Syntéza alkylesterů kyseliny 2-{3-[4-(4-fluorfenyl)-piperazin-1-yl]-2-hydroxy-propoxy}-fenylkarbamové a in vitro hodnocení jejich β-antiadrenergní a vazodilatační aktivity

Ve snaze získat látky příznivě ovlivňující patologicky změněné kardiovaskulární funkce, jako je hypertenze a ischemická choroba srdeční, byla připravena nová série látek ze skupiny aryloxyaminopropanolů. Čtyři z těchto látek lišící se substitucí fenylkarbamátu (methyl, ethyl, propyl, butyl) byly vybrány pro základní farmakologické hodnocení in vitro. Všechny látky snižovaly v pokusech na izolovaných spontánně tepajících předsíních morčete v konc. 1,0.10⁻⁶ základní tepovou frekvenci (7,6–13,6 %) a inhibovaly pozitivně chronotropní efekt isoprenalinu (pA2 = 6,28–6,81). Látky vykazovaly pouze mírnou relaxaci KCl prekontrahovaných potkaních aortálních preparátů (až při koncentraci 1,0.10⁻⁵). Sloučeniny s propyl- a butyl- substitucí se jeví být účinnější než methyl- a ethyl- deriváty.

Klíčová slova:
aryloxyaminopropanoly – ß-antiadrenergní aktivita – izolovaná předsíň – izolovaná aorta

Úvod

Arteriální hypertenze je nejčastějším onemocněním kardiovaskulárního systému s 25% prevalencí v populaci dospělých. Neléčená hypertenze mnohonásobně zvyšuje riziko ischemické choroby srdeční, infarktu myokardu a zejména mozkové ischémie, onemocnění s nejvyšší mortalitou vůbec. Esenciální hypertenze je způsobena patologickým zvýšením tonu sympatické složky vegetativního nervového systému, a proto se k její terapii používají především látky antagonizující adrenergní receptory tohoto systému. Základní strukturou antagonizující ß-adrenergní receptory je aryloxyaminopropanol, případně arylaminoethanol. Látky obsahující ve své struktuře substituovaný fenylpiperazin (urapidil, naftipidil) pak výrazně antagonizují α-adrenergní receptory. Klinicky využívané sloučeniny s kombinovaným účinkem na α i β adrenergní receptory jsou v současnosti labetalol, karvedilol a celiprolol ^1–3).

Snaha o nalezení látky s kombinovaným antihypertenzním účinkem vyústila v přípravu sérií látek ze skupiny jak arylaminoethanolu, tak aryloxyaminopropanolu, obsahujících ve své struktuře substituované fenylpiperaziny. 4-fluoro substituce fenylpiperazinu navíc vykazovala výrazné vazodilatační účinky (na rozdíl od 2-methoxy- substituce) ^4–6). Cílem práce byla proto příprava čtyř dalších sloučenin s 4-fluorfenylpiperazinem v bazické části molekuly a alkylkarbamátovou skupinou v poloze 2 fenylového jádra a in vitro zhodnocení jejich β-antiadrenergní a vazodilatační aktivity.

Pokusná část

Syntetická část

Rozpouštědla a chemikálie byly dodány od koncernu Sigma-Aldrich (GE) a firmy Lachner (CZ) a byly použity bez dalšího přečištění.

Látky UCHL 11-UCHL 14 byly připraveny třístupňovou syntézou (obr. 1). Alkylestery kyseliny 2-hydroxyfenylkarbamové byly připraveny reakcí 2-aminofenolu (0,2 mol) s odpovídajícími alkylestery kyseliny chlormravenčí (0,1 mol) v prostředí diethyletheru. Alkylestery kyseliny 2-[(2,3-epoxy)-propoxy]-fenylkarbamové byly připraveny reakcí alkylesteru kyseliny 2-hydroxyfenylkarbamové (0,1 mol) s 1-chlor-2,3-epoxypropanem (0,3 mol) v zásaditém prostředí hydroxidu draselného. Metody byly již dříve popsány ⁷⁾. Konečné látky byly připraveny reakcí příslušné epoxysloučeniny (0,01 mol) s 1-(4-fluorfenyl)-piperazinem (0,01 mol) v prostředí 2-propanolu. Směs byla zahřívána 6 hodin při teplotě varu rozpouštědla. Rozpouštědlo bylo vakuově oddestilováno, surový produkt rozpuštěn v diethyletheru a přidáním nasyceného etherického roztoku chlorovodíku byly získány amorfní sraženiny příslušných hydrochloridů, jež byly následně rekrystalizovány z ethanolu.

