Antioxidační aktivita tinktur připravených z hlohových plodů a nati srdečníku

Cílem práce bylo stanovit a porovnat antioxidační aktivitu dvou tinktur a vybraných flavonoidů přítomných v tinkturách. Tinktury byly připraveny z hlohových plodů a nati srdečníku. Skupina vybraných flavonoidů zahrnovala rutin, kvercetin, hyperozid, epikatechin a procyanidin B2. Ke stanovení antioxidační aktivity sloužily dvě metody: Byla měřena inhibice peroxynitritem indukované nitrace tyrosinu a schopnost zhášet radikály byla sledována pomocí stabilního radikálu 2,2-difenyl-1-pikrylhydrazylu (DPPH). Obě zkoumané tinktury byly schopné zhášet radikály a reaktivní formy kyslíku a dusíku. Účinnější byla tinktura z nati srdečníku, avšak neprokázal se přímý vliv fenolických sloučenin na rozsah antioxidační aktivity. Celkový obsah polyfenolů byl v tinktuře z nati srdečníku o 163 % větší, přesto antiperoxynitritová aktivita byla vyšší jen o 19 % (p < 0,05), a schopnost redukce DPPH se u obou tinktur lišila minimálně. Z jednotlivých flavonoidů se nejvíce na antioxidační aktivitě podílely látky, přítomné v tinkturách ve vyšších koncentracích. V tinktuře z hlohových plodů to byly epikatechin a hyperozid, kdežto v tinktuře z nati srdečníku rutin.

Klíčová slova:
Crataegi fructus – Leonuri herba – tinktury – flavonoidy – antioxidační aktivita

Úvod

Mezi faktory, kterým je v současnosti připisován stále větší význam v rozvoji patologických procesů v organismu, patří volné radikály. Tyto částice vznikají jako vedlejší produkty buněčného metabolismu a představují vysoce reaktivní formy kyslíku a dusíku, velmi rychle interferující s vhodnou biologickou strukturou (např. DNA, lipidy či proteiny) ¹⁾. Taková reakce pak často vede k dočasnému nebo trvalému poškození biomolekul ²⁾.

Volné radikály hrají klíčovou úlohu při vzniku a rozvoji kardiovaskulárních a nádorových onemocnění, zánětlivých procesů, cukrovky, neurodegenerativních poškození, urychlují rovněž stárnutí organismu ^3–7). Protože vznikají jako přirozený produkt buněčného metabolismu, je za normálních okolností každá buňka vybavena specifickými mechanismy, které ji chrání před těmito reaktivními částicemi ¹⁾. Takový systém tvoří některé enzymy (superoxiddismutasa, katalasa, glutathionperoxidasa), proteiny a další látky (glutathion, α-tokoferol, kyselina askorbová aj.) ^{8, 9)}. Při porušení obranných mechanismů může dlouhodobě docházet k poškozování buněčných struktur.

Účinnou zbraní proti negativnímu působení reaktivních forem kyslíku a dusíku jsou látky s antioxidačním účinkem – antioxidanty, jako jsou vitaminy, enzymy, stopové prvky (Se, Zn, Cu) a látky rostlinného původu ^6, 10, 11). Mezi antioxidanty rostlinného původu patří polyfenoly, zejména flavonoidy, které mohou vykazovat celou řadu dalších biologických aktivit, např. antikancerogenní, imunostimulační, antialergické, protizánětlivé, antibakteriální a další ^{3, 11)}. Proto některé fytopreparáty současně s hlavním farmakologickým efektem zvyšují ochranu organismu proti následkům oxidačního stresu.

K tradičním léčivým rostlinám ovlivňujícím kardiovaskulární systém se řadí hloh jednosemenný (Crataegus monogyna Jacq.) nebo obecný (Crataegus laevigata (Poir.) Dc.) z čeledi růžovitých (Rosaceae) ^{12, 13)}. Jako droga se používá květ (Crataegi flos), list s květem (Crataegi folium cum flore) nebo plod (Crataegi fructus). Z těchto drog se ve světě vyrábí celá řada fytopreparátů, které se uplatňují jako hypotonika, kardiotonika, antisklerotika, sedativa, spazmolytika či diuretika ¹⁴⁾. Převážnou část účinných látek v droze tvoří flavonoidy, triterpenové kyseliny, puriny a některé další látky ^14–16), u nichž byl v literatuře popsán antioxidační efekt ^{16, 17)}.

Mnohem méně prozkoumanou rostlinou, rovněž charakteristickou kardiovaskulárním působením, je srdečník obecný (Leonurus cardiaca L.) z čeledi hluchavkovitých (Lamiaceae), u něhož jako droga slouží nať (Leonuri herba). Přípravky z nati srdečníku mají účinek kardiotonický, hypotonický, sedativní, spazmolytický a diuretický ¹⁸⁾. Droga obsahuje glykosidy, flavonoidy, labdanové diterpeny, saponiny, některé organické kyseliny a další látky ^{19, 20)}.

