlině postižení dalších uzlin metastázou ve 13 %, při nálezu mikrometastázy byla frekvence postižení 20 % a v případech makrometastázy dosáhlo postižení již 48 %. Tato studie podporuje stávající management léčby, kdy při detekci mikrometastázy je indikována kompletní axilární disekce. Podle další studie vynechání kompletní disekce axily u stadia pNmic při velikosti nádoru do 2 cm vedlo až ke 20% frekvenci reziduální nemoci [18]. Houvenaeghel [11] doporučuje vynechání axilární disekce při nálezu mikrometastázy jen u minimálního rizika jako například u nádorů ve stadiu pT1a, pT1b nebo u stadia pT1a-b-c s histotypem tubulárního, koloidního nebo medulárního karcinomu. Další studie podporují vynechání disekce axily jen při prognosticky příznivých parametrech primárního nádoru velikost tumoru do 2 cm, absence lymfangioinvaze a hodnoty mitotického indexu pod 10 % [4], některé studie neprokázaly vyšší frekvenci axilárních recidiv či zhoršení prognózy nemoci u Nmic v sentinelové uzlině a doporučují disekci axily vynechat [14, 16]. V roce 2008 publikovali autoři z Tampy výsledky sledování velkého souboru 2408 žen. V případech mikrometastázy v sentinelové uzlině nalezli postižení dalších uzlin u 9 (3 %) žen. Avšak v průběhu 7 let sledování nenalezli rozdíly v intervalu přežití ve skupině Nmic a N0 [6]. Nízká frekvence regionálních recidiv ve skupině Nmic a absence postižení ostatních uzlin v našem souboru podporují názor o možnosti selektivního vynechání disekce axily u prognosticky příznivých parametrů nádoru (velikost do 5 mm, grade 1, absence lymfangioinvaze), nebo v případě malého objemu metastatického postižení (izolované nádorové buňky - ITC) detekovaného pouze imunohistochemicky.

O prognostickém významu mikrometastatického postižení sentinelové uzliny se stále diskutuje. Řada studií prokázala při výskytu mikrometastáz zhoršení prognózy nemoci [5, 15, 18, 21, 22]. Naopak, některé studie významné zhoršení prognózy nenalezly [12, 13, 16, 19].

Výsledky Milánské studie uvádějí zvýšení rizika Nmic proti N0 dané indexem HR (hazard ratio) = 1,5 pro interval bez nemoci ve 4letém intervalu sledování. Interval přežití mezi oběma skupinami nebyl odlišný, avšak doba sledování pro tento parametr byla velmi krátká [5]. V další studii nebyl nalezen rozdíl v průběhu onemocnění (DFI, OS) mezi pNmic a pN0, a autoři nevidí proto indikaci k adjuvantní chemoterapii u pNmic [10]. Závěry studie z Bordeaux vyznívají obdobně, mikrometastatické postižení uzliny samo o sobě není indikací k adjuvantní chemoterapii [17]. Výraznou heterogenitu studií je možné dokumentovat výsledky dvou rozdílných studií z letošního roku. Tan [23] v souboru 368 žen s negativním nálezem v uzlinách po dobu dvaceti let sledování nalezl signifikantní zhoršení prognózy nemoci v souvislosti s mikrometastázou, zatímco Bulte a kolektiv [2] nikoli.

V současné době biopsie sentinelové uzliny a pečlivějšího histopatologického vyšetření s používáním imunohistochemických metod stoupá frekvence záchytu mikrometastatického postižení uzliny. Avšak mikrometastázy detekované jen imunohistochemicky nezhoršovaly interval přežití žen [10], ani nebyly spojeny s vyšší frekvencí regionálních recidiv [14].

Nádorové mikrometastázy v sentinelové uzlině je nutno posuzovat v kontextu s parametry primárního nádoru a také s metodou detekce a uložením metastáz v uzlině. Například jednotlivé nádorové buňky zachycené imunohistochemicky v subkapsulárním sinusu uzliny jsou důkazem schopnosti nádorových buněk překonat anatomické bariéry, nemusí být však důkazem jejich schopnosti přežít v imunologicky nepříznivém prostředí lymfatické uzliny. Stejně tak nádorové buňky obklopené leukocyty a jinými imunologickými elementy mají dvě možnosti: budou tímto systémem zničeny, nebo založí ložisko, které poroste. Přítomnost nádorových buněk v parenchymu uzliny signalizuje jejich schopnost zde přežít. Avšak stejně jako v předchozím případě zbývá objasnit otázku, zdali tato nádorová depozita zde budou růst, nebo regredovat.

Naše zkušenosti s lymfatickým mapováním sentinelové uzliny přinesly doklady o poměrně velmi rychlém lymfatickém proudění, kdy barvivo po 2 minutách od aplikace je „dopraveno“ až do axilárních uzlin. Vzhledem k prokázanému benignímu mechanickému transportu epiteliálních buněk je možné předpokládat delší expozici sentinelové uzliny nádorovým buňkám a určitou roli imunitního dozoru při jejich likvidaci nebo toleranci. Daleko častěji byly nalezeny izolované nádorové buňky po intervencích jako „core cut“ biopsie nebo po masáži prsu po aplikaci lymfotropního barviva [7, 20]. Ve shodě s uvedenými autory jsme v našem souboru osmi žen (22,9 %) s nálezem ITC nezaznamenali nádorovou recidivu. Tři případy generalizace onemocnění a úmrtí ve skupině Nmic jsou signálem pro intenzivnější výzkum významu mikrometastáz v periferní krvi a kostní dřeni. Angioinvaze provází malignity od velmi časných stadií a cirkulující nádorové buňky v periferní krvi jsou prokazovány až u 60 % žen s karcinomem prsu. Nádorové buňky karcinomu prsu v kostní dřeni mohou mít funkci tzv. kmenových buněk [1]. Zaměření výzkumu tímto směrem by mohlo objasnit nevysvětlitelné generalizace nemoci při negativním nálezu v uzlinách. K sledování významu cirkulujících nádorových buněk přispívají výsledky dalších studií, které prokázaly kapacitu uzlinových metastáz růst pouze v lymfatické tkáni (uzlinách) bez schopnosti zakládat orgánové metastázy. Postižení axilárních uzlin by mělo znamenat pouze prognostický faktor schopnosti nádoru zakládat vzdálené metastázy, avšak nikoli přímým přestupem z uzlin, nýbrž jinou (hematogenní) cestou [3].

ZÁVĚR

Ve sledovaném souboru negativních sentinelových uzlin byla sériovým vyšetřením nalezena 23% frekvence mikrometastáz. Dalším sledováním průběhu onemocnění u skupiny žen s Nmic a s N0 jsme neprokázali signifikantní rozdíl ve frekvenci lokálních či regionálních recidiv. Ve skupině Nmic však bylo více úmrtí na generalizaci nádoru, které není možné vysvětlit nálezem nádoru v uzlinách. Přítomnost mikrometastázy je nutno hodnotit jako rizikový faktor a další léčbu navrhnout v souvislosti s dalšími biologickými parametry primárního nádoru. Nedomníváme se, že přítomnost ITC v sentinelové uzlině je rizikovým faktorem, který by měl měnit průběh léčby. Další výzkum v oblasti angiogenního šíření nádoru je nezbytný.

Práce byla podpořena grantem IGA MZ ČR NR 8874-3.

MUDr. Pavel Strnad, CSc.

Gynekologicko-porodnická klinika

2. LF UK a FN Motol

V Úvalu 84

150 06 Praha 5