Teploty tání byly stanoveny na Kofflerově bloku po vysušení nad P₂O₅ za sníženého tlaku. Nejsou korigovány.

NMR spektra byla změřena na přístroji Varian Gemini 200 (¹H 200 MHz, ¹³C 50,3 MHz). Chemické posuny jsou uvedeny v ppm (δ) v poměru k tetramethylsilanu jako vnitřnímu standartu.

Infračervená spektra byla změřena na IČ spektrofotometru NICOLET Model Impact 410, v rozsahu vlnových délek 4000–400 cm^-1. Vzorky byly měřeny v pevné formě, připravené lisováním do tablety s KBr v koncentraci 1,0–1,5 mg látky na 400 mg KBr.

Biologická část

Antagonistický účinek nově syntetizovaných látek na pozitivně chronotropní efekt ß-adrenergního agonistyisoprenalinu byl sledován na izolovaných, spontánně tepajících předsíních morčat. Pravá předsíň srdce z morčete byla napojena na izometrický snímač v Tyrodově roztoku (složení v mmol.l^-1: NaCl 137,0; KCl 2,7; NaHCO₃ 25,0; MgCl₂ 1,0; NaH₂PO₄ 0,42; CaCl₂ 1,9 a glukosa 11,0) při teplotě 30 °C pod stálým napětím 1 g a provzdušňována pneumoxidem (O₂ + 5% CO₂). Po 30 minutách stabilizace preparátu byl kumulativně přidáván isoprenalin ve formě hydrochloridu (Sigma-Aldrich, GE) v koncentracích 10^-12 až 10 ⁶ mol.l^-1 a po každém přidání byly zaznamenány změny tepové frekvence. Po propláchnutí a ustálení preparátu byla do lázně podána testovaná látka v koncentraci 10^-6 mol.l^-1 a po 20 min znovu kumulativně aplikován isoprenalin. Afinita k isoprenalinu byla vyjádřena jako jeho střední efektivní koncentrace (EC₅₀). Míra antagonistického působení testovaných látek byla vypočítána z posunu křivek závislosti účinku na koncentraci jako disociační konstanta pA₂ ⁸⁾. Relativní změny tepové frekvence předsíní byly hodnoceny vzhledem k počátečním hodnotám v pětiminutových intervalech po aplikaci testované látky. Pro porovnání účinku byl použit jako standard ß-adrenergní antagonista celiprolol ve formě hydrochloridu (Rhône-Poulenc Rorer, FR) v koncentraci 10 ⁷ mol.l^-1.

Vazodilatační účinek nově syntetizovaných látek byl sledován na izolovaných a KCl prekontrahovaných aortách potkanů. Dospělí potkani kmene Wistar o hmotnosti 240–300 g byli anestezováni i.p. aplikací pentobarbitalu (50 mg.kg^-1) a následně byla izolována aorta. Nařezané kroužky (4 mm) byly upevněny k snímači pro izometrické měření v orgánové lázni naplněné Krebs-Henseleitovým roztokem (složení v mmol.l^-1: NaCl 118,0; KCl 4,7; NaHCO₃ 25,0; MgSO₄ 1,6; KH₂PO₄ 1,2; CaCl₂ 2,5 a glukosa 11,0) při teplotě 37 °C pod stálým napětím 1 g a provzdušňovány pneumoxidem. Po 2 hodinách stabilizace preparátu byl přidán vodný roztok KCl (50 mmol.l^-1), který navodil depolarizaci buněčné membrány doprovázenou otevřením pomalých napěťově řízených vápníkových kanálů a vniknutím Ca²⁺ do buňky. Po ustálení napětí preparátu byly kumulativně přidávány testované látky v koncentracích 10^-7 až 10^-5 mol.l^-1 a zaznamenány změny napětí aorty na lineárním zapisovači (Laboratorní přístroje, Praha). Při maximální relaxaci byl k preparátu aplikován roztok CaCl₂ o koncentraci 8.10^-3 mol.l^-1 a zaznamenána následovná kontrakce. Pro porovnání účinku byla použita vasodilatancia působící prostřednictvím inhibice účinku Ca²⁺ v buňce hladkého svalu, tj. verapamil hydrochlorid (Sigma-Aldrich, GE) a flunarizin dihydrochlorid (VÚL, Modra, SR).