Litevské farmaceutické podniky vyrábějí tinktury z hlohových plodů a nati srdečníku, které slouží jako podpůrná léčba ve výše zmíněných indikacích, proto je studium antioxidační aktivity těchto přípravků v současné době aktuální.

Cílem práce bylo stanovení antioxidační aktivity uvedených tinktur a rovněž hodnocení vlivu vybraných obsahových látek na antioxidační aktivitu tinktur.

Pokusná část

Materiál

Hlohové plody (Crataegi fructus) a nať srdečníku (Leonuri herba) poskytla Kaunasská botanická zahrada Univerzity Vytautase Velikého. Drogy splňovaly požadavky Evropského lékopisu. Ze zmíněných drog byly klasickou perkolací připraveny tinktury v poměru 1:5, kde jako vyluhovadlo sloužil ethanol 50% (tinktura z hlohových plodů) nebo ethanol 70% (tinktura z nati srdečníku). Látky k přípravě standardů (rutin, kvercetin, hyperozid, epikatechin, procyanidin B2) dodala firma UAB „Grida LAB“ (Litva).

Ke stanovení fenolických sloučenin a antioxidační aktivity byly použity chemikálie: tyrosin (BDH Chemicals, 3-nitrotyrosin (Aldrich), DPPH (Sigma), Folin-Ciocalteuovo činidlo a kyselina galová (Fluka). Další pro experiment potřebné chemikáliebyly běžně komerčně dostupné. Roztok peroxynitritu byl připraven podle metody popsané v literatuře ²¹⁾.

Metodika

Stanovení flavonoidů HPLC ²²⁾

K těmto účelům sloužil chromatografický systém Waters 2690 (detektor UV Waters 2487, kolona X-terra RP18 3,0 × 150 mm, velikost částic sorbentu 3,5 μm). Složení mobilní fáze bylo 0,1% vodný roztok kyseliny trifluoroctové (A) a 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové v acetonitrilu (B). Změny gradientu: od 5 % (B) do 45 % (B) za 45 min. Průtok mobilní fáze byl 0,4 ml/min. Pro chromatografickou analýzu byly vybrány vlnové délky 360 nm a 275 nm. Množství flavonoidů bylo vypočítáno z kalibračních grafů na základě plochy píku.

Stanovení fenolických sloučenin

Celkový obsah fenolů byl stanoven pomocí kolorimetrické metody ²³⁾; 700 μl vodou naředěné tinktury bylo oxidováno Folin-Ciocalteuovým činidlem (400 μl) a poté byla reakční směs doplněna do 10,0 ml roztokem uhličitanu sodného (75 g/l). Po 2 hodinách byla suspenze odstředěna (10 min při 5000 ot./min) a změřena výsledná absorbance při 760 nm. Kvantifikace byla provedena na základě kalibrační křivky pro kyselinu galovou. Výsledky byly vyjádřeny jako ekvivalent kyseliny galové (GAE) v mg na 100 ml tinktury.

Ke stanovení antioxidační aktivity sloužily dvě metody. Byla měřena inhibice peroxynitritem indukované nitrace tyrosinu ^21, 24) a schopnost zhášet radikály byla sledována pomocí stabilního radikálu 2,2-difenyl-1-pikrylhydrazylu (DPPH) ^{25, 26)}. Zjišťovala se antioxidační aktivita samotných tinktur a rovněž antioxidační aktivita vybraných flavonoidů (rutin, kvercetin, hyperozid, epikatechin, procyanidin B2). Koncentrace uvedených sloučenin ve zkoumaných roztocích (standardech) byly totožné s koncentracemi daných látek v tinkturách.

Inhibice nitrace tyrosinu

K měření sloužil kapalinový chromatograf HP 1100 (Agilent Technologies) obsahující kvaternární pumpu, autosampler a detektor s diodovým polem. Analýzy byly prováděny na koloně Supelcosil ABZ+Plus (250 × 4,6 mm, 5 μm) s mobilní fází kyselina mravenčí a acetonitril (90:10, v/v) isokraticky při průtoku 1 ml/min. Samotné měření proběhlo následujícím způsobem: roztok 2,0 mM peroxynitritu (8 μl) v 0,05 M NaOH byl nabrán a smíchán v injektoru HPLC s 1,0 mM roztokem tyrosinu a vhodně naředěnou tinkturou či standardem v 0,11 M fosfátovém pufru (42 μl). Reakční směs byla injektována přímo na kolonu HPLC, chromatogramy byly detekovány při 276 nm. Inhibice nitrace tyrosinu byla vypočítána relativně ke zjištěné ploše píku 3–nitrotyrosinu v kontrolním měření.

Redukce DPPH

Odpovídající množství tinktury nebo standardu bylo doplněno do 2,0 ml 0,1 mM DPPH v methanolu a po 5 minutách byla změřena absorbance při 517 nm. Redukce DPPH byla vypočítána relativně k hodnotě absorbance v kontrolním měření.

Výsledky experimentu byly zpracovány statisticky s použitím Studentova testu (p < 0,05).

Výsledky a diskuze

Stanovení celkového obsahu fenolických látek ukázalo, že tinktura z nati srdečníku obsahuje výrazně více těchto sloučenin nežli tinktura z hlohových plodů – 227 mg/100 ml oproti 139 mg /100 ml (tab. 1). HPLC analýza prokázala, že ze zkoumaných látek převažuje v tinktuře z nati srdečníku rutin (54,91 μg/ml) a v tinktuře z hlohových plodů hyperozid (29,32 μg/ml) a epikatechin (44,92 μg/ml).

Obě zkoumané tinktury byly schopné zhášet radikály a reaktivní formy kyslíku a dusíku. Účinnější byla tinktura z nati srdečníku, avšak rozdíl nebyl tak výrazný jako v případě fenolických sloučenin. Celkový obsah polyfenolů byl v tinktuře z nati srdečníku o 163 % větší, přesto antiperoxynitritová aktivita byla vyšší jen o 19 % (p < 0,05), a schopnost redukce DPPH se u obou tinktur lišila minimálně (54,8 % u tinktury z nati srdečníku a 51,7 % u tinktury z hlohových plodů) (obr. 1). V četných literárních zdrojích se uvádí, že se na antioxidační aktivitě rostlinných přípravků významným způsobem podílejí fenolické sloučeniny ^{3, 27, 28)}. Vyskytují se však i práce, kde se přímý vliv fenolických sloučenin u některých rostlin nepotvrdil ²⁹⁾. V naší předchozí práci ³⁰⁾ se rovněž zjistilo, že přesto, že množství fenolických sloučenin bylo v tinktuře z jinanu dvoulaločného statisticky významně vyšší, antioxidační aktivita této tinktury byla slabší než tinktur připravených ze zázvorových oddenků či nati třapatky nachové. Lze předpokládat, že i v případě zkoumaných tinktur, zejména tinktury z hlohových plodů, budou antioxidační aktivitu ovlivňovat další účinné látky,nebo že aktivita některých fenolických sloučenin, zjištěných v tinktuře z nati srdečníku,bude prakticky bezvýznamná.

V dalších experimentech bylo naší snahou zjistit, jak se na antioxidační aktivitě podílejí vybrané flavonoidy přítomné ve zkoumaných tinkturách. Výsledky ilustruje obrázek 2. Celkově největší podíl měly látky přítomné v tinkturách ve vyšších koncentracích. V tinktuře z hlohových plodů to byly epikatechin a hyperozid (obr. 2A).Další látky se podílely na antioxidační aktivitě tinktury menší mírou, což odpovídá jejich relativně nízkým koncentracím. Zajímavá však je poměrně výrazná antiperoxynitritová aktivita procyanidinu B2 – byla větší než u rutinu a kvercetinu přítomných v tinktuře ve vyšších koncentracích. Ve vztahu k epikatechinu a hyperozidu byla rovněž, vzhledem ke koncentraci,antiperoxynitritová aktivita vyšší – koncentrace epikatechinu byla v tinktuře 63× a hyperozidu 42× vyšší, kdežto aktivita byla vyšší jen 20 resp. 6,5×. Zjištění, že procyanidin vykazuje větší aktivitu než vybrané flavonoidy,souhlasí s výsledky naší předchozí práce ²⁴⁾ a poznatky některých dalších autorů ³¹⁾.

V tinktuře z nati srdečníku celkovou antioxidační aktivitu nejvíce ovlivňoval rutin, jehož koncentrace v tinktuře byla rovněž nejvyšší (obr. 2B). Přesto tento vliv nebyl přímo úměrný koncentraci. Koncentrace rutinu byla oproti kvercetinu osminásobná, kdežto antioxidační aktivita jen trojnásobná. Nižší účinnost rutinu byla rovněž prokázána v tinktuře z hlohových plodů, kde při vyšší koncentraci rutinu (2,64 μg/ml oproti 1,26 μg/ml) byla procentuálně vyjádřená antioxidační aktivita kvercetinu větší.

Závěr

V literatuře se vyskytují četné odkazy na pozitivní účinek fenolických sloučenin a vybraných flavonoidů na různé systémy organismu ^{32, 33)}. Tyto látky jsou důležité v léčbě a prevenci různých onemocnění včetně kardiovaskulárních. Výsledky naší práce prokázaly, že tinktury z hlohových plodů a nati srdečníku, stejně jako v nich přítomné účinné látky,mají výraznou antioxidační aktivitu, proto užívání těchto tinktur může být prospěšné nejen z hlediska podpůrné léčby kardiovaskulárních onemocnění,ale i ke zmírnění negativních účinků oxidačního stresu.

Došlo: 6. listopadu 2007

Přijato: 26. listopadu 2007

Adresa pro korespondenci:

doc. PharmDr. Ruta Masteiková, CSc.

Ústav technologie léků FaF VFU

Palackého 1/3, 612 42 Brno

e-mail: masteikovar@vfu.cz