Výsledky a diskuze

Syntetická část

Byly připraveny čtyři nové látky, alkylestery kyseliny 2 {3-[4-(4-fluorfenyl)-piperazin-1-yl]-2-hydroxy-propoxy}-fenylkarbamové lišící se navzájem délkou alifatického řetězce. Základní charakteristiku nově syntetizovaných látek uvádí tabulka 1. Struktura látek byla potvrzena ¹H NMR (tab. 2) a ¹³C NMR (tab. 3) spektroskopií.

V infračervené oblasti spektra látky vykazují charakteristické vibrační pásy (tab. 4).

Biologická část

Hodnoty EC₅₀, pA₂ a hodnoty relativních změn tepové frekvence uvádějí tabulky 5 a 6. Jak ukazují hodnoty pA₂, všechny testované látky vykazují ß-antiadrenergní aktivitu, která je přibližně 16- až 57násobně nižší než aktivita celiprololu, přičemž se mírně zvyšuje s velikostí alkylu karbamátu. Rozdíly mezi jednotlivými deriváty však nebyly statisticky významné. Podobnou aktivitu vykazují i strukturálně příbuzné látky hodnocené dříve ^5,6).

Všechny látky přidané k izolovanému myokardiálnímu preparátu v koncentraci 10^-6 mol.l^-1 snižovaly tepovou frekvenci v průměru o 7,6–13,6 %. Tento pokles byl pozvolný, rozvíjející se v průběhu sledovaných 20 min. Intenzita negativní chronotropie se prohlubovala se zvětšujícím se substituentem od methylu po butyl. Účinek látek na TF je u látek s větším substituentem (UCHL 13 a 14) porovnatelný s celiprololem, který byl však podán v desetinásobně nižší koncentraci (10^-7 mol.l^-1) (tab. 6).

Míru relaxace izolované aorty potkanů prekontrahované KCl uvádí tabulka 7. Všechny látky podávané kumulativně vykazovaly výraznou relaxaci až v koncentraci 10^-5 mol.l^-1, na rozdíl od verapamilu a flunarizinu, u kterých se relaxace projevila už v 100násobně nižších koncentracích. Ve srovnání s 4-alkylkarbamátovým polohovým izomerem ⁵⁾ se jeví 2-substituce fenylu jako méně výhodná a oproti benzofuranovým analogům ⁶⁾ vykazují látky výrazně nižší vazodilatační efekt. Vzhledem ke skutečnosti, že po přidání roztoku CaCl₂ došlo opět ke kontrakci aorty, je pravděpodobné, že sledované látky působí přímo inhibičně na účinky Ca²⁺ v hladké svalovině aorty.

Ze získaných výsledků vyplývá, že látky s většími substituenty na jádře, tj. s propyl (UCHL 13) a butylkarbamátovou substitucí (UCHL 14), mají vyšší schopnost ovlivňovat základní kardiovaskulární funkce. Obě látky potvrdily schopnost specificky inhibovat pozitivně chronotropní účinky izoprenalinu na srdci i působit vazodilatačně. Proto se v našich dalších experimentech budeme věnovat studiu jejich účinků v podmínkách in vivo u intaktních zvířat a sledovat jejich potenciální antihypertenzní aktivitu.

Došlo 18. dubna 2008

Přijato 30. dubna 2008

Adresa pro korespondenci:

Mgr. Tomáš Goněc

Ústav chemických léčiv VFU FaF

Palackého 1–3, 612 42 Brno

e-mail: tgonec@vfu.